rst Transcriptional Activity Influences kirre mRNA Concentration in the Drosophila Pupal Retina during the Final Steps of Ommatidial Patterning

Background: Drosophila retinal architecture is laid down between 24-48 hours after puparium formation, when some of the still uncommitted interommatidial cells (IOCs) are recruited to become secondary and tertiary pigment cells while the remaining ones undergo apoptosis. This choice between survival and death requires the product of the roughest (rst) gene, an immunoglobulin superfamily transmembrane glycoprotein involved in a wide range of developmental processes. Both temporal misexpression of Rst and truncation of the protein intracytoplasmic domain, lead to severe defects in which IOCs either remain mostly undifferentiated and die late and erratically or, instead, differentiate into extra pigment cells. Intriguingly, mutants not expressing wild type protein often have normal or very mild rough eyes. Methodology/Principal Findings: By using quantitative real time PCR to examine rst transcriptional dynamics in the pupal retina, both in wild type and mutant alleles we showed that tightly regulated temporal changes in rst transcriptional rate underlie its proper function during the final steps of eye patterning. Furthermore we demonstrated that the unexpected wild type eye phenotype of mutants with low or no rst expression correlates with an upregulation in the mRNA levels of the rst paralogue kin-of-irre (kirre), which seems able to substitute for rst function in this process, similarly to their role in myoblast fusion. This compensatory upregulation of kirre mRNA levels could be directly induced in wild type pupa upon RNAi-mediated silencing of rst, indicating that expression of both genes is also coordinately regulated in physiological conditions. Conclusions/Significance: These findings suggest a general mechanism by which rst and kirre expression could be fine tuned to optimize their redundant roles during development and provide a clearer picture of how the specification of survival and apoptotic fates by differential cell adhesion during the final steps of retinal morphogenesis in insects are controlled at the transcriptional level.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

Bradykinin receptor 1 activation exacerbates experimental focal and segmental glomerulosclerosis

Focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) is one of the most important causes of end-stage renal failure. The bradykinin B1 receptor has been associated with tissue inflammation and renal fibrosis. To test for a role of the bradykinin B1 receptor in podocyte injury, we pharmacologically modulated its activity at different time points in an adriamycin-induced mouse model of FSGS. Estimated albuminuria and urinary protein to creatinine ratios correlated with podocytopathy. Adriamycin injection led to loss of body weight, proteinuria, and upregulation of B1 receptor mRNA. Early treatment with a B1 antagonist reduced albuminuria and glomerulosclerosis, and inhibited the adriamycin-induced downregulation of podocin, nephrin, and alpha-actinin-4 expression. Moreover, delayed treatment with antagonist also induced podocyte protection. Conversely, a B1 agonist aggravated renal dysfunction and even further suppressed the levels of podocyte-related molecules. Thus, we propose that kinin has a crucial role in the pathogenesis of FSGS operating through bradykinin B1 receptor signaling. Kidney International (2011) 79, 1217-1227; doi:10.1038/ki.2011.14; published online 16 March 2011

Involvement of Renal Corpuscle microRNA Expression on Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Maternal Low Protein Diet in Adult Programmed Rats

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed ‘pore cells’, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 μm in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.