Le VEGF induit la synthèse du PAF par l’entremise de l’activation du VEGFR-2 : identification des phosphotyrosines impliquées

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF.

Étude moléculaire des mécanismes d’action de potentiateurs du canal CFTR sur le canal KCa3.1

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces.

Détection, caractérisation et visualisation des structures transitoires de protéines par sondage au tryptophane

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Importance de l'hélice a[alpha]4 et des boucles inter-hélicales du domaine I dans le mécanisme de formation de pores par la toxine Cry1Aa du bacille de Thuringe

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Importance de la phosphorylation de la ligase Itch dans la reconnaissance et l'ubiquitylation des protéines à domaine SH3

Itch est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans la reconnaissance et la dégradation des protéines par le protéasome. Itch contient trois sites phosphorylés par JNK et il a été démontré que la phosphorylation de ces résidus est nécessaire pour que Itch puisse reconnaître et ubiquityler les protéines c-Jun et JunB. Ces sites de phosphorylation se retrouvent dans le domaine PRD responsable des interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3. Si la phosphorylation de Itch par JNK est importante pour réguler son activité avec c-Jun et JunB, on connaît peu de choses sur les interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3 ainsi que l’implication de la phosphorylation dans leur régulation. Nous avons donc créé des mutants de Itch par mutagenèse dirigée où les sites de phosphorylation étaient remplacés par des alanines (mutant non phosphorylable) et où l’un des trois sites était remplacé par un acide aspartique (mutant constitutivement phosphorylé). Ces mutants sont utilisés dans des tests d’interaction et d’ubiquitylation, dans le but de déterminer l’impact de la phosphorylation de Itch dans la reconnaissance et l’ubiquitylation des protéines SH3. Nos résultats montrent que, contrairement au modèle proposé, la phosphorylation de Itch n’est pas essentielle à l’interaction de Itch avec l’endophiline, mais la phosphorylation de Itch module l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de l’endophiline. La régulation de l’interaction de Itch avec ses substrats est donc différente selon le substrat.

Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

The Role of Specific Amino Acids in the Formation of Ternary Complexes in Nitrogenase Regulation in the Photosynthetic Bacterium Rhodobacter capsulatus

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +.

Caractérisation pharmacologique et moléculaire des dyskinésies tardives chez un modèle de primate non humain

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique.

Rôle des boucles interhélicales du domaine I dans la formation de pores transmembranaires par la toxine insecticide Cry1Aa du bacille de Thuringe

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation moléculaire de la région responsable de l'affinité et de la perméabilité du canal calcique ECaC1 (TRPV5)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle des boucles interhélicales du domaine I dans la formation de pores transmembranaires par la toxine insecticide Cry1Aa du bacille de Thuringe

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation moléculaire de la région responsable de l'affinité et de la perméabilité du canal calcique ECaC1 (TRPV5)

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mutagenèse semi-aléatoire et analyse dynamique de la [bêta]-lactamase TEM-1 de Escherichia coli

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mutagenèse semi-aléatoire et analyse dynamique de la [bêta]-lactamase TEM-1 de Escherichia coli

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Revue d'anthropologie catholique : étude de l'homme, psychologie-physiologique, alliance de la philosophie, de la physiologie et de la théologie, harmonies de l'ordre naturel et de l'ordre surnaturel / dirigée par un prêtre et un docteur en médecine

1847 (T1).