In vitro propagation of Glandularia peruviana (L.) Small, an ornamental native plant from South America

The flower market is characterized by being both eager for novelties and highly competitive. The exploration of native species with ornamental potential represents a remarkable area of research, since it entails the introduction and development of novel promising ornamental crops. The genus Glandularia, widely distributed in Argentina, holds an enormous ornamental potential, due to the variety of colors of its inflorescences (red, violet, white, rose and lily), and extended flowering period. There is little information on tissue culture of Glandularia, thus highlighting the relevance of this research. In this work, the conditions for in vitro multiplication of G. peruviana were optimized. It was concluded that WPM supplemented with TDZ, in concentrations ranging from 1.1 to 9.0 μM, was the most adequate treatment, rendering a multiplication rate of approximately 10 de novo shoots per explant. This paper presents a protocol for the in vitro propagation of this species and introduces interesting prospects in the application of biotechnological tools to breed Glandularia.

Micropropagación in vitro del clon de banano (Musa sp.) enano ecuatoriano (AAA)

Se establecieron in vitro yemas apicales de banano (Musa sp.) para su micro propagación durante tres sub-cultivos en un medio nutritivo artificial conteniendo sales minerales (MS), tiamina HCI, sacarosa y mio-inositol; variando con fines de estudio, la consistencia física del medio de cultivo (líquido y semi-sólido) y las concentraciones de reguladores de crecimiento: AIA= O y 1 mg/1 y 6-BAP= 5, 7 y 10 mg/1. Durante el establecimiento y multiplicación de los ex plantes se utilizó un cuarto de crecimiento para la incubación con temperaturas de 25 ± 1 ºc e intensidad lumínica de 2 000 lux. Inicialmente se establecieron in vitro 240 yemas apicales para su adaptación, de las cuales un 85 % (204) se adaptaron satisfactoriamente, el 15 % restante fueron descartados por contaminación, fenolización de las paredes del cormo o muerte de los ex plantes por no adaptación. La mayor contaminación se produjo por hongos y en menor medida por bacterias. La proliferación de hijos fue mayor en los medios de cultivo de consistencia semi-sólido en los tres sub-cultivos, correspondiendo los mejores resultados a la variante semi-sólida de los medios MS + 1mg/1 AIA+ 10 mg/16-BAP con promedio de 3.7 hijos por ex plante y 11 hijos en total, seguido por el medio MS_ + O mg/ AIA + 7 mg/1 6-BAP con 3.6 hijos por ex plante y 10.8 en total al final de los tres sub-cultivos. La menor proliferación se presentó en la variante líquida del medio MS + 1 mg/1 AIA + 10 mg/16-BAP con un promedio de 2.1 hijos por explante y 6.3 hijos en total. No se observó tendencia alguna en la proliferación de hijos con el aumento de los sub-cultivos, siendo evidente la influencia de la consistencia del medio de cultivo y la variación en los niveles de reguladores de crecimiento. El nivel más alto de 6-BAP (10 mg/1) utilizado indujo a la formación de multiyemas en los medios de cultivos líquidos, presentándose éstas a partir del II sub­ cultivo. Los medios de consistencia líquida favorecieron el crecimiento in vitro de los explantes, expresándose en un incremento en la altura y peso. Así mismo los medios líquidos indujeron a un desarrollo y crecimiento de raíces en todos los tratamientos estudiados.

Estudio preliminar del cultivo in vitro de ápices caulinares de quequisque (Xanthosoma sagittifolium L. Shott)

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Programa Recursos Genéticos Nicaraguenses (REGEN-UNA). En los ensayos realizados fueron estudiados 9 Concentraciones de hipoclorito de sodio en la desinfectación de los explantes de quequisque y se determinó que concentraciones entre 55% y 70% v/v, fueron las más adecuadas. Sin embargo, al estudiar el efecto del BAP, ANA y el efecto del Hipoclorito de Sodio sobre la tasa de crecimiento del tallo, se observó que las altas concentraciones de cloro utilizados en el proceso de desinfección del explante y la utilización de ANA en el medio nutritivo de establecimiento reducen la tasa de crecimiento. Por otra parte se observó que las concentraciones de BAP utilizadas no tuvieron ningún efecto sobre la tasa de crecimiento. En el estudio del efecto de 4 concentraciones de sacarosa (23 g, 30 g, 37 g y 44 g) las plantas mostraron una tasa de crecimiento similar. En la tasa de multiplicación acelerada, donde se estudió el efecto de la consistencia del medio sobre el ahijamiento no se observó diferencias y en la tasa de enraizamiento donde se evaluaron 3 niveles de AIA (0.0 mg/l y 0.1 mg/l). También no se encontró diferencia en cuanto a la formacion de raíces. El comportamiento de las Vitroplantas de quequisque en condiciones de vivero reflejo resultados satisfactorios las cuales mostraron una buena capacidad de adaptación siguiendo un normal crecimiento y desarrollo.

Mejoramiento de la eficiencia de propagación in vitro de plátano (Musa AAB cv. Enano)

En el período comprendido de noviembre del año 2001 a julio del año 2002, en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Universidad Nacional Agraria (UNA) se realizó el estudio de la propagación in vitro en el cultivo de Plátano, (AAB) cv Enano. A las cuatro semanas del establecimiento se evalúo el porcentaje de fenolización de los ápices, en el medio de cultivo que contenía solamente las sales Murashige y Skoog el 100% de los tejidos produjo el más bajo nivel de fenoles. A las ocho semanas se evalúo el efecto de las variantes de medios de cultivo en la formación de plantas. Cuando se agregó al medio de cultivo 0.3 mg/l de Ácido indolacético y 1 mg/l de Bencil amino purina se registró 53.3% de plantas formadas y el 26% de estas emitieron brotes axilares. En la fase de multiplicación los experimentos se evaluaron a las tres semanas determinándose los mejores tratamientos a través del análisis de Varianza y separación de Medias de Tukey (a= 0.05). Los mejores coeficientes de brotación se presentaron en los medios suplidos con 4 y 5 mg/l de Bencil amino purina, con valores respectivos de 4.2 y 4.46 brotes por planta. La consistencia semisólida del medio de cultivo superó al medio líquido en las variables altura de planta y número de brotes. La mejor combinación tipo de frasco y número de planta, fue con la siembra de cinco brotes en frascos de 200 ml con resultados de brotación de 2.08 y 2.05 respectivamente. En el enraizamiento se comprobó que concentraciones de sacarosa entre 30 g/l y 60 g/l combinadas con 1 y 2 mg/l de Ácido Indol Acético favorecen el incremento de las variables evaluadas. La sobrevivencia de las vitroplantas en condiciones ambientales fue del 100% cuando estas provinieron de medios de cultivos con niveles de sacarosa de 50 y 60 g/l combinadas con 1 y 2 mg/l de Ácido Indol Acético.

Organogénesis directa y embriogénesis indirecta en el cultivo in vitro de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L) Schott), cultivar blanco

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar la metodología de micropropagación para la organogénesis directa y embriogénesis indirecta a partir de dos fuentes de explantes (terminales y axilares) en el cultivar de quequisque Blanco (Xhanthosoma sagittifolium L. Schott). En el proceso de organogénesis directa se estudio la fase de establecimiento, multiplicación, enraizamiento y aclimatización, utilizando las diferentes variantes del medio cultivo básico Murashige y Skoog (MS 1962), también se estudió el efecto del número de explantes por frasco y la técnica de inmersión temporal. En los diferentes ensayos se establecieron un esquema de diseño BCA, y para el análisis de los datos de las variables paramétricas eval uadas se realizó un ANDEVA, y en las no paramétricas el análisis de χ2. En la fase de establecimiento utilizando yemas terminales. La formación de plantas se dió en el medio 0.0 y 1 mg/l de AIA con 1 y 2 mg/l de BAP, utilizando yemas axilares la mejor fue con 0.50 y 1mg/l de AIA con 1y 2 mg/l de BAP. En la fase de multiplicación, con plantas formadas de yemas terminales, en el primer subcultivo, la mayor brotación se presentó en los medios que contenía con 3 mg/l de BAP sin AIA, mientras en el segundo con 0.25 mg/l de AIA con 3 de BAP y en el tercer subcultivo se dio con 2 mg/l de BAP y 0.25 de AIA, utilizando yemas axilares, en el primero y tercer subcultivos se dio con 3 mg/l de BAP sin AIA, y en el segundo subcultivo la mayor brotación se dio 3 mg/l de BAP, con 0.5 de AIA. En la fase de enraizamiento, utilizando yemas terminales, el mayor porcentaje de emisión de raíces se presentó en el medio sólido con sales al 50% y utilizando yemas axilares fue mayor en el medio sólido al 100% de sales mas 1mg/l de AIA. . En la fase de aclimatizacion con yemas terminales la sobrevivencia fue del 100% en los medios sólidos con sales al 50 y 100% y en el liquido con 100% de sales más 1mg/l de AIA y con yemas axilares la sobrevivencia fue del 100%, tanto en el medio liquido con 100% de sales más 1mg/l de AIA como en el medio sólido con sales al 100%. En el número de explantes por frasco utilizando yemas terminales la mayor brotación se presentó con 4 explantes por frasco y con yemas axilares fue con 5 explantes. En el sistema RITA (Recipiente de inmersión temporal automatizado) utilizando las dos fuentes de tejidos el mayor promedio de brotación se obtuvo utilizando 2 inmersiones por día durante 7 minutos. En embriogénesis indirecta la relación mayor porcentaje de formación de callos y menor formación de plantas fue en el medio constituido por las sales MS al 100% con 2 y 3 mg/l de 2,4-D. En la fase de multiplicación de callos, el porcentaje de crecimiento se dio con 5% de agua de coco y 0.4 mg/l de kinetina. El mayor porcentaje de embriones globulares formados fue en el medio con 20 y 30 mg/l de AIA. El mayor promedio de embriones globulares maduros se produjo en el medio que no se le agregó 0.1 mg/l de AIA y BAP. La germinación de embriones globulares fue mayor en el medio sin BAP y sacarosa al 3%. En el enraizamiento y la aclimatización de plantas los resultados obtenidos fueron muy similares a los de organogénesis directa, con sobrevivencia del 95% y no se observo la presencia de plantas con variación genética.

Efecto de reguladores de crecimiento, L-Cisteína y ácido ascórbico en el cultivo in vitro de mora de castilla (Rubus glaucus benth)

El presente estudio tuvo como objetivo central contribuir al desarrollo de tecnología para la propagación in vitro de mora de castilla (Rubus glaucus Benth). Para ello se adaptó las técnicas de propagación in vitro desarrolladas por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia y se introdujo la variedad Rizaralda, cultivar de alto rendimiento y calidad, utilizada por productores de mora de castilla en la zona andina colombiana. Los ensayos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Programa Recursos Genéticos Nicaragüenses (REGEN), Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional Agraria. El material experimental provino de vitro plantas de mora de castilla, facilitadas por la Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia. El estudio se desarrolló en dos fases. En la primera se ejecutaron evaluaciones sobre tres componentes del medio de cultivo de multiplicación acelerada. Para ello se realizaron tres ensayos experimentales: efecto del regulador de crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) en combinación de ácido giberélico (GA3), efecto del ácido ascórbico y efecto de la L-cisteína sobre vitroplantas de mora de castilla. En la segunda fase se indujo el enraizamiento de vitroplantas obtenidas en la fase I. En las evaluaciones realizadas en esta fase se establecieron de igual forma tres ensayos: inducción de raíces con el regulador de crecimiento ácido indolacético (AIA), efecto del AIA y consistencia del medio de cultivo sobre la formación de raíces y efecto del AIA, ácido indolbutírico (IBA) y ácido naftalenacético (ANA) en la formación de raíces.Utilizando para ambas fases las sales minerales de Murashige y Skoog (1962), suplementadas con tiamina 0.4 mg/l, mio-inositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, Gelrite 3 g/l y ajustando el pH a 6. Los explantes se incubaron bajo condiciones de 18 °C, 16 horas luz y 4000 lux. Según los resultados se estableció que el mejor tratamiento para la multiplicación acelerada de vitroplanta de mora de castilla fue 6-bencilaminopurina con 2.5 mg/l + 0.03 mg/l GA3, obteniéndose una mayor producción de hijos, con un promedio de 3.13. En cuanto a la L-cisteína y ácido ascórbico no se establecieron influencia significativa entre tratamientos. En la segunda fase se estableció que el mejor tratamiento con 100 % de plantas enraizadas y 6.98 raíces por planta fue 1 mg/l de IBA, contrario al AIA que produjo menos del 50 % de plantas enraizadas. Por otra parte la consistencia del medio de cultivo no tuvo ninguna influencia en la producción de raíces.

Embriogenesis somatica en reproduccion in vitro del cultivo de piña (Ananas comosus L. Merr) cultivar MD-2

La piña es reconocida como una de las frutas más finas de las re giones tropicales y se denomina la reina de todas las frutas. En Nicaragua se consume principalmente como frut a fresca, refresco y otros productos derivados de la industrialización de la piña. Para el estudio de embriogénesis somática en piña cultivar MD - 2 se realizaron diferentes variantes de medios de cultivo en las fases de inducción, multiplicación, formación de plantas , enraizamiento y aclimatación de plantas. En la fase de inducción de callo s con el empleo de explante s de hojas no se produjo iniciación de callos, pero con explantes de ápices meristemáticos se obtuvieron los mejores resultados en los medios qu e contenían 1 mg/l de 2,4 - D y 0 y 0.2 mg/l 6 - B encil - amino - purina . La multiplicación de callos fue mejor en los medios de cultivos que se le suministraron 2 mg/l de Ácido Indolacético y 1.8 mg/l de A cido - naftaleno - acético con agua de coco al 1 5% y 400 mg/ l de carbón activado . La formaci ón de pla n tas se favoreció en el medio de cultivo que contenía 0.38 mg/l de Ácido Indolbutírico y dos mg/l de 6 - Bencil - Amino - Purina. En l a fase de enraizamiento de las plantas resultó ser mejor el medio de cultivo que con tenía 0.5 mg/l de Ácido Indolacé tico y 40 g/l de sacarosa . En la fase de aclimat iz ación de plantas los medios que previamente se desarrollaron en las cinco variantes de medios en la fase de en raizamiento presentaron los mejores resultados con respecto al po rcen taje de sobrevivencia.

Reguladores de crecimiento, L-cisteina y ácido ascórbico en el cultivo in vitro de Mora (Rubus glaucus Benth)

El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Programa de Recursos Genéticos Nicaragüen ses (REGEN) de la Facultad de Agronomía, Universidad Nacional Agraria, Managua, Nicaragua, con el objetivo de adoptar la técnica de propagación in vitro del cultivo de mora e introducir la variedad Rizaralda. El material vegetal fue traído de la Universidad Nacional de Pereira, Colombia. Los explantes fueron desinfectados y estableci dos en un medio MS semisólido suplementado con 1 mg/l de BAP y 0.3 mg/l de GA 3 . El ensayo se desarrolló en dos fases. En la primera fase (fase de multiplicación) se evaluaron diferentes concentraciones de las fitohormonas BAP y GA 3 ; la vitamina acido ascórbico y el aminoácido (L–cisteina). La combinación hormonal BAP 2.5 mg/l y GA 3 0.03 mg/l fue el mejor tratamiento, lográndose una producción de hijos de 3.13 en promedio. En la segunda fase (enraizamiento) se evaluaron las fitohormonas AIA, IBA y ANA, asi como la consis tencia del medio; obteniéndose un 100 % de plantas enraizadas con un promedio de 6.98 raíces por planta con 1.4 mg/l de IBA en medio semisolido.

Propagación in vitro de Cymodocea nodosa para su utilización en la restauración de sebadales

[ES] Las técnicas de propagación in vitro son consideradas como una de las soluciones más plausibles al declive de las comunidades de fanerógamas que actualmente se registra en todo el mundo. En este trabajo, se establecieron cultivos de Cymodocea nodosa, a partir de explantos, que mediante multiplicación vegetativa o formación de callo previo emitieron hojas nuevas en medios que contenían la citoquinina TDZ. Otros reguladores afectaron a la extensión y la regeneración de la hoja. Los fragmentos, constituidos por hoja, rizoma y raíz, se comportaban como una unidad fisiológica, donde el carbono fijado por la hoja era rápidamente traslocado al resto del tejido. Estos explantos asimilaron preferentemente el amonio y el fosfato inorgánico, siendo indispensable la presencia de tejido sumergido para mantener los niveles de fósforo.

Conservación de plantas regeneradas in vitro y análisis de la variación somaclonal de Cinchona officinalis, Linneo

Cinchona officinalis (Rubiaceae), especie endémica del Valle de Loja, ubicado en la región sur del Ecuador, es un recurso forestal de importancia medicinal y ecológica, además la especie ha sido catalogada como planta nacional y es un ícono de la región sur por su aporte a la farmacopea mundial. Esta especie, entre los siglos XVII-XIX sufrió una gran presión en sus poblaciones debido a la extracción masiva de la corteza para la cura del paludismo. Aunque la actividad extractiva generó grandes ingresos a la Corona Española y a la región Sur del Ecuador, ésta fue poco o nada sustentable ecológicamente, provocando la desaparición de la especie en muchos sitios de la provincia, pues, en su momento, no se consideraron alternativas de recuperación de las poblaciones naturales. Actualmente la extracción y consumo de la corteza en la zona de origen es baja o nula, sin embargo esta zona enfrenta nuevas amenazas. La deforestación a causa de proyectos de desarrollo en infraestructuras, la práctica de actividades agrícolas y de ganadería, y los efectos del cambio climático han ocasionado, en estos últimos años, la fragmentación de los ecosistemas. La mayoría de los bosques del sur del Ecuador se han convertido en parches aislados (los bosques en los que se distribuye C. officinalis no son la excepción) siendo esta la principal causa para que la especie se encuentre en estado de amenaza. Los individuos de la especie tienen una alta capacidad de rebrote y producen semillas durante todo el año; sin embargo la capacidad germinativa y la tasa de sobrevivencia son bajas, además de estas dificultades la especie requiere de la asociación con otras especies vegetales para su desarrollo, lo cual ha limitado su distribución en pequeños parches aislados. Con esta problemática, la recuperación natural de las poblaciones es una necesidad evidente. Varios trabajos y esfuerzos previos se han realizado a nivel local: i. Identificación de la distribución actual y potencial; ii. Determinación de la fenología y fructificación iii. Programas de educación ambiental, iv. Análisis moleculares para determinar la diversidad genética. v. Ensayos de propagación vegetativa; y otras acciones de tipo cultural. No obstante, el estado de conservación y manejo de las poblaciones naturales no ha mejorado significativamente, siendo necesaria la aplicación de estrategias integradas de conservación in situ y ex situ, que permitan la recuperación y permanencia de las poblaciones naturales a largo plazo. El presente trabajo tiene como fin dar alternativas para el cultivo de tejidos in vitro de Cinchona officinalis centrados en la propagación masiva a partir de semillas, análisis de la fidelidad genética y alternativas de conservación de tejidos. Los objetivos específicos que se plantean son: i. Analizar el proceso de germinación y proliferación in vitro. ii. Evaluar la estabilidad genética en explantes cultivados in vitro, mediante marcadores ISSR. iii. Establecer protocolos de conservación in vitro mediante limitación del crecimiento y criopreservación de segmentos nodales y yemas. Los resultados más significativos de esta investigación fueron: i. El desarrollo de protocolos eficientes para mejorar los porcentajes de germinación y la proliferación de brotes en explantos cultivados in vitro. Para evaluar el efecto de los fenoles sobre la germinación, se determinó el contenido total de fenoles y el porcentaje de germinación en semillas de C. officinalis comparados con una especie de control, C. pubescens. Para inducir a proliferación, se utilizaron segmentos nodales de plántulas germinadas in vitro en medio Gamborg (1968) suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas). Los resultados obtenidos sugieren que el contenido de compuestos fenólicos es alto en las semillas de C. officinalis en comparación con las semillas de C. pubescens. Estos fenoles pueden eliminarse con peróxido de hidrógeno o con lavados de agua para estimular la germinación. La formación de nuevos brotes y callos en la mayoría de las combinaciones de reguladores de crecimiento se observó en un período de 45 días. El mayor porcentaje de proliferación de brotes, formación de callos y presencia de brotes adventicios se obtuvo en medio Gamborg (B5) suplementado con 5.0 mg/l 6-bencil-aminopurina y 3.0 mg/l de ácido indol-3-butírico. ii. La evaluación de la fidelidad genética de los explantes obtenidos con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y diversos subcultivos. Se realizó el seguimiento a los explantes obtenidos de la fase anterior, determinando el índice de multiplicación y analizando la fidelidad genética de los tejidos obtenidos por las dos vías regenerativas: brotación directa y regeneración de brotes a partir de callos. Este análisis se realizó por amplificación mediante PCR de las secuencias ubicadas entre microsatélites-ISSR (Inter simple sequence repeat). El medio Gamborg (B5) con 3.0 mg/l de AIB y 5.0 mg/l de BAP usado como medio de inducción en la primera etapa de cultivo generó el mayor índice de proliferación (11.5). Un total de 13 marcadores ISSR fueron analizados, 6 de éstos fueron polimórficos. El mayor porcentaje de variación somaclonal fue inducido en presencia de 1.0 mg/l 2,4-D combinado con 0.2 mg/l Kin con un 1.8% en el segundo sub-cultivo de regeneración, la cual incrementó a 3.6% en el tercer sub-cultivo. Todas las combinaciones con presencia de 2,4-D produjeron la formación de callos y presentaron variación genética. Por su parte la fidelidad genética se mantuvo en los sistemas de propagación directa a través de la formación de brotes a partir de meristemos preformados. iii. El establecimiento de protocolos de conservación in vitro y crioconservación de segmentos nodales y yemas. Para la conservación limitando el crecimiento, se cultivaron segmentos nodales en los medios MS y B5 en tres concentraciones de sus componentes (25, 50 y 100%); y en medio B5 más agentes osmóticos como el manitol, sorbitol y sacarosa en diferentes concentraciones (2, 4 y 8%); los cultivos se mantuvieron por 12 meses sin subcultivos. Para el establecimiento de protocolos para la crioconservación (paralización del metabolismo) se usaron yemas axilares y apicales a las cuales se les aplicaron los métodos de encapsulación-deshidratación y vitrificación. La efectividad de los protocolos usados se determinó en función de la sobrevivencia, reducción del crecimiento y regeneración. Los resultados obtenidos en este apartado reflejan que un crecimiento limitado puede mantener tejidos durante 12 meses de almacenamiento, usando medio B5 más manitol entre 2 y 8%. En los protocolos de crioconservación, se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación tras la congelación en NL en el tratamiento control seguido por el método crioprotector de encapsulación-deshidratación. Este trabajo brinda alternativas para la propagación de C. officinalis bajo condiciones in vitro, partiendo de material vegetal con alta diversidad genética. El material propagado puede ser fuente de germoplasma para la recuperación y reforzamiento de las poblaciones naturales así como una alternativa de producción para las comunidades locales debido a la demanda actual de corteza de la zona de origen para la elaboración de agua tónica. ABSTRACT Cinchona officinalis (Rubiaceae) is endemic to the Loja Valley, located in the southern area of Ecuador. The importance of this plant as medical and ecological resource is so great that it has been designated as the national flower and is an icon of the southern region for its contribution to the world pharmacopoeia. Between XVII-XIX centuries its population suffered great reduction due to massive harvesting of the bark to cure malaria. Although extraction activity generated large revenues to the Spanish Crown and the southern region of Ecuador, this was not ecologically sustainable, causing the disappearance of the species in many areas of the province, because during that time alternatives to prevent extinction and recover natural populations were not taken in account. Currently the extraction and consumption of bark in the area of origin is almost absent, but this species faces new threats. Deforestation due to infrastructure development, the practice of farming and ranching, and the effects of climate change had led to the fragmentation of ecosystems during the recent years. Most of the forests of southern Ecuador have become isolated patches, including those where C. officinalis is diffused. The lack of suitable habitat is today the main threat for the species. The species has a high capacity for regeneration and produces seeds throughout the year, but the germination rate is low and the growth is slow. In addition, the species requires the association with other plant species to develop. All these factors had limited its distribution to small isolated patches. The natural recovery of populations is essential to face this problem. Several studies and previous efforts had been made at local level: i. Identification of current and potential distribution; ii. Phenology determination. iii. Environmental education programs, iv. Molecular analisis to determine the genetic diversity. v. Testing of vegetative propagation; and other actions of cultural nature. Despite these efforts, the state of conservation and management of natural populations has not improved significantly. Implementation of integrated in situ and ex situ conservation strategies for the recovery and permanence of long-term natural populations is still needed. This work aims to provide alternatives for in vitro culture of tissue of Cinchona officinalis focused on mass propagation from seeds, genetic fidelity analysis and tissue conservation alternatives. The specific aims are: i. Analyze the process of germination and proliferation in vitro. ii. To evaluate the genetic stability of the explants cultured in vitro by ISSR markers. iii. Establish protocols for in vitro conservation by limiting growth and cryopreservation of nodal segments and buds. The most significant results of this research were: i. The development of efficient protocols to improve germination rates and proliferation of buds in explants cultured in vitro. To study the effect of phenols on germination, the total phenolic content and percentage germination was measured in C. officinalis and in a control species, C. pubescens, for comparison. The content of phenolic compounds in C. officinalis seeds is higher than in C. pubescens. These phenols can be removed with hydrogen peroxide or water washes to stimulate germination. To analyze the regeneration, we used nodal explants from seedlings germinated in vitro on Gamborg medium (1968) supplemented with different combinations of growth regulators (auxins and cytokinins) to induce proliferation. The formation of new shoots and calluses was observed within a period of 45 days in most combinations of growth regulators. The highest percentage of shoot proliferation, callus formation and adventitious buds were obtained in B5 medium supplemented with 5.0 mg/l 6-benzyl-aminopurine and 3.0 mg/l indole-3-butyric acid. ii. Evaluating genetic fidelity explants obtained with various combinations of plant growth regulators and different subcultures. The genetic fidelity was analyzed in tissues obtained by the two regenerative pathways: direct sprouting and shoot regeneration from callus. This analysis was performed by PCR amplification of the sequences located between microsatellite-ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Among a total of 13 ISSR markers analyzed, 6 were polymorphic. The highest percentage of somaclonal variation was induced in the presence of 1.0 mg/l 2,4-D combined with 0.2 mg/l Kin with 1.8% in the second round of regeneration, and increased to 3.6% in the third round. The presence of 2,4-D induced genetic variation in all the combinations of growth regulators. Meanwhile genetic fidelity remained systems propagation through direct shoot formation from meristems preformed. iii. Establishing conservation protocols in vitro and cryoconservation of nodal segments and buds. For medium-term conservation (limited growth) nodal segments were cultured in MS and B5 media at three concentrations (25, 50 and 100%); we tested B5 medium with different concentrations of osmotic agents such as mannitol, sorbitol and sucrose (2, 4 and 8%); cultures were maintained for 12 months with regular subculturing. To establish protocols for cryoconservation (cessation of metabolism) different methods of encapsulation-dehydration and vitrification were applied to axillary and apical buds. The effectiveness of the used protocols is determined based on the survival, growth and regeneration success. The results show that these tissues can be maintained in storage for 12 months, using B5 medium plus mannitol between 2 and 8%. The cryoconservation protocol with highest percentage of recovery was obtained by contral treatment, followed by freezing in NL with encapsulation-dehydration method. This work provides alternatives for the propagation in vitro of C. officinalis, starting from plant material with high genetic diversity. The obtained material represents a source of germplasm to support the recovery and strengthening of natural populations as well as a creation of alternative sources for local communities due to the current demand of bark for the preparation of tonic water.

Análisis del potencial epizoótico de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis aisladas de diversos hospedadores empleando modelos de infección in vitro

299 p.