Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Étude de l'association du réticulum endoplasmique lisse marqué par le récepteur du facteur autocrine de motilité avec les mitochondries

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Inhibition cellulaire de la proprotéine convertase 1 et activité des proprotéines convertases dans le réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des GTPases potentiellement responsables de la fusion du réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du réticulum endoplasmique lors de la phagocytose et l'implication de son recrutement sur les fonctions du phagosome

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de l'association du réticulum endoplasmique lisse marqué par le récepteur du facteur autocrine de motilité avec les mitochondries

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Inhibition cellulaire de la proprotéine convertase 1 et activité des proprotéines convertases dans le réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude des GTPases potentiellement responsables de la fusion du réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du réticulum endoplasmique lors de la phagocytose et l'implication de son recrutement sur les fonctions du phagosome

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôle du dimère Gbetagamma dans l’organisation des systèmes de signalisation cellulaire

Selon le modèle classique, le signal reçu par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) se propage suite à des interactions transitoires et aléatoires entre les RCPGs, les protéines G et leurs effecteurs. Par les techniques de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), de complémentation bimoléculaire de protéines fluorescentes (BiFC) et de co-immunoprécipitation, nous avons observé que les récepteurs, les protéines G et les effecteurs forment un complexe stable, avant et après l’activation des récepteurs. L’interaction entre l’effecteur Kir3 et le dimère Gbetagamma se produit initialement au réticulum endoplasmique et est sensible à un agoniste liposoluble des récepteurs beta2-adrénergiques. Bien que peu de spécificité pour les nombreux isoformes des sous-unités Gbetagamma ait été observée pour l’activation du canal Kir3, les interactions précoces au RE sont plus sensibles aux différentes combinaisons de Gbetagamma présentes. En plus de son rôle dans la régulation des effecteurs, le dimère Gbetagamma peut interagir avec de nombreuses protéines possédant des localisations cellulaires autres que la membrane plasmique. Nous avons identifié une nouvelle classe de protéines interagissant avec la sous-unité Gbeta, autant en système de surexpression que dans des extraits de cerveaux de rats, soit les protéines FosB et cFos, qui forment le complexe de transcription AP-1, suite à leur dimérisation avec les protéines de la famille des Jun. La coexpression du dimère Gbetagamma réduit l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1 induit par le phorbol 12-,myristate 13-acetate (PMA), sans toutefois interférer avec la formation du complexe Fos/Jun ou son interaction avec l’ADN. Toutefois, le dimère Gbetagamma colocalise au noyau avec le complexe AP-1 et recrute les protéines histones déacétylases (HDAC) afin d’inhiber l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1.

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

Mécanismes contributifs au développement de la stéatose hépatique non alcoolique (SHNA) : effets de l'entraînement

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Impact de l’expression de l’isoforme p35 de la chaîne invariante humaine chez des souris déficientes en CD74 endogène

La chaîne invariante (Ii ; CD74) est une protéine membranaire de type II qui joue un rôle majeur dans la présentation antigénique. Dans le réticulum endoplasmique (RE), Ii favorise l’assemblage du CMH II et prévient la liaison indésirable de polypeptides. Grâce à son motif di-leucine, la chaîne invariante cible le CMH II dans les endosomes. Une fois dans ces compartiments acides, Ii est dégradé, permettant la liaison de peptides de forte affinité qui seront ensuite présentés aux cellules T CD4+. Chez les souris déficientes en Ii murin (mIi), le CMH II présente une conformation non compacte typique des molécules vides ou liées faiblement à un peptide. Le transport du CMH II est aberrant ce qui conduit à une réduction de son expression en surface ainsi qu’à un défaut de présentation antigénique. De plus, Ii diversifie le répertoire de peptides et assure la sélection thymique des cellules T CD4+. Enfin, il a un rôle dans la maturation des cellules B et les souris déficientes en Ii présentent des nombres réduits de cellules B matures folliculaires (FO). L’isoforme mineure humaine p35 (Iip35) n’existe pas chez la souris et possède une extension cytoplasmique de 16 acides aminés contenant un motif R-x-R de rétention dans le RE. La sortie du RE est conditionnelle à la liaison du CMH II qui permet de masquer le motif de rétention. Iip35 agit comme dominant et impose la rétention aux autres isoformes d’Ii. Cependant, le rôle physiologique du motif R-x-R et, plus globalement, celui d’Iip35, demeurent nébuleux. Pour mieux cerner la fonction d’Iip35, nous avons généré des souris transgéniques (Tg) exprimant l’isoforme humaine Iip35 et avons analysé la conformation et le trafic du CMH II, la sélection thymique et la maturation des cellules B ainsi que la présentation antigénique. Nos résultats ont démontré qu’Iip35 favorise l’assemblage du CMH II dans le RE. Il induit également une conformation compacte du CMH II et augmente l’expression du CMH II en surface. De plus, Iip35 cible le CMH II dans les endosomes où un peptide de forte affinité se lie dans la niche peptidique. Par ailleurs, Iip35 diversifie le répertoire de peptides et rétablit totalement la sélection des cellules T CD4+ ainsi que le niveau d’expression du TCR de ces dernières. Iip35 restaure également la présentation antigénique de l’ovalbumine dont la présentation requiert l’expression d’Ii. Par contre, Iip35 rétablit la présentation des superantigènes mais à un niveau moindre que celui des souris sauvages. Ensuite, Iip35 permet le rétablissement de la sélection des cellules iNKT démontrant qu’il assiste la présentation des lipides par les molécules CD1d. Enfin, les résultats ont démontré qu’Iip35 restaure le développement des cellules B matures folliculaires (FO) mais pas celui des cellules B de la zone marginale. Ceci suggère qu’Iip35 est capable d’induire le développement des cellules FO sans stimulation préalable par le MIF (macrophage migration inhibitory factor). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre qu’Iip35 est fonctionnel et assure la majorité des fonctions d’Ii. Cependant, Iip35 ne remplace pas mIi endogène concernant la maturation des cellules B MZ suggérant qu’il pourrait avoir un rôle de régulateur.