Impact d'une alimentation riche en phytoestrogènes sur l'expression génique cardiaque

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de l’activité de Staufen1 dans la régulation traductionnelle de certains ARNm

Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme.

Identification in silico d’éléments de réponse de récepteurs nucléaires impliqués dans le cancer du sein

La croissance de deux tiers des tumeurs mammaires dépend des œstrogènes. Le réseau de gènes responsable de propager les signaux prolifératifs des œstrogènes est encore mal connu. Des micropuces d’ADN de cellules de carcinome mammaire MCF7 traitées à l’œstradiol (E2) avec ou sans l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide (CHX) ont permis d’identifier de nombreux gènes cibles primaires et secondaires. La séquence des promoteurs des gènes cibles a été criblée à l’aide d’une banque de 300 matrices modélisant les sites reconnus par divers facteurs de transcription. Les éléments de réponse aux œstrogènes (ERE) sont enrichis dans les promoteurs des gènes primaires. Les sites E2F sont enrichis dans les promoteurs des gènes cible secondaires. Un enrichissement similaire a été observé avec les régions liées par ERα et E2F1 en ChIP-on-chip pour chacune des catégories de gènes. La croissance des cellules de carcinome mammaire est inhibée par des traitements à l’acide rétinoïque (RA). L’analyse de micropuces d’ADN de MCF7 traitées avec RA a permis d’identifier de nombreux gènes cibles potentiels. Un enrichissement d’éléments de réponse à l’acide rétinoïque (RARE) est observable dans les promoteurs de ces gènes après avoir exclus les RARE se trouvant à l’intérieur d’éléments transposables. Des RARE présents dans des éléments transposables spécifiques aux primates sont aussi fixés in vivo dans les promoteurs de cibles connues de RA : BTG2, CASP9 et GPRC5A. Certains gènes cibles de RA dans les MCF7 sont aussi des cibles de E2, suggérant que le contrôle que ces molécules exercent sur la prolifération est en partie attribuable à des effets opposés sur un ensemble commun de gènes.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.

Évaluation du caryotype moléculaire en tant qu’outil diagnostique chez les enfants avec déficience intellectuelle et/ou malformations congénitales

Le caryotype moléculaire permet d’identifier un CNV chez 10-14% des individus atteints de déficience intellectuelle et/ou de malformations congénitales. C’est pourquoi il s’agit maintenant de l’analyse de première intention chez ces patients. Toutefois, le rendement diagnostique n’est pas aussi bien défini en contexte prénatal et l’identification de CNVs de signification clinique incertaine y est particulièrement problématique à cause du risque d’interruption de grossesse. Nous avons donc testé 49 fœtus avec malformations majeures et un caryotype conventionnel normal avec une micropuce CGH pangénomique, et obtenu un diagnostic dans 8,2% des cas. Par ailleurs, des micropuces à très haute résolution combinant le caryotype moléculaire et le génotypage de SNPs ont récemment été introduites sur le marché. En plus d’identifier les CNVs, ces plateformes détectent les LOHs, qui peuvent indiquer la présence d’une mutation homozygote ou de disomie uniparentale. Ces anomalies pouvant être associées à la déficience intellectuelle ou à des malformations, leur détection est particulièrement intéressante pour les patients dont le phénotype reste inexpliqué. Cependant, le rendement diagnostique de ces plateformes n’est pas confirmé, et l’utilité clinique réelle des LOHs n’est toujours pas établie. Nous avons donc testé 21 enfants atteints de déficience intellectuelle pour qui les méthodes standards d’analyse génétique n’avaient pas résulté en un diagnostic, et avons pu faire passer le rendement diagnostique de 14,3% à 28,6% grâce à l’information fournie par les LOHs. Cette étude démontre l’utilité clinique d’une micropuce CGH pangénomique chez des fœtus avec malformations, de même que celle d’une micropuce SNP chez des enfants avec déficience intellectuelle.

Stratégie de détection des anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës pédiatriques

L’analyse des anomalies génomiques récurrentes est importante pour établir le diagnostic, le pronostic et pour orienter la thérapie des leucémies aiguës pédiatriques. L’objectif de notre étude est d’élaborer une stratégie optimale pour détecter les anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et myéloïdes (LAM) des enfants. Pour ce faire, nous avons caractérisé au caryotype, avec des panels d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), par RT-PCR et par l’index d’ADN 253 leucémies de novo reçues au CHU Sainte-Justine entre 2005 et 2011 (186 LAL-B, 27 LAL-T et 40 LAM). Nous avons réussi à optimiser la détection des anomalies chromosomiques dans les trois types de leucémies, avec des fréquences de 93,5% dans les LAL-B (174/186), 66,7% dans les LAL-T (18/27) et 90% dans les LAM (36/40). Nos résultats suggèrent d’utiliser plusieurs tests génétiques concomitants afin d’optimiser la détection des anomalies génomiques dans les LAL et les LAM de novo pédiatriques.

Approches bio-informatiques appliquées aux technologies émergentes en génomique

Les études génétiques, telles que les études de liaison ou d’association, ont permis d’acquérir une plus grande connaissance sur l’étiologie de plusieurs maladies affectant les populations humaines. Même si une dizaine de milliers d’études génétiques ont été réalisées sur des centaines de maladies ou autres traits, une grande partie de leur héritabilité reste inexpliquée. Depuis une dizaine d’années, plusieurs percées dans le domaine de la génomique ont été réalisées. Par exemple, l’utilisation des micropuces d’hybridation génomique comparative à haute densité a permis de démontrer l’existence à grande échelle des variations et des polymorphismes en nombre de copies. Ces derniers sont maintenant détectables à l’aide de micropuce d’ADN ou du séquençage à haut débit. De plus, des études récentes utilisant le séquençage à haut débit ont permis de démontrer que la majorité des variations présentes dans l’exome d’un individu étaient rares ou même propres à cet individu. Ceci a permis la conception d’une nouvelle micropuce d’ADN permettant de déterminer rapidement et à faible coût le génotype de plusieurs milliers de variations rares pour un grand ensemble d’individus à la fois. Dans ce contexte, l’objectif général de cette thèse vise le développement de nouvelles méthodologies et de nouveaux outils bio-informatiques de haute performance permettant la détection, à de hauts critères de qualité, des variations en nombre de copies et des variations nucléotidiques rares dans le cadre d’études génétiques. Ces avancées permettront, à long terme, d’expliquer une plus grande partie de l’héritabilité manquante des traits complexes, poussant ainsi l’avancement des connaissances sur l’étiologie de ces derniers. Un algorithme permettant le partitionnement des polymorphismes en nombre de copies a donc été conçu, rendant possible l’utilisation de ces variations structurales dans le cadre d’étude de liaison génétique sur données familiales. Ensuite, une étude exploratoire a permis de caractériser les différents problèmes associés aux études génétiques utilisant des variations en nombre de copies rares sur des individus non reliés. Cette étude a été réalisée avec la collaboration du Wellcome Trust Centre for Human Genetics de l’University of Oxford. Par la suite, une comparaison de la performance des algorithmes de génotypage lors de leur utilisation avec une nouvelle micropuce d’ADN contenant une majorité de marqueurs rares a été réalisée. Finalement, un outil bio-informatique permettant de filtrer de façon efficace et rapide des données génétiques a été implémenté. Cet outil permet de générer des données de meilleure qualité, avec une meilleure reproductibilité des résultats, tout en diminuant les chances d’obtenir une fausse association.

Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaire

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.

Identification des ARNm liés par les protéines Staufen de mammifères et caractérisation des déterminants structuraux à la base de l'interaction

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification de gènes ciblès par ETV6-AML1, un facteur de transcription chimérique retrouvé dans la leucémie de l'enfant

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification des ARNm liés par les protéines Staufen de mammifères et caractérisation des déterminants structuraux à la base de l'interaction

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification de gènes ciblès par ETV6-AML1, un facteur de transcription chimérique retrouvé dans la leucémie de l'enfant

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.