Detection of metallo-beta-lactamases-encoding genes in environmental isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas jandaei

Aims: To determine the prevalence and expression of metallo-beta-lactamases (MBL)-encoding genes in Aeromonas species recovered from natural water reservoirs in southeastern Brazil. Methods and Results: Eighty-seven Aeromonas isolates belonging to Aeromonas hydrophila (n = 41) and Aer. jandaei (n = 46) species were tested for MBL production by the combined disk test using imipenem and meropenem disks as substrates and EDTA or thioglycolic acid as inhibitors. The presence of MBL genes was investigated by PCR and sequencing using new consensus primer pairs designed in this study. The cphA gene was found in 97.6% and 100% of Aer. hydrophila and Aer. jandaei isolates, respectively, whereas the acquired MBL genes bla(IMP), bla(VIM) and bla(SPM-1) were not detected. On the other hand, production of MBL activity was detectable in 87.8% and 10.9% of the cphA-positive Aer. hydrophila and Aer. jandaei isolates respectively. Conclusions: Our results indicate that cphA seems to be intrinsic in the environmental isolates of Aer. hydrophila and Aer. jandaei in southeastern Brazil, although, based on the combined disk test, not all of them are apparently able to express the enzymatic activity. Significance and Impact of the Study: These data confirm the presence of MBL-producing Aeromonas species in natural water reservoirs. Risk of water-borne diseases owing to domestic and industrial uses of freshwater should be re-examined from the increase of bacterial resistance point of view.

Detection of SPM and IMP metallo-beta-lactamases in clinical specimens of Pseudomonas aeruginosa from a Brazilian public tertiary hospital

Phenotypic and genotypic SPM and IMP metallo-beta-lactamases (MBL) detection and also the determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) to imipenem, meropenem and ceftazidime were evaluated in 47 multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from clinical specimens. Polymerase chain reaction detected 14 positive samples to either bla(SPM) or bla(IMP) genes, while the best phenotypic assay (ceftazidime substrate and mercaptopropionic acid inhibitor) detected 13 of these samples. Imipenem, meropenem and ceftazidime MICs were higher for MBL positive compared to MBL negative isolates. We describe here the SPM and IMP MBL findings in clinical specimens of P. aeruginosa from the University Hospital of Botucatu Medical School, São Paulo, Brazil, that reinforce local studies showing the high spreading of bla(SPM) and bla(IMP) genes among Brazilian clinical isolates.

Metallo-beta-lactamase-Catalyzed Hydrolysis of Cephalosporins: Some Mechanistic Insights into the Effect of Heterocyclic Thiones on Enzyme Activity

The hydrolysis of beta-lactam antibiotics using zinc-containing metallo-beta-lactamases (m beta l) is one of the major bacterial defense systems. These enzymes can catalyze the hydrolysis of a variety of antibiotics including the latest generation of cephalosporins, cephamycins, and imipenem. It is shown in this paper that the cephalosporins having heterocyclic - SR side chains are less prone to m beta l-mediated hydrolysis than the antibiotics that do not have such side chains. This is partly due to the inhibition of enzyme activity by the thione moieties eliminated during hydrolysis. When the enzymatic hydrolysis of oxacillin was carried out in the presence of heterocyclic thiones such as MU, MDT, DMETT, and MMA, the catalytic activity of the enzyme was inhibited significantly by these compounds. Although the heterocyclic - SR moieties eliminated from the beta-lactams upon hydrolysis undergo a rapid tautomerism between thione and thiol forms, these compounds act as thiolate ligands toward zinc(II) ions. The structural characterization of two model tetranuclear zinc(II) thiolate complexes indicates that the -SR side chains eliminated from the antibiotics may interact with the zinc(II) metal center of m beta l through their sulfur atoms.

Metallo-beta-lactamase and phosphotriesterase activities of some zinc(II) complexes

Metallo-beta-lactamases (m beta l) and phosphotriesterase (PTE) are zinc(II) enzymes, which hydrolyze the beta-lactam antibiotics and toxic organophosphotriesters, respectively. In the present work, we have synthesized a few asymmetric phenolate-based ligands by sequential Mannich reaction and their corresponding zinc(II) complexes. These zinc(II) complexes were studied for their m beta l and PTE activities. It is shown that the zinc(II) complexes can hydrolyze oxacillin, the beta-lactam antibiotic, at much higher rates as compared to the hydrolysis of p-nitrophenyl diphenylphosphate (PNPDPP), the phosphotriester. Among the complexes studied, the binuclear asymmetric complex 1 having a water molecule coordinated to one of the zinc(II) ions exhibits much better mbl activity than the mononuclear complexes. However, the mononuclear zinc(II) complexes having labile chloride ions exhibit significant PTE activity, which can be ascribed to the replacement of chloride ions by hydroxide ions during hydrolysis reactions. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Detecção de genes de beta-lactamases de amplo espectro em Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos isoladas em São José do Rio Preto - SP

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Inhibition of Peroxidase-Catalyzed Iodination by Cephalosporins: Metallo-beta-Lactamase-Induced Antithyroid Activity of Antibiotics

Broad-spectrum antibiotics with heterocyclic side chains strongly inhibit peroxidase-catalyzed iodination in the presence of metallo--lactamase. This suggests that antibiotic resistance due to hydrolysis of the -lactam ring in antibiotics would have negative effects on thyroid activity.

Hydrolysis of Organophosphate Esters: Phosphotriesterase Activity of Metallo-beta-lactamase and Its Functional Mimics

The phosphotriesterase (PTE) activity of a series of binuclear and mononuclear zinc(II) complexes and metallo-beta-lactamase (m beta 1) from Bacillus cereus was studied. The binuclear complex 1, which exhibits good m beta 1 activity, shows poor PTE activity. In contrast,complex 2, a poor mimic of m beta 1, exhibits much higher activity than 1 The replacement of Cl- ligands by OH- is important for the high PTE activity of complex 2 because this complex does not show any catalytic activity in methanol. The natural enzyme m beta 1 from B. cereus is also found to be an inefficient catalyst in the hydrolysis of phosphotriesters. These observations indicate that the binding of beta-lactam substrates at the binuclear zinc(II) center is different from that of phosphotriesters. Furthermore, phosphodiesters, the products from the hydrolysis of triesters, significantly inhibit the PTE activity of m beta 1 and its functional mimics. Although the mononuclear complexes 3 and 4 exhibited significant m beta 1 activity, these complexes are found to be almost inactive in the hydrolysis of phosphotriesters. These observations indicate that the elimination of phosphodiesters from the reaction site is important for the PTE activity of zinc(II) complexes.

Metallo beta lactamase producing Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii

This study aims in identifying MBLs particularly Zn requiring Molecular Class B enzymes produced by Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. The resistance by these organisms are in a rise against all antibiotics including carbapenems and no prescribed CLSI guidelines is available for detecting them. Clinical isolates antibiotic susceptibility was determined by number of phenotypic tests by addition of 50mM of 10 mu l zinc as cofactor for metallo beta lactamase production along with 0.5M ETDA of 5 mu l (930 mu g per disk) plain disks. Increase in zone size of the meropenem -EDTA disk compared to the meropenem disk without EDTA was recorded positive. For Zn requiring MBLs zone towards both disks of EDTA and Zn along with meropenem is detected by DDST.

Caracterização de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), genes de resistência aos antimicrobianos e conteúdo plasmidial em cepas de Escherichia coli e Salmonella spp. não tifóides isoladas do ambiente hospitalar e da comunidade

Enterobactérias produtoras de ESBLs são descritas tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade em todo o mundo. No Brasil, esses microrganismos também têm emergido como uma causa importante de infecções, sendo as enzimas CTX-M as prevalentes. O objetivo deste estudo foi analisar diferentes aspectos genotípicos relacionados à expressão da resistência aos antimicrobianos em cepas Escherichia coli e de Salmonella spp, tais como: a diversidade de ESBLs, os genes de resistência aos antimicrobianos e o conteúdo plasmidial. Os aspectos epidemiológicos das cepas produtoras de ESBLs também foram investigados. Foram estudadas 88 cepas de enterobactérias, sendo 43 E. coli e 45 cepas de Salmonella spp., de origem hospitalar e da comunidade (principalmente alimentos), isoladas na cidade do Rio de Janeiro. A expressão de ESBL foi observada em sete cepas de E. coli (7/43, 16,3%) e em uma cepa de Salmonella Typhimurium (1/45, 2,3%) e as enzimas foram identificadas como variantes de CTX-M e SHV-5, respectivamente. Entre as cepas de E. coli, a enzima CTX-M-2 foi a mais frequente (n = 4), sendo detectada em cepas isoladas de swab retal de pacientes hospitalizados, enquanto as enzimas CTX-M-59 (uma variante de CTX-M) (n = 1) e CTX-M-9 (n = 2) foram identificadas em cepas isoladas a partir de espécimes clínicos. Salmonella Typhimurium produtora de SHV-5 foi isolada do ambiente hospitalar (fórmula infantil). As cepas de E. coli produtoras das enzimas CTX-M pertenceram a grupos filogenéticos (A, B1, D) e STs (ST34, ST69, ST101) diferentes, sendo os genes blaCTX-M identificados em plasmídeos com tipo de replicon IncA/C de cerca de 150 kb (blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, blaCTX-M-59) ou 80 kb (blaCTX-M-2). A cepa de S. Typhimurium produtora de SHV-5 pertenceu a um único clone (A-ST19) e o gene blaSHV-5 foi identificado em plasmídeo com o replicon IncL/M com aproximadamente 55Kb. Foi identificado pela primeira vez no Brasil o ST313 em um clone de S. Typhimurium (D-ST313), comumente associado com doenças invasivas severas, particulamente no continente africano. Genes que codificam para a resistência aos antimicrobianos não-beta-lactâmicos e integrons classe 1 foram identificados entre as cepas de E. coli e de Salmonella spp. multirresistentes produtoras ou não de ESBLs. Em conclusão: i) nossos resultados referentes à E. coli confirmaram a disseminação de enzimas CTX-M (principalmente variantes do grupo CTX-M-2) desde, pelo menos, o ano de 2000, em hospitais no Rio de Janeiro; demonstraram a implicação dos plasmídeos IncA/C na disseminação de genes blaCTX-M; indicaram a possível evolução intra-plasmídeo de blaCTX-M-59 a partir de blaCTX-M-2; a observação da diversidade e multiplicidade de plasmídeos poderiam fornecer plataformas genéticas para a dispersão de diferentes genes e/ou elementos de resistência aos antimicrobianos; ii) em relação à Salmonella spp. este estudo descreveu, pela primeira vez, o isolamento, a partir de fórmula infantil, de uma cepa de S. Typhimurium produtora de ESBL; foi demonstrada a associação do gene blaSHV-5 com plasmídeo do tipo IncL/M, que é considerado epidêmico; foi identificado o clone D-ST313 de S. Typhimurium, que está associado a doenças invasivas severas no continente africano, que reuniu cepas isoladas exclusivamente do ambiente hospitalar.

Caracterização molecular de isolados de Enterobacteriaceae produtores de beta-lactamases de espectro alargado (ESBLs) provenientes de suiniculturas de produção intensiva e extensiva de Portugal

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Balanoposthitis caused by Pseudomonas aeruginosa co-producing metallo-beta-lactamase and 16S rRNA methylase in children with hematological malignancies

Balanoposthitis is defined as the inflammation of the glans penis and its foreskin. In the presence of other underlying medical conditions, this localized infection may spread systemically, serving as a source of fever and bacteremia in neutropenic males. Two rare cases of balanoposthitis caused by a clonally related Pseudomonas aeruginosa isolate co-producing the SPM-1 metallo-beta-lactamase and the novel 16S rRNA methylase RmtD are described. Four multidrug-resistant (MDR) P. aeruginosa isolates were successively recovered from glans/foreskin swabs and urine cultures from two uncircumcised pediatric patients, one with Burkitt`s non-Hodgkin`s lymphoma and one with acute lymphoblastic leukemia. Clinically, preputial colonization by MDR P. aeruginosa evolved to severe balanoposthitis with glans/foreskin lesions as a source of fever. Combination therapy of ciprofloxacin and/or aztreonam (systemic) plus polymyxin B (topical) was effective once reversion of the neutropenic condition was achieved. Although P. aeruginosa remains an unusual cause of balanoposthitis, these cases should alert the physician to the potential pathogenicity of this bacterium. Furthermore, co-production of metallo-beta-lactamase and 16S rRNA methylase has a potential impact on the empirical management of complicated infections caused by P. aeruginosa. Crown Copyright (C) 2009 Published by Elsevier Ltd on behalf of International Society for Infectious Diseases. All rights reserved.

Caracterização de metalo-beta-lactamases produzidas por amostras de pseudomonas aeruginosa isoladas em dois hospitais de Porto Alegre

Introdução: P. aeruginosa é o principal agente causador de infecção hospitalar sendo a primeira causa de pneumonia nosocomial em hospitais brasileiros. Os carbapenêmicos são geralmente o tratamento empírico de escolha para infecções graves causadas por esta bactéria. Entretanto, seu uso tem sido limitado pelas elevadas taxas de resistência entre os isolados de P. aeruginosa principalmente os produtores de metalo-β-lactamases (Mβla). Objetivos: Caracterizar e avaliar a produção de metalo-β-lactamase em amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem em dois hospitais universitários de Porto Alegre. Métodos: O método de disco difusão padronizado pelo NCCLS foi utilizado para avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Um teste de aproximação de discos utilizando ceftazidima com ácido 2-mercaptopropiônico foi utilizado para triagem de amostras produtoras de Mβla. A fita de Etest combinada imipenem com EDTA também foi utilizada como teste fenotípico. Os resultados destes dois testes foram comparados à PCR para pesquisa dos genes blaSPM-1, blaIMP-1 e blaVIM-2 .Os isolados produtores de Mβla foram submetidos a tipagem molecular pela técnica de macrorestrição de DNA seguida de pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O perfil de hidrólise para o imipenem foi avaliado nas amostras produtoras de Mβla através da variação de absorção medida a 298 nm. Resultados: Dos 92 isolados clínicos analisados, 33 foram positivos no teste de aproximação de discos. Destes, 18 foram produtores de SPM-1 e 5 de IMP-1. Todas as amostras produtoras de SPM-1 apresentaram razão de IP/IPI na fita combinada ≥ 8. Os 18 isolados de SPM-1 foram classificados como um único padrão de PFGE que foi o predominante. Seis isolados pertenciam a um segundo padrão de PFGE, sendo que cinco destes eram IMP-1. O perfil de hidrólise mostrou que os isolados produtores de SPM-1 degradam mais efetivamente o imipenem quando comparado aos produtores de IMP-1 e aos não produtores de Mβla. Conclusões: Há uma alta prevalência de Mβla entre isolados de P. aeruginosa resistentes a imipenem e/ou ceftazidima. O gene SPM-1 é o elemento genético mais prevalente entre as amostras de P. aeruginosa Mβla positivas e a disseminação clonal têm contribuído para os elevados níveis de resistência aos carbapenêmicos entre os isolados de P. aeruginosa nos hospitais deste estudo.

Pesquisa de genes de metalo-beta-lactamases em pseudomonas aeruginosa isoladas em três hospitais universitários de Porto Alegre

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.