Estudi d'una metal·lotioneïna d'alzina surera (QsMT)

En aquest treball es caracteriza per primera vegada la capacitat de coordinació metàl·lica d'una metal·lotineïna (MT) de planta i es proposa un model de plegament per a les MTs de planta en general. Els resultat mostren que aquestes proteïnes poden tenir un paper molt important en la regulació de l'estat redox de les cèl·lules, probablement a través de la coordinació a Cu. Les MTs de planta són proteïnes molt desconegudes. Es postula que participen en l'homeòstasi del Cu i en la protecció contra l'estrès oxidatiu, però es desconeix la capacitat de coordinació metàl·lica i el plegament. En aquest treball s'han estudiat una metal·lotioneïna d'alzina surera, QsMT, aïllada d'una llibreria de cDNA de fel·lema. Els objectius concrets han estat: (1) estudiar l'expressió de QsMT i la resposta a l'estrès oxidatiu; (2) determinar la capacitat de coordinació metàl·lica i la funcionalitat in vivo; (3) fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. L'expressió del gen s'ha estudiat mitjançant hibridació in situ en plàntules i en embrions d'alzina surera. QsMT s'expressa majoritàriament en cèl·lules amb fort estrès oxidatiu, associat a la síntesi de polifenols (suberització i lignificació) i a la senescència. També s'expressa en cèl·lules meristemàtiques, cèl·lules en divisió molt activa on la funció de les MTs podria estar relacionada amb el manteniment de l'estat redox. L'aplicació d'estrès oxidatiu exogen (H2O2 i paraquat) incrementa fortament l'expressió de QsMT en teixits amb expressió constitutiva, confirmant la regulació de l'expressió del gen per estrès oxidatiu. Per l'estudi de les propietats de coordinació metàl·lica es va expressar QsMT en cèl·lules d'E. coli en medi de cultiu suplementat amb Cu, Zn o Cd. Es van aïllar els agregats metàl·lics corresponents i es van analitzar mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-OES, ESI-MS i CD). Els resultats mostren que QsMT coordina de forma estable Cu (8 ions metàl·lics/molècula), Zn (4 ions de Zn/molècula) i Cd (6 ions de Cd/molècula), i adopta una estructura especialment quiral en coordinació a Cu. L'elevada capacitat quelant de la proteïna i la quiralitat de l'estructura indiquen que QsMT possiblement té preferència metàl·lica pel Cu i per tant una funció relacionada amb aquest metall in vivo. Estudis de complementació en llevat demostren que QsMT coordina Cu de forma funcional in vivo. En coordinació a Cd QsMT presenta una peculiaritat no observada fins ara en altres MTs: la participació d'ions sulfur en la formació de l'agregat metàl·lic incrementant la capacitat de coordinació metàl·lica (6 ions metàl·lics divalents de Cd enlloc de 4 ions de Zn). A més QsMT coordina Cd de forma funcional en llevat, i per tant la seva funció també podria estar relacionada amb la destoxicació de Cd en la planta. QsMT s'ha utilitzat com a model per fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. Amb aquest objectiu vam dissenyar tres pèptids mutants derivats de QsMT: N25 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició amino-terminal, C18 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició carboxil-terminal, i N25-C18 corresponent a les dues zones riques en cisteïna enllaçades per 4 glicines substituint la zona central de 39 aminoàcids. Es van expressar i estudiar aquests pèptids per les mateixes tècniques utilitzades en l'estudi de QsMT. Els resultats indiquen que QsMT es plega formant un sol agregat metàl·lic per la interacció de les dues zones riques en cisteïna. En aquest model la zona central d'enllaç, típica de les MTs de planta, no participa en la coordinació metàl·lica però és imprescindible per a la funció de la proteïna. El paper de la zona central podria variar en funció del metall que coordina, participant en el plegament i estructura de la proteïna quan coordina Zn i Cd i en la seva regulació i estabilització quan coordina Cu.

Bioacumulació de 210Po a nivell subcel·lular

S’ha analitzat la concentració de 210Po en les fraccions subcel·lulars en òrgans digestius per diferents espècies de peixos. S’ha determinat que al voltant d'un 50% del 210Po es concentra en la fracció de citoplasma. La fracció de citoplasma es va separar en diferents especiacions químiques on es va determinar que la fracció de proteïna era la més enriquida en 210Po amb un 69%. Per una altra banda s'han estudiat les concentracions de metalls (Fe, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb i Hg) en relació a la concentració de 210Po on s'ha trobat una correlació entre el 210Po i els metalls de Fe i Hg per als teixits de les espècies estudiades. També s'han analitzat les concentracions de metalls respecte a la fracció de citoplasma i s'ha relacionat amb la concentració de 210Po. Amb metalls com Fe, Cu, Ni i Hg analitzats s'ha trobat una relació front a la concentració de 210Po.

Preferències metàl·liques de les metal·lotioneïnes de Tetrahymena thermophila: cinc isoformes i dos comportaments clarament oposats

Les metal·lotioneïnes constitueixen una superfamília de proteïnes amb unes característiques molt peculiars. Es troben presents en molts organismes, presentant sovint diferents isoformes. La presència de diferents isoformes dins un mateix organisme fa pensar que és possible que cadascuna d’elles presentin funcions diferents. Un cas paradigmàtic, que pot aportar informació són les MTs del protozou ciliat Tetrahymena thermophila, amb cinc isoformes que es mostren com un sistema ideal per estudiar els determinants d’especificitat metàl·lica de les MTs. L’ estudi de les propietats coordinants de les cinc isoformes de MT de Tetrahymena thermophila, servirà per aprofundir en la relació estructura/funció d’aquestes metal·lotioneïnes.

Caracterització de les metal·lotioneïnes CnMT1 i CnMT2 del fong Cryptococcus neoformans. Estudi de la capacitat coordinant davant dels ions Zn(II), Cd(II) i Cu(I)

En aquest treball de recerca, s’han estudiat les dues isoformes de metal·lotioneïna CnMT1 i CnMT2 presents en el fong patogen Cryptococcus neoformans. Recentment s’ha descobert que aquest fong té com a factor de virulència, els nivells de coure del medi on es troba. Les dues isoformes produïdes en medis rics en Zn(II) s’han utilitzat per a fer valoracions amb Cu(I) i Cd(II), i s’ha seguit l’evolució dels experiments mitjançant les tècniques DC, UV-vis, i ESI-MS. S’ha pogut observar que les dues isoformes tenen preferència per enllaçar Cu(I). Per altra banda també s’ha establert una gran homologia entre les dues seqüències.