Ribose 2′-O-methylation provides a molecular signature for the distinction of self and non-self mRNA dependent on the RNA sensor Mda5

The 5'-cap-structures of higher eukaryote mRNAs are ribose 2'-O-methylated. Likewise, a number of viruses replicating in the cytoplasm of eukayotes have evolved 2'-O-methyltransferases to modify autonomously their mRNAs. However, a defined biological role of mRNA 2'-O-methylation remains elusive. Here we show that viral mRNA 2'-O-methylation is critically involved in subversion of type-I-interferon (IFN-I) induction. We demonstrate that human and murine coronavirus 2'-O-methyltransferase mutants induce increased IFN-I expression, and are highly IFN-I sensitive. Importantly, IFN-I induction by 2'-O-methyltransferase-deficient viruses is dependent on the cytoplasmic RNA sensor melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5). This link between MDA5-mediated sensing of viral RNA and mRNA 2'-O-methylation suggests that RNA modifications, such as 2'-O-methylation, provide a molecular signature for the discrimination of self and non-self mRNA.

Oropouche Virus Infection And Pathogenesis Is Restricted By Mavs, Irf-3, Irf-7, And Type I Ifn Signaling Pathways In Non-myeloid Cells.

Oropouche virus (OROV) is a member of the Orthobunyavirus genus in the Bunyaviridae family and a prominent cause of insect-transmitted viral disease in Central and South America. Despite its clinical relevance, little is known about OROV pathogenesis. To define the host defense pathways that control OROV infection and disease, we evaluated OROV pathogenesis and immune responses in primary cells and mice that were deficient in the RIG-I-like receptor signaling pathway (MDA5, RIG-I, or MAVS), downstream regulatory transcription factors (IRF-3 or IRF-7), IFN-β, or the receptor for type I IFN signaling (IFNAR). OROV replicated to higher levels in primary fibroblasts and dendritic cells lacking MAVS signaling, the transcription factors IRF-3 and IRF-7, or IFNAR. In mice, deletion of IFNAR, MAVS, or IRF-3 and IRF-7 resulted in uncontrolled OROV replication, hypercytokinemia, extensive liver damage, and death whereas wild-type (WT) congenic animals failed to develop disease. Unexpectedly, mice with a selective deletion of IFNAR on myeloid cells (CD11c Cre(+) Ifnar(f/f) or LysM Cre(+) Ifnar(f/f)) did not sustain enhanced disease with OROV or La Crosse virus, a closely related encephalitic orthobunyavirus. In bone marrow chimera studies, recipient irradiated Ifnar(-/-) mice reconstituted with WT hematopoietic cells sustained high levels of OROV replication and liver damage, whereas WT mice reconstituted with Ifnar(-/-) bone marrow were resistant to disease. Collectively, these results establish a dominant protective role for MAVS, IRF-3 and IRF-7, and IFNAR in restricting OROV virus infection and tissue injury, and suggest that IFN signaling in non-myeloid cells contributes to the host defense against orthobunyaviruses. Oropouche virus (OROV) is an emerging arthropod-transmitted orthobunyavirus that causes episodic outbreaks of a debilitating febrile illness in humans in countries of South and Central America. The continued expansion of the range and number of its arthropod vectors increases the likelihood that OROV will spread into new regions. At present, the pathogenesis of OROV in humans or other vertebrate animals remains poorly understood. To define cellular mechanisms of control of OROV infection, we performed infection studies in a series of primary cells and mice that were deficient in key innate immune genes involved in pathogen recognition and control. Our results establish that a MAVS-dependent type I IFN signaling pathway has a dominant role in restricting OROV infection and pathogenesis in vivo.

Gain-of-Function Mutations in IFIH1 Cause a Spectrum of Human Disease Phenotypes Associated with Upregulated Type I Interferon Signaling

The type I interferon system is integral to human antiviral immunity. However, inappropriate stimulation or defective negative regulation of this system can lead to inflammatory disease. We sought to determine the molecular basis of genetically uncharacterized cases of the type I interferonopathy Aicardi-Goutières syndrome, and of other patients with undefined neurological and immunological phenotypes also demonstrating an upregulated type I interferon response. We found that heterozygous mutations in the cytosolic double-stranded RNA receptor gene IFIH1 (MDA5) cause a spectrum of neuro-immunological features consistently associated with an enhanced interferon state. Cellular and biochemical assays indicate that these mutations confer a gain-of-function - so that mutant IFIH1 binds RNA more avidly, leading to increased baseline and ligand-induced interferon signaling. Our results demonstrate that aberrant sensing of nucleic acids can cause immune upregulation.

TRADD protein is an essential component of the RIG-like helicase antiviral pathway

Upon detection of viral RNA, the helicases RIG-I and/or MDA5 trigger, via their adaptor Cardif (also known as IPS-1, MAVS, or VISA), the activation of the transcription factors NF-kappaB and IRF3, which collaborate to induce an antiviral type I interferon (IFN) response. FADD and RIP1, known as mediators of death-receptor signaling, are implicated in this antiviral pathway; however, the link between death-receptor and antiviral signaling is not known. Here we showed that TRADD, a crucial adaptor of tumor necrosis factor receptor (TNFRI), was important in RIG-like helicase (RLH)-mediated signal transduction. TRADD is recruited to Cardif and orchestrated complex formation with the E3 ubiquitin ligase TRAF3 and TANK and with FADD and RIP1, leading to the activation of IRF3 and NF-kappaB. Loss of TRADD prevented Cardif-dependent activation of IFN-beta, reduced the production of IFN-beta in response to RNA viruses, and enhanced vesicular stomatitis virus replication. Thus, TRADD is not only an essential component of proinflammatory TNFRI signaling, but is also required for RLH-Cardif-dependent antiviral immune responses

Novel immunotherapeutic strategies against human papillomavirus type 16 (HPV 16) induced lesions and cervical cancer

RESUME Le cancer du col de l'utérus, deuxième cause de mort par cancer chez la femme, a pu être associé à une infection par plusieurs types de virus du Papillome Humain (HPV), et en particulier HPV 16. Les vaccins prophylactiques sont efficaces à prévenir le cancer du col utérin alors que les lésions de haut grade sont généralement traitées par ablation chirurgicale et par d'éventuels traitements additionnels. Les risques de récurrence liés aux ablations et le taux de mortalité (50%) lié au cancer, démontrent le besoin de développer des stratégies alternatives afin de cibler les lésions précancéreuses. A ce jour, les vaccins thérapeutiques ont démontré peu de résultats cliniques, contrastant avec les régressions de tumeurs ectopiques observées après vaccination dans des modèles murins avec tumeurs associées à HPV. L'induction de réponses immunitaires protectrices dans la muqueuse génitale semble être cruciale pour l'efficacité des vaccins thérapeutiques HPV et évaluer leur efficacité dans un modèle murin avec tumeurs-HPV génitales représente un pré-requis important avant de procéder à des études cliniques. Par conséquent, nous avons établi un modèle murin orthotopique où des tumeurs se développent dans (a muqueuse génitale après une instillation intra-vaginale (i.vag) de cellules tumorales exprimant les oncogènes E6/E7 d'HPV 16 et transduites par un vecteur lentiviral codant la luciferase afin de suivre le développement de ces tumeurs in vivo par imagerie. La caractérisation histologique a démontré que les tumeurs grandissaient dans l'épithélium vaginal et en accord avec leur localisation, des cellules Τ CD8 spécifiques à E7 induites par la tumeur n'étaient détectées que dans la muqueuse génitale et les ganglions drainants. Une infiltration de cellules Τ régulatrices a aussi été mise en évidence, empêchant la régression spontanée de ces tumeurs. Par conséquent, ce modèle devrait être plus adéquat pour tester des stratégies thérapeutiques, étant donné qu'il partage certaines similarités immunologiques avec les lésions génitales naturelles causées par HPV. Etant donné que les oncogènes E6 et E7 d'HPV sont nécessaires à la maintenance du phénotype cancéreux des cellules cervicales, elles représentent des antigènes cibles pour la vaccination thérapeutique. Nous avons démontré que des souris immunisées par voie sous-cutanée (s.c.) avec une dose d'un vaccin à base de polypeptide E7 d'HPV 16 et d'adjuvants, présentaient de nombreuses cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans leurs organes lymphatiques mais également dans la muqueuse génitale. De plus, le manque de corrélation entre les réponses spécifiques mesurées dans la périphérie et dans la muqueuse génitale souligne la nécessité et l'importance de déterminer les réponses immunitaires localement là où les lésions dues à HPV se développent. Si une vaccination par voie muqueuse est plus propice à traiter/régresser des infections génitales/tumeurs que le voie parentérale est un sujet débattu. Nos données montrent que seule la voie s.c. était capable de régresser la quasi totalité des tumeurs génitales chez la souris bien que des réponses CD8 spécifiques à E7 similaires étaient mesurées dans la muqueuse génitale après des vaccinations intra-nasale et i.vag. Afin d'augmenter la réponse spécifique au vaccin dans la muqueuse génitale, des immunostimulants ont été administrés par voie i.vag après vaccination. Nous avons démontré qu'une application i.vag d'agonistes des Toll like receptors après une vaccination s.c. induisait de manière significative une augmentation des cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans la muqueuse génitale. Plus précisément et concernant les CpG et Poly l:C, l'effet était probablement associé à une attraction locale des cellules Τ CD8 et deuxièmement dépendait respectivement des voies de signalisation TLR9 et TLR3/Mda5. Finalement, cette stratégie combinatoire a permis de régresser des grosses tumeurs génitales chez la souris, suggérant qu'une telle immunothérapie pourrait adéquatement traiter des lésions dues à HPV chez les femmes. SUMMARY Cervical cancer is the second leading cause of cancer mortality in women worldwide and results from an infection with a subset of Human Papillomavirus (HPV), HPV 16 representing the most prevalent type. The available prophylactic vaccines are an effective strategy to prevent cervical cancer while already established high grade lesions usually require surgical ablation of lesion with possible additional treatments. Recurrence risks linked to conventional ablations and the high mortality (50%) related to cervical cancer demonstrate the need for alternative strategies like immunotherapies to target pre¬cancerous lesions. Until now, therapeutic vaccines only showed limited clinical results, which strongly contrast with the regression of ectopic tumors observed in the available murine HPV tumor models after vaccination. Induction of protective immune responses in the genital mucosa (GM) may be crucial for efficacy of HPV therapeutic vaccines and evaluating their efficacy in a murine model with genital HPV- tumors represents an important prerequisite for clinical trials. Thus, we have here established an orthotopic mouse model where tumors in the GM develop after an intravaginal (i.vag) instillation of HPV 16 E6/E7 oncogenes-expressing tumor cells transduced with a luciferase encoding lentivirus vector for in vivo imaging of tumor growth. Histological characterization showed that tumor grew within the vaginal epithelium and according to their mucosal location tumor- induced E7-specific CD8 Τ cells were restricted to the GM and genital draining lymph nodes together with high Τ regulatory cells infiltrates preventing spontaneous regression. Consequently, sharing several immunological similarities with natural genital HPV lesions, this novel genital tumor model may be more adequate to test therapeutic strategies. As E6 and/or E7 HPV oncogenes expression is required for the maintenance of the cancerous phenotype of cervical cells, they represent target antigens for therapeutic vaccination. We reported that mice subcutaneously (s.c.) immunized once with an adjuvanted HPV 16 E7 polypeptide vaccine harbored high E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in their lymphoid organs and more importantly in the GM. In addition, the lack of correlation between specific responses measured in the periphery with those measured in the GM highlighted the necessity and relevance to determine the immune responses locally where HPV 16-induced lesions develop. Whether a mucosal route of immunization is better to treat/regress genital infections/tumors than parenteral immunization is still debated. Our data shows that although similar E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells responses were measured in the GM upon mucosal routes of E7 vaccine delivery (nasal and vaginal immunizations), only the s.c immunization was able to regress at least all genital tumors in mice. To further increase the vaccine-specific responses in the GM, immunostimulatory agents were i.vag administrated after vaccination. We demonstrated that a single i.vag application of toll like receptor (TLR) agonists after a s.c. E7 vaccination induced a significant increase of E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in the GM. More precisely, regarding CpG and Poly l:C, the effect is most probably associated with a local attraction of total CD8 Τ cells and secondly depends on TLR9 and TLR3/Mda5 signaling pathways, respectively. Finally, this combinatorial strategy induced tumor regression in mice harboring large genital tumors, suggesting that such an immunotherapy could be adequate to treat HPV-induced lesions in women.

The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.

The innate immune system recognizes nucleic acids during infection and tissue damage. Whereas viral RNA is detected by endosomal toll-like receptors (TLR3, TLR7, TLR8) and cytoplasmic RIG-I and MDA5, endosomal TLR9 and cytoplasmic DAI bind DNA, resulting in the activation of nuclear factor-kappaB and interferon regulatory factor transcription factors. However, viruses also trigger pro-inflammatory responses, which remain poorly defined. Here we show that internalized adenoviral DNA induces maturation of pro-interleukin-1beta in macrophages, which is dependent on NALP3 and ASC, components of the innate cytosolic molecular complex termed the inflammasome. Correspondingly, NALP3- and ASC-deficient mice display reduced innate inflammatory responses to adenovirus particles. Inflammasome activation also occurs as a result of transfected cytosolic bacterial, viral and mammalian (host) DNA, but in this case sensing is dependent on ASC but not NALP3. The DNA-sensing pro-inflammatory pathway functions independently of TLRs and interferon regulatory factors. Thus, in addition to viral and bacterial components or danger signals in general, inflammasomes sense potentially dangerous cytoplasmic DNA, strengthening their central role in innate immunity.

Persistent infection of arenaviruses : molecular mechanisms and pathogenesis

Arenaviruses are enveloped negative single strand RNA viruses that include a number of important human pathogens. The most prevalent human pathogen among the arenaviruses is the Old World arenavirus Lassa virus (LASV) which is endemic in West Africa from Senegal to Cameroon. LASV is the etiologic agent of a severe viral hemorrhagic fever named Lassa fever whose mortality rate can reach 30% in hospitalized patients. One of the hallmarks of fatal arenavirus infection in humans is the absence of an effective innate and adaptive immune response. In nature, arenaviruses are carried by rodents which represent the natural reservoirs as well as the vectors for transmission. In their natural rodent reservoir, arenaviruses have the ability to establish persistent infection without any overt signs and symptoms of pathology. We believe that the modulation of the host cell's innate immunity by arenaviruses is a key determinant for persistence in the natural host and for the pathogenesis in man. In this thesis, we studied the interaction of arenaviruses with two main branches of the host's innate anti-viral defense, the type I interferon (IFN) system and virus-induced mitochondrial apoptosis. The arenavirus nucleoprotein (NP) is responsible for the anti-IFN activity of arenaviruses. Specifically, NP blocks the activation and the nuclear translocation of the transcription factor interferon regulatory factor 3 (IRF3) which leads to type I IFN production. LASV and the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) NPs contain a 3'-5'exoribonuclease domain in the C terminal part that has been linked to the anti-IFN activity of NP. In the first project, we sought to identify cellular component(s) of the type I IFN induction pathway targeted by the viral NP. Our study revealed that LCMV NP prevents the activation of IRF3 by blocking phosphorylation of the transcription factor. We found that LCMV NP specifically targets the IRF-activating kinase IKKs, and this specific binding is conserved within the Arenaviridae. We could also demonstrate that LCMV NP associates with the kinase domain of IKKs involving NP's C-terminal region. Lastly, we showed that the binding of LCMV NP inhibits the kinase activity of IKKs. This study allowed the discovery of a new cellular interacting partner of arenavirus NP. This newly described association may play a role in the anti-IFN activity of arenaviruses but potentially also in other aspects of arenavirus infection. For the second project, we investigated the ability of arenaviruses to avoid and/or suppress mitochondrial apoptosis. As persistent viruses, arenaviruses evolved a "hit and stay" survival strategy where the apoptosis of the host cell would be deleterious. We found that LCMV does not induce mitochondrial apoptosis at any time during infection. Specifically, no caspase activity, no cytochrome c release from the mitochondria as well as no cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) were detected during LCMV infection. Interestingly, we found that virus-induced mitochondrial apoptosis remains fully functional in LCMV infected cells, while the induction of type IIFN is blocked. Since both type IIFN production and virus- induced mitochondrial apoptosis critically depend on the pattern recognition receptor (PRR) RIG-I, we examined the role of RIG-I in apoptosis in LCMV infected cells. Notably, virus- induced mitochondrial apoptosis in LCMV infected cells was found to be independent of RIG- I and MDA5, but still depended on MAVS. Our study uncovered a novel mechanism by which arenaviruses alter the host cell's pro-apoptotic signaling pathway. This might represent a strategy arenaviruses developed to maintain this branch of the innate anti-viral defense in absence of type I IFN response. Taken together, these results allow a better understanding of the interaction of arenaviruses with the host cell's innate immunity, contributing to our knowledge about pathogenic properties of these important viruses. A better comprehension of arenavirus virulence may open new avenues for vaccine development and may suggest new antiviral targets for therapeutic intervention against arenavirus infections. - Les arenavirus sont des virus enveloppés à ARN simple brin qui comportent un grand nombre de pathogènes humains. Le pathogène humain le plus important parmi les arenavirus est le virus de Lassa qui est endémique en Afrique de l'Ouest, du Sénégal au Cameroun. Le virus de Lassa est l'agent étiologique d'une fièvre hémorragique sévère appelée fièvre de Lassa, et dont le taux de mortalité peut atteindre 30% chez les patients hospitalisés. L'une des caractéristiques principales des infections fatales à arenavirus chez l'Homme est l'absence de réponse immunitaire innée et adaptative. Dans la nature, les arenavirus sont hébergés par différentes espèces de rongeur, qui représentent à la fois les réservoirs naturels et les vecteurs de transmission des arenavirus. Dans leur hôte naturel, les arenavirus ont la capacité d'établir une infection persistante sans symptôme manifeste d'une quelconque pathologie. Nous pensons que la modulation de système immunitaire inné de la cellule hôte par les arenavirus est un paramètre clé pour la persistance au sein de l'hôte naturel, ainsi que pour la pathogenèse chez l'Homme. L'objectif de cette thèse était d'étudier l'interaction des arenavirus avec deux branches essentielles de la défense antivirale innée de la cellule hôte, le système interféron (IFN) de type I et l'apoptose. La nucléoprotéine virale (NP) est responsable de l'activité anti-IFN des arenavirus. Plus spécifiquement, la NP bloque 1'activation et la translocation nucléaire du facteur de transcription IRF3 qui conduit à la production des IFNs de type I. La NP du virus de Lassa et celle du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), l'arénavirus prototypique, possèdent dans leur extrémité C-terminale un domaine 3'-5' exoribonucléase qui a été associé à l'activité anti-IFN de ces protéines. Dans un premier projet, nous avons cherché à identifier des composants cellulaires de la cascade de signalisation induisant la production d'IFNs de type I qui pourraient être ciblés par la NP virale. Nos recherches ont révélé que la NP de LCMV empêche 1'activation d'IRF3 en bloquant la phosphorylation du facteur de transcription. Nous avons découvert que la NP de LCMV cible spécifiquement la kinase IKKe, et que cette interaction spécifique est conservée à travers la famille des Arenaviridae. Notre étude a aussi permis de démontrer que la NP de LCMV interagit avec le domaine kinase d'IKKe et que l'extrémité C-terminale de la NP est impliquée. Pour finir, nous avons pu établir que l'association avec la NP de LCMV inhibe l'activité kinase d'IKKe. Cette première étude présente la découverte d'un nouveau facteur cellulaire d'interaction avec la NP des arenavirus. Cette association pourrait jouer un rôle dans l'activité anti-IFN des arénavirus, mais aussi potentiellement dans d'autres aspects des infections à arénavirus. Pour le second projet, nous nous sommes intéressés à la capacité des arénavirus à éviter et/ou supprimer l'apoptose mitochondriale. En tant que virus persistants, les arénavirus ont évolué vers une stratégie de survie "hit and stay" pour laquelle l'apoptose de la cellule hôte serait néfaste. Nous avons observé qu'à aucun moment durant l'infection LCMV n'induit l'apoptose mitochondriale. Spécifiquement, aucune activité de caspase, aucune libération mitochondriale de cytochrome c ainsi qu'aucun clivage de la polymerase poly(ADP-ribose) (PARP) n'a été détecté pendant l'infection à LCMV. Il est intéressant de noter que l'apoptose mitochondriale induite par les virus reste parfaitement fonctionnelle dans les cellules infectées par LCMV, alors que l'induction de la réponse IFN de type I est bloquée dans les mêmes cellules. La production des IFNs de type I et l'apoptose mitochondriale induite par les virus dépendent toutes deux du récepteur de reconnaissance de motifs moléculaires RIG-I. Nous avons, par conséquent, investigué le rôle de RIG-I dans l'apoptose qui a lieu dans les cellules infectées par LCMV lorsqu'on les surinfecte avec un autre virus pro-apoptotique. En particulier, l'apoptose mitochondriale induite par les surinfections s'est révélée indépendante de RIG-I et MDA5, mais dépendante de MAVS dans les cellules précédemment infectées par LCMV. Notre étude démontre ainsi l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel les arénavirus altèrent la cascade de signalisation pro-apoptotique de la cellule hôte. Il est possible que les arénavirus aient développé une stratégie permettant de maintenir fonctionnelle cette branche de la défense antivirale innée en l'absence de réponse IFN de type I. En conclusion, ces résultats nous amènent à mieux comprendre l'interaction des arénavirus avec l'immunité innée de la cellule hôte, ce qui contribue aussi à améliorer notre connaissance des propriétés pathogéniques de ces virus. Une meilleure compréhension des facteurs de virulence des arénavirus permet, d'une part, le développement de vaccins et peut, d'autre part, servir de base pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques utilisées dans le traitement des infections à arénavirus.

TLR3 and Rig-like receptor on myeloid dendritic cells and Rig-like receptor on human NK cells are both mandatory for production of IFN-gamma in response to double-stranded RNA.

Cross-talk between NK cells and dendritic cells (DCs) is critical for the potent therapeutic response to dsRNA, but the receptors involved remained controversial. We show in this paper that two dsRNAs, polyadenylic-polyuridylic acid and polyinosinic-polycytidylic acid [poly(I:C)], similarly engaged human TLR3, whereas only poly(I:C) triggered human RIG-I and MDA5. Both dsRNA enhanced NK cell activation within PBMCs but only poly(I:C) induced IFN-gamma. Although myeloid DCs (mDCs) were required for NK cell activation, induction of cytolytic potential and IFN-gamma production did not require contact with mDCs but was dependent on type I IFN and IL-12, respectively. Poly(I:C) but not polyadenylic-polyuridylic acid synergized with mDC-derived IL-12 for IFN-gamma production by acting directly on NK cells. Finally, the requirement of both TLR3 and Rig-like receptor (RLR) on mDCs and RLRs but not TLR3 on NK cells for IFN-gamma production was demonstrated using TLR3- and Cardif-deficient mice and human RIG-I-specific activator. Thus, we report the requirement of cotriggering TLR3 and RLR on mDCs and RLRs on NK cells for a pathogen product to induce potent innate cell activation.

Mécanismes de subversion de l'immunité innée par le virus de l'Hépatite C (VHC)

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

L’étude de l’impact des protéines non structurales NS1 et NS2 du virus respiratoire syncitial sur la réponse immunitaire innée

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase.

Canine keratinocytes upregulate type I interferons and proinflammatory cytokines in response to poly(dA:dT) but not to canine papillomavirus.

Papillomaviruses (PV) are double stranded (ds) DNA viruses that infect epithelial cells within the skin or mucosa, most often causing benign neoplasms that spontaneously regress. The immune system plays a key role in the defense against PVs. Since these viruses infect keratinocytes, we wanted to investigate the role of the keratinocyte in initiating an immune response to canine papillomavirus-2 (CPV-2) in the dog. Keratinocytes express a variety of pattern recognition receptors (PRR) to distinguish different cutaneous pathogens and initiate an immune response. We examined the mRNA expression patterns for several recently described cytosolic nucleic acid sensing PRRs in canine monolayer keratinocyte cultures using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. Unstimulated normal cells were found to express mRNA for melanoma differentiation associated gene 5 (MDA5), retinoic acid-inducible gene I (RIG-I), DNA-dependent activation of interferon regulatory factors, leucine rich repeat flightless interacting protein 1, and interferon inducible gene 16 (IFI16), as well as their adaptor molecules myeloid differentiation primary response gene 88, interferon-β promoter stimulator 1, and endoplasmic reticulum-resident transmembrane protein stimulator of interferon genes. When stimulated with synthetic dsDNA [poly(dA:dT)] or dsRNA [poly(I:C)], keratinocytes responded with increased mRNA expression levels for interleukin-6, tumor necrosis factor-α, interferon-β, RIG-I, IFI16, and MDA5. There was no detectable increase in mRNA expression, however, in keratinocytes infected with CPV-2. Furthermore, CPV-2-infected keratinocytes stimulated with poly(dA:dT) and poly(I:C) showed similar mRNA expression levels for these gene products when compared with expression levels in uninfected cells. These results suggest that although canine keratinocytes contain functional PRRs that can recognize and respond to dsDNA and dsRNA ligands, they do not appear to recognize or initiate a similar response to CPV-2.