Étude de l'activité spontanée dans la moëlle épinière de l'oppossum Monodelphis domestica en développement

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Développement d'une méthode de marquage protéique par fluorescence

Le marquage protéique par fluorescence est une méthode de choix permettant d’étudier l’évolution des protéines depuis leur synthèse cellulaire jusqu’à leur dégradation, en plus de rendre possible leur localisation ainsi que la visualisation des interactions entre protéines. De cet intérêt certain ont découlé différentes techniques de marquage, dont celle présentement développée dans le groupe Keillor. Le principe de celle-ci repose sur la réaction entre deux maléimides portés par un fluorogène et une séquence peptidique cible, laquelle contient deux résidus cystéines séparés par une distance appropriée. Suite à cette double addition de thiols du peptide sur les maléimides du fluorogène, la fluorescence latente de ce dernier est régénérée, menant au marquage covalent de la protéine d’intérêt. Afin d’optimiser la spécificité et la sensibilité de cette méthode de marquage, la synthèse de nouveaux fluorogènes et l’étude de l’efficacité de quench de la fluorescence par les maléimides est présentement en cours dans les laboratoires du groupe Keillor.

Réponse cellulaire pan-spécifique : analyse de la présentation d’antigènes conservés du virus de l’influenza

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza.

Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnels

Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements. Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par spectroscopie RMN.

La cornée humaine, un modèle évitant la transformation tumorale induite par les rayons ultraviolets : étude comparant la fréquence d’induction de dommages à l’ADN, leur l’efficacité de réparation ainsi que la sensibilité à la mort cellulaire induite par les rayons ultraviolets entre la cornée et l’épiderme

Bien qu’ils soient exposés tous deux aux rayons ultraviolets (UVR) solaires, cette exposition génotoxique n’entraîne pas les mêmes conséquences dans l’oeil et la peau. Le rôle des rayons UV dans l’induction et la progression des cancers cutanés est bien démontré. Ces rayons génotoxiques sont absorbés par l’ADN. Ils y induisent ainsi des changements conformationnels pouvant mener à la formation de différents dommages. On retrouve de façon prédominante la liaison de pyrimidines adjacentes en dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ceux-ci causent les mutations signatures responsables des cancers de la peau induits par les UVR. Cependant, aucune évidence ne démontre l’existence de cancer induit par les UVR dans la cornée. Nous avons donc tenté de découvrir les mécanismes permettant à la cornée d’éviter la transformation tumorale induite par les UVR. L’irradiation d’yeux de lapins aux rayons UVB a permis de prouver la capacité de ces rayons à induire la formation de CPD, et ce, de la cornée jusqu’au cristallin. Par la suite, l’irradiation d’yeux humains aux trois types de rayons UV (UVA, B et C) a permis d’y établir leur patron d’induction de CPD. Nous avons ainsi démontré que l’épithélium cornéen est particulièrement sensible à l’induction de CPD, tous types de rayons UV confondus. Enfin, la comparaison de la quantité de dommages présents dans des échantillons de peaux et de cornées irradiées à la même dose d’UVB a permis de démontrer que l’épithélium cornéen est 3.4 fois plus sensible à l’induction de CPD que l’épiderme. Nous avons par la suite étudié les mécanismes de réponse à ce stress. L’analyse de la viabilité cellulaire à la suite d’irradiations à différentes doses d’UVB a révélé que les cellules de la cornée et de la peau ont la même sensibilité à la mort cellulaire induite par les UVR. Nous avons alors analysé la vitesse de réparation des dommages induits par les UVR. Nos résultats démontrent que les CPD sont réparés 4 fois plus rapidement dans les cellules de la cornée que de la peau. L’analyse des protéines de reconnaissance des dommages a révélé que les cellules de la cornée possèdent plus de protéines DDB2 que les cellules de la peau, et ce, surtout liées à la chromatine. Nous avons alors tenté d’identifier la cause de cette accumulation. Nos analyses révèlent que la cornée possède une moins grande quantité d’ARNm DDB2, mais que la demi-vie de la protéine y est plus longue. Enfin, nos résultats suggèrent que l’accumulation de DDB2 dans les cellules de la cornée est entre autres due à une demi-vie plus longue de la protéine. Cette forte présence de DDB2 dans les cellules de la cornée permettrait un meilleur balayage de l’ADN, faciliterait de ce fait la détection de CPD ainsi que leur réparation et contribuerait donc à la capacité de la cornée à éviter la transformation tumorale induite par les UVR.

Development of metabolic labeling strategies to study changes in protein expression

Résumé : Les progrès techniques de la spectrométrie de masse (MS) ont contribué au récent développement de la protéomique. Cette technique peut actuellement détecter, identifier et quantifier des milliers de protéines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complète des modifications du protéome corrélées à des phénomènes biologiques. Notre objectif était le développement d'une nouvelle stratégie pour la détection spécifique et la quantification des variations du protéome, basée sur la mesure de la synthèse des protéines plutôt que sur celle de la quantité de protéines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage pulsé des protéines par des isotopes stables avec une méthode d'acquisition MS basée sur le balayage des ions précurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de détecter spécifiquement les protéines ayant intégré les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protéines non marquées. Une telle approche peut identifier les protéines avec les plus hauts taux de synthèse dans une période de temps donnée, y compris les protéines dont l'expression augmente spécifiquement suite à un événement précis. Nous avons tout d'abord testé différents acides aminés marqués en combinaison avec des méthodes PIS spécifiques. Ces essais ont permis la détection spécifique des protéines marquées. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromètre de masse utilisé pour les méthodes PIS, la sensibilité de cette approche s'est révélée être inférieure à une analyse non ciblée réalisée sur un instrument plus récent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse différentielle de deux milieux de culture conditionnés par des cellules cancéreuses humaines, nous avons utilisé le marquage métabolique pour distinguer les protéines d'origine cellulaire des protéines non marquées du sérum présentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Parallèlement, nous avons développé une nouvelle méthode de quantification nommée IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides aminés capables de produire des ions spécifiques qui peuvent être utilisés pour la quantification relative. La méthode IBIS a été appliquée à l'analyse de deux lignées cellulaires cancéreuses complètement marquées, mais de manière différenciée, par des paires d'acides aminés (Chapitre 2.3). Ensuite, conformément à l'objectif initial de cette thèse, nous avons utilisé une variante pulsée de l'IBIS pour détecter des modifications du protéome dans des cellules HeLa infectée par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus réprime la synthèse des protéines des cellules hôtes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prévu, de hauts taux de synthèse ont été mesurés pour les protéines virales détectées, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifié un certain nombre de protéines humaines dont le rapport de synthèse et de dégradation (S/D) a été modifié par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratégies utilisées par les virus pour détourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montré dans ce travail que le marquage métabolique peut être employé de façon non conventionnelle pour étudier des dimensions peu explorées en protéomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteomé variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.

Essai sur l'emprisonnement cellulaire en France et a L'étranger

UANL

Étude des mécanismes moléculaires menant à la migration cellulaire associée à Rac1 et ARF6.

Le facteur de l’ADP-ribosylation 6 (ARF6) et Rac1 sont des petites protéines liant le GTP qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant le trafic de vésicules, la modification des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ARF6 et Rac1 agissent de concert afin de contrôler ces différents processus cellulaires restent méconnus. Dans cette étude, nous montrons que, dans les cellules HEK293, ARF6 et Rac1 sont retrouvées en complexe suite à la stimulation du récepteur à l’angiotensine. Des expériences réalisées in vitro nous indiquent que ces deux GTPases interagissent ensemble directement, et que ARF6 s’associe préférentiellement avec la forme inactive de Rac1. L’inhibition de l’expression de ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée en cellule de Rac1 via le facteur PIX, indépendamment de la stimulation d’un récepteur, ce qui provoque la migration non contrôlée des cellules. Les arrestines, protéines de régulation de la désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G, servent de protéines d’échafaudage pour Rac1 et ARF6, en interagissant directement avec les GTPases et en augmentant leur association stimulée par l’angiotensine. De plus, les arrestines permettent l’activation, en s’en dissociant, de la MAP Kinase p38 qui régule l’activité de ARF6 et son interaction précoce avec les arrestines. Mis ensemble, ces résultats montrent que les arrestines contrôlent l’activité de ARF6, en influençant p38. ARF6 joue un rôle inhibiteur sur l’activation basale de Rac1 pour permettre ensuite son recrutement et son activation dépendante de l’angiotensine. Cette étude nous a permis de préciser le mode de régulation mis en jeu dans l’initiation de la migration cellulaire, suite à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Par le fait même, nous avons identifié certains des acteurs impliqués dans ce processus, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement des déséquilibres pathophysiologiques de la migration cellulaire.

Substance P, récepteurs NK1 et neurones à sérotonine : relations anatomiques et fonctionnelles dans le noyau raphe dorsalis

Nous avons étudié les relations anatomiques entre les systèmes de neurotransmission à substance P (SP) et à sérotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) dans le noyau du raphé dorsal (NRD) du rongeur, afin de mieux comprendre les interactions entre ces systèmes durant la régulation de l’humeur. Le NRD reçoit une innervation SP provenant de l’habenula, et le blocage pharmacologique des récepteurs neurokinine-1 (rNK1) de la SP aurait des effets antidépresseurs. Chez le rongeur, le traitement par les antagonistes des rNK1 s’accompagne d’une désensibilisation des autorécepteurs 5-HT1A de la 5-HT et d’une hausse de l’activité des neurones 5-HT dans le NRD, suggérant des interactions locales entre ces deux systèmes. Dans un premier temps, nous avons démontré par doubles marquages immunocytochimiques en microscopies optique, confocale et électronique, la présence du rNK1 dans une sous-population de neurones 5-HT du NRD caudal. Lors de l’analyse en microscopie électronique, nous avons pu constater que les rNK1 étaient principalement cytoplasmiques dans les neurones 5-HT et membranaires sur les neurones non 5-HT du noyau. Grâce à d’autres doubles marquages, nous avons aussi pu identifier les neurones non-5-HT porteurs de rNK1 comme étant GABAergiques. Nous avons ensuite combiné l’immunomarquage de la SP avec celui du rNK1, dans le but d’examiner les relations entre les terminaisons (varicosités *) axonales SP et les neurones 5-HT (pourvus de rNK1 cytoplasmiques du NRD caudal. En simple marquage de la SP, nous avons pu estimer à 41% la fréquence avec laquelle les terminaisons SP font synapse. Dans le matériel doublement marqué pour la SP et son récepteur, les terminaisons SP ont été fréquemment retrouvées en contact direct ou à proximité des dendrites munies de rNK1 cytoplasmiques, mais toujours éloignées des dendrites à rNK1 membranaires. Pour tester l’hypothèse d’une internalisation soutenue des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT, nous avons ensuite examiné la localisation subcellulaire du récepteur chez le rat traité avec un antagoniste du rNK1, le RP67580. La densité du marquage des rNK1 a été mesurée dans le cytoplasme et sur la membrane des deux types de dendrites (5-HT: rNK1 cytoplasmiques; non 5-HT: rNK1 membranaires). Une heure après une injection unique de l’antagoniste, la distribution du rNK1 est apparue inchangée dans les deux types de neurones (5-HT et non 5-HT). Par contre, après un traitement quotidien de 7 ou 21 jours avec l’antagoniste, nous avons mesuré une augmentation significative des densités cytoplasmique et membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans aucun changement dans les neurones non 5-HT. Ces traitements ont aussi augmenté l’expression du gène rNK1 dans le NRD. Enfin, nous avons mesuré une hausse de la densité membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans hausse de densité cytoplasmique, par suite d’une lésion bilatérale de l’habenula. Ces résultats confortent l’hypothèse d’une activation et d’une internalisation soutenues des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT du NRD caudal. Ils suggèrent aussi que le trafic des rNK1 dans les neurones 5-HT du NRD représente un mécanisme cellulaire en contrôle de l’activation du système 5-HT par les afférences SP en provenance de l’habenula.

Caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP et cartographie des épitopes du génotype 3a lors de l’infection au virus de l’hépatite C

L’interféron-α pegylé en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuvé pour le traitement de l’infection au virus de l’hépatite C (VHC). L’efficacité est de 50-75%, la thérapie est coûteuse et induit beaucoup d’effets secondaires. Il est impératif d’avoir une meilleure compréhension de la pathogenèse du VHC afin de développer des traitements plus efficaces ou un vaccin. À cette fin, notre approche est de caractériser la réponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigène nouveau et conservé chez le VHC, et de cartographier les épitopes de la réponse immunitaire cellulaire d’un patient infecté au génotype 3a ayant résolu spontanément. Le génotype 3a, étant prévalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu d’épitopes furent identifiés auparavant pour ce génotype, ce qui rend l’étude de la réponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette étude, pour la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP, nous n’avons pas observé de différence significative entre les patients ayant résolu spontanément comparativement avec ceux ayant développé une infection persistante. Ceci suggère fortement que ARFP ne joue pas un rôle majeur lors de la résolution de l’infection aigue au VHC. Pour la caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire chez un des patients infectés au génotype 3a, nous avons identifié et caractérisé 5 épitopes spécifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons comparé avec ceux connus pour le génotype 1a. Nous avons identifié 4 nouveaux épitopes. Enfin, l’épitope NS4b1759-1776, identifié auparavant, pourrait s’avérer être un candidat intéressant dans la mise au point d’un vaccin à base de peptides immunogéniques contre le VHC.

Implication de l'endosome de recyclage dans la migration cellulaire in vivo

Au cours de l’ovogenèse chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appelées cellules de bord, migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Cet événement, nécessitant la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM), la réorientation, puis l’arrêt, ressemble à la formation de métastases. L’endocytose est un régulateur clé de plusieurs événements polarisés, y compris la migration cellulaire. En effet, différentes protéines impliquées dans la migration, comme les intégrines et les E-cadhérines (cadhérines épithéliales), sont régulées par transport à travers les endosomes. De même, l’endocytose restreint au front de migration l’activité des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mécanismes moléculaires de cette restriction spatiale de l’activité des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons testé l’implication du trafic vésiculaire à travers la machinerie d’endocytose, dans la migration dirigée des cellules de bord, car ce système est facilement accessible pour l’expression de protéines et l’analyse de mutants. Nous avons commencé par confirmer une observation précédente du rôle de l’endosome précoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifié l’endosome de recyclage (ER) comme un régulateur clé de cette migration. En effet, nous avons démontré que l’expression dans les cellules de bord d’une forme dominante négative de Rab11, la petite GTPase régulant le transport vésiculaire à travers l’ER, bloque la migration ou entraîne de sévères défauts de migration dans environ 80% des chambres d’œufs examinées. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de l’activité des RTKs alors que d’autres protéines de migration ne sont pas affectées par Rab11 dominant négatif. Ce résultat a été par la suite confirmé par une interaction génétique entre Rab11 et les RTKs. D’autre part, nous avons montré que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqué dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouvé par microscopie confocale en tissu fixé et par microscopie en temps réel que Sec15, un composant de ce complexe, est polarisé, de façon Rab11- dépendante, dans des vésicules qui s’accumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de l’activité de Sec15 perturbe à son tour la migration. Ainsi, toutes ces données démontrent le rôle fondamental d’un cycle d’endo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.