Ser88 phosphorylation regulates dynein light chain 1 (DLC1) function in the mouse mammary gland

Dynein light chain 1 (DLC1) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein which might have critical cellular function as total loss of DLC1 caused Drosophila embryonic death. Despite many proteins and RNAs interaction with it identified, DLC1's function(s) and regulation are largely unknown. Recently, DLC1 was identified as a physiological substrate of P21-activate kinase 1(Pak1) kinase from a human mammary cDNA library in a yeast-2-hybridization screening assay. Studies in primary human tumors and cell culture implicated that DLC1 could promote mammary cancerous phenotypes, and more importantly, Ser88 phosphorylation of DLC1by Pak1 kinase was found to be essential for DLC1's tumorigenic activities. Based on the above tissue culture studies, we hypothesized that Ser88 phosphorylation regulates DLC1. ^ To test this hypothesis, we generated two transgenic mouse models: MMTV-DLC1 and MMTV-DLC1-S88A mice with mammary specific expression of the DLC1 and DLC1-S88A cDNAs. Both of the transgenic mice mammary glands showed rare tumor incidence which indicated DLC1 alone may not be sufficient for tumorigenesis in vivo. However, these mice showed a significant alteration of mammary development. Mammary glands from the MMTV-DLC1 mice had hyperbranching and alveolar hyperplasia, with elevated cell proliferation. Intriguingly, these phenotypes were not seen in the mammary glands from the MMTV-S88A mice. Furthermore, while MMTV-DLC1 glands were normal during involution, MMTV-S88A mice showed accelerated mammary involution with increase apoptosis and altered expression of involution-associated genes. Further analysis of the MMTV-S88A glands showed they had increased steady state level of Bim protein which might be responsible for the early involution. Finally, our in vitro data showed that Ser88 phosphorylation abolished DLC1 dimer and consequently might disturb its interaction with Bim and destabilize Bim. ^ Collectively, our findings provided in vivo evidence that Ser88 phosphorylation of DLC1 can regulate DLC1's function. In addition, Ser88 phosphorylation might be critical for DLC1 dimer-monomer transition. ^

Tumor slices as a model to evaluate doxorubicin in vitro treatment and expression of trios of genes PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and PRSS11, MTSS1, SMYD2 in canine mammary gland cancer

Background: In women with breast cancer submitted to neoadjuvant chemotherapy based in doxorubicin, tumor expression of groups of three genes (PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and PRSS11, MTSS1, SMYD2) have classified them as responsive or resistant. We have investigated whether expression of these trios of genes could predict mammary carcinoma response in dogs and whether tumor slices, which maintain epithelial-mesenchymal interactions, could be used to evaluate drug response in vitro. Methods: Tumors from 38 dogs were sliced and cultured with or without doxorubicin 1 mu M for 24 h. Tumor cells were counted by two observers to establish a percentage variation in cell number, between slices. Based on these results, a reduction in cell number between treated and control samples >= 21.7%, arbitrarily classified samples, as drug responsive. Tumor expression of PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and SMYD2, was evaluated by real time PCR. Relative expression results were then transformed to their natural logarithm values, which were spatially disposed according to the expression of trios of genes, comprising PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and PRSS11, MTSS1, SMYD2. Fisher linear discrimination test was used to generate a separation plane between responsive and non-responsive tumors. Results: Culture of tumor slices for 24 h was feasible. Nine samples were considered responsive and 29 non-responsive to doxorubicin, considering the pre-established cut-off value of cell number reduction = 21.7%, between doxorubicin treated and control samples. Relative gene expression was evaluated and tumor samples were then spatially distributed according to the expression of the trios of genes: PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and PRSS11, MTSS1, SMYD2. A separation plane was generated. However, no clear separation between responsive and non-responsive samples could be observed. Conclusion: Three-dimensional distribution of samples according to the expression of the trios of genes PRSS11, MTSS1, CLPTM1 and PRSS11, MTSS1, SMYD2 could not predict doxorubicin in vitro responsiveness. Short term culture of mammary gland cancer slices may be an interesting model to evaluate chemotherapy activity.

mRNA differential display of 2-amino-1-methyl-6-phenylinlidazo[4,5-b]pyridine-induced rat mammary gland tumors

The mRNA differential display technique was used to compare mRNAs between normal mammary gland and turner-derived epithelial cells from female Sprague-Dawley rat mammary gland tumors induced by the heterocyclic amine 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) and promoted by a high-fat diet (23.5% corn oil). Two genes, beta-casein and transferrin, were identified as differentially expressed. The expression of these genes was examined across a bank of rat mammary gland tumors derived from animals on a low-fat diet (5% corn oil) or the high-fat diet. Carcinomas had over a 10- and 50-fold lower expression of beta-casein and transferrin, respectively than normal mammary gland. In addition, carcinomas from animals on the high-fat diet showed on average a 5-fold higher expression of beta-casein, and transferrin than carcinomas from animals on the low-fat diet. The results indicate the process of mammary gland tumorigenesis alters the expression of certain genes in the mammary gland, and that the level of dietary fat further modulates the expression of these genes.

Characterization of peroxisome proliferator-activated receptor alpha in normal rat mammary gland and 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine-induced mammary gland tumors from rats fed high and low fat diets

Normal Sprague-Dau ley rat mammary gland epithelial cells and mammary gland carcinomas induced by 2-amino-1 -methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine, a carcinogen found in the diet, were examined for the expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR alpha). PPAR alpha mRNA and protein was detected in normal and tumor tissue by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. By quantitative RT-PCR, carcinomas had a 12-fold higher expression than control mammary glands, a statistically significant difference. PPAR alpha expression was examined in carcinomas and normal tissues from rats on high fat (23.5/% corn oil) and low fat (5% corn oil) diets. Although neither carcinomas, nor control tissues showed statistically significant differences between the two diet groups, PPAR alpha expression was the highest in carcinomas from rats on the high fat diet. The expression of PPAR alpha in normal mammary gland and its significant elevation in mammary gland carcinomas raises the possibility of its involvement in mammary gland physiology and pathophysiology. (C) 2000 Published by Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved.

Ataxia telangiectasia mutated (ATM) inhibition transforms human mammary gland epithelial cells.

Carriers of mutations in the cell cycle checkpoint protein kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM), which represent 1-2% of the general population, have an increased risk of breast cancer. However, experimental evidence that ATM deficiency contributes to human breast carcinogenesis is lacking. We report here that in MCF-10A and MCF-12A cells, which are well established normal human mammary gland epithelial cell models, partial or almost complete stable ATM silencing or pharmacological inhibition resulted in cellular transformation, genomic instability, and formation of dysplastic lesions in NOD/SCID mice. These effects did not require the activity of exogenous DNA-damaging agents and were preceded by an unsuspected and striking increase in cell proliferation also observed in primary human mammary gland epithelial cells. Increased proliferation correlated with a dramatic, transient, and proteasome-dependent reduction of p21(WAF1/CIP1) and p27(KIP1) protein levels, whereas little or no effect was observed on p21(WAF1/CIP1) or p27(KIP1) mRNAs. p21(WAF1/CIP1) silencing also increased MCF-10A cell proliferation, thus identifying p21(WAF1/CIP1) down-regulation as a mediator of the proliferative effect of ATM inhibition. Our findings provide the first experimental evidence that ATM is a human breast tumor suppressor. In addition, they mirror the sensitivity of ATM tumor suppressor function and unveil a new mechanism by which ATM might prevent human breast tumorigenesis, namely a direct inhibitory effect on the basal proliferation of normal mammary epithelial cells.

Role of estrogen receptor signaling in mammary gland development

Abstract : Breast cancer incidence rates have increased over the past hundred years, in particular, in Western industrial countries and they continue to rise worldwide. Breast cancer risk has been linked to life exposure to endogenous and exogenous estrogens, and there is increasing concern that exposure to endocrine disruptors which are increasingly accumulating in our environment may also have a role. Using the mouse as model, I have analyzed the physiological role of estrogen signaling in mammary gland development. I have shown that estrogen signaling through the estrogen receptor alpha (ERα) in the mammary epithelium is required for ductal morphogenesis during puberty. Moreover, I have demonstrated that estrogens induce proliferation of mammary epithelial cells through a paracrine mechanism. The presence of estrogen signaling is essential cell intrinsically via ERα or ERβ for the terminal differentiation into milk secreting cells during pregnancy. Furthermore, I have examined how perinatal exposure to the estrogenic plasticizer bisphenol A (BPA) found ubiquitously in consumer goods such as baby bottles formula and beverage containers affects the normal mammary gland development and possibly predispose the mammary gland to tumorigenesis. I have found that C57b16 mice that were exposed, via their drinking water, to several BPA doses ranging from 0.025µg/kg/day to 250µg/kg/day exhibits delayed terminal end bud formation and consequently the ductal outgrowth. Later in life, the mice that were exposed in utero to BPA displayed an increased number of mammary epithelial cells. Acute exposure of 3-week-old mice to BPA can alter gene expression levels of an important estrogen target gene, amphiregulin. Taken together these data are compatible with a scenario in which perinatal BPA exposure may alter mammary gland development by affecting developmental signaling pathways. Résumé : Les taux d'incidence des cancers du sein ont augmenté au cours des cent dernières années en particulier dans les pays industriels occidentaux et ils continuent d'augmenter dans le monde entier. Le risque du cancer du sein a été corrélé à l'exposition au cours de la vie aux oestrogènes endogènes et exogènes. Il y a une préoccupation croissante concernant l'exposition aux perturbateurs endocriniens qui ne cessent de s'accumulent dans notre environnement et qui peuvent également avoir un rôle dans l'augmentation des cancers du sein. En utilisant le modèle de souris, j'ai analysé le rôle physiologique de la voie de signalisation à l'oestrogène dans le développement mammaire. J'ai prouvé que l'oestrogène par l'intermédiaire de son récepteur alpha (ERα) est indispensable dans l'épithélium pour la morphogénèse du système canalaire pendant la puberté. De plus, j'ai démontré que les oestrogènes induisent la prolifération des cellules épithéliales mammaires par un mécanisme paracrine. La présence de la voie de signalisation à l'oestrogène est essentielle de manière intrinsèque à la cellule par l'intermédiaire d'ERα ou ERβ pour la différentiation terminale des cellules épithéliales en cellules sécrétrices de lait pendant la grossesse. En outre, j'ai examiné comment l'exposition périnatale au bisphénol A (BPA), un plastifiant présentant des propriétés ostrogéniques et omniprésent dans divers produits d'usage courant tels que les biberons des bébés et les récipients en plastique, affecte le développement de la glande mammaire et prédispose probablement celle-ci à la tumorigénèse. J'ai constaté que l'exposition périnatale à BPA retarde la formation des bourgeons terminaux et par conséquent la croissance du système canalaire. Plus tard dans la vie, les souris qui ont été exposées dans l'utérus au BPA ont montré un plus grand nombre de cellules épithéliales mammaires. L'exposition aiguë de souris âgées de 3 semaines au BPA perturbe le niveau d'expression d'un gène cible important de l'oestrogène, l'amphiregulin. Ces données sont compatibles avec un scénario dans lequel l'exposition périnatale au BPA peut changer le développement de la glande mammaire en affectant des voies de signalisation développementales.

Gastric outlet obstruction by Brunner's gland hyperplasia in an 8-year-old child.

Several cases of Brunner's gland hyperplasia causing hemorrhage, obstruction, or intussusception have been published in the adult literature. Similar cases in the pediatric population are very rare and have only been described twice, always associated with chronic renal failure. We report the third and youngest case of gastric outlet obstruction because of Brunner's gland hyperplasia focusing on histopathologic condition and treatment based on a review of the literature.

Role of notch signalling in mammary gland

ÁBSTRACT : Mammary gland is composed of two main epithelial cell types, myoepithelial and luminal. The mechanisms involved in determination and maintenance of them remain poorly understood. Notch signaling is known to regulate cell fate determination in other tissues like skin and nervous system. It was also shown that it can act as tumor suppressor or oncogene depending on the tissue type. The mouse models overexpressing active Notch receptors indicated that Notch signaling is oncogenic in the mammary gland. This observation was followed by some descriptive and functional studies in human breast cancer and it was reported that Notch signaling activity or expression of its components are increased in some of the breast tumor samples compared to normal tissue. However, the physiological role of the Notch signaling and its downstream mechanisms in mammary gland is poorly defined. p63, a member of p53 family, has been implicated in the cell fate determination of keratinocytes. Knockout mouse models revealed that p63 is required for the formation of the mammary anlagen in embryo and its ΔN isoform is expressed exclusively in the myoepithelial layer of the adult breast. In order to understand its function in normal breast epithelial cells, I activated Notch signaling by expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in normal primary human breast epithelial cells (HBECs). In this context, NICD reduced growth of HBECs and led to downmodulation of extracellular matrix-receptor interaction network (ECM) components as well as ΔNp63. Expression of ΔNp63 together with NICD partially rescued Notch induced growth reduction, which was correlated with an increase in ECM components. Moreover, silencing ΔNp63 in myoepithelial HBECs reduced growth similar to Notch activation and it led to downregulation of myoepithelial and upregulation of luminal markers. Complementing this observation, forced expression of ONp63 in luminal HBECs induced myoepithelial phenotype and decreased luminal markers. In vivo, by the analysis of a Notch reporter mouse strain, I showed that Notch is activated during puberty specifically at the sites of ductal morphogenesis, terminal end buds. FAGS analysis revealed that it can be detected in two different populations based on CD24 expression (low (lo) or high (high)): at lower levels in CD24lo, which includes stem/progenitor and myoepithelial cells and higher levels in CD24hi, which contains luminal cells. In parallel with in vitro results, the CD24lo mouse mammary epithelial cells displaying Notch activity have lower levels of p63 expression. Furthermore, deletion of RBPjk, the main mediator of Notch signaling, or the overexpression of ΔNp63 inhibited luminal cell lineage in vivo. Another important point revealed by Notch reporter mouse strain is the simultaneous activation of Notch with estrogen signaling during pubertal development. The expression of FOXA1, the mediator of estrogen receptor (ER) transcriptional activity, is correlated with Notch activation in vivo that it is lower in CD24lo than in CD24hi cells. Moreover, FOXA1 is regulated by NICD in vitro supporting the presence of a link between Notch and ER signaling. Taken together, I report that Notch signaling is involved in luminal cell fate determination and its effects are partially mediated through inhibition of ONp63. Besides, ΔNp63 is required for the maintenance and sufficient for the induction of myoepithelial phenotype in HBECs in vitro and is not compatible with luminal lineage in vivo. Based on these results, I propose a model for epithelial cell hierarchy in mammary gland, whereby there are two different types of luminal progenitors, early and late, displaying different levels of Notch activity. Notch signaling contributes to the determination of luminal cell lineage in these two progenitor steps: In "Early Luminal Progenitor" stage, it inhibits myoepithelial fate by decreasing p63 expression, and in "Late Luminal Progenitor" stage, Notch signaling is involved in induction of luminal lineage by acting on ER-FOXA1 axis. It has to be investigated further whether Notch signaling might behave as an oncogene or tumor suppressor depending on which cell type in the epithelial hierarchy it is modulated and which one is more likely to occur in different human breast cancer types. RÉSUMÉ : La glande mammaire est composée de deux types principaux de cellules: les cellules luminales, qui bordent le lumen et les cellules myoépithéliales, qui se trouvent entre la lame basale et les cellules luminales. Les mécanismes intervenant dans leur différenciation et leur maintenance demeurent encore mal compris. La protéine transmembranaire Notch est connue pour déterminer le destin des cellules dans plusieurs types de tissus comme la peau ou le système nerveux. Selon le type de tissu dans lequel se trouve Notch, il agira soit comme un suppresseur de tumeur soit comme un oncogène. A l'aide de modèles de souris surexprimant les récepteurs actifs de Notch, il a été démontré que la voie de signalisation de Notch est oncogénique au niveau de la glande mammaire. Des études descriptives et fonctionnelles dans le cadre du cancer du sein ont permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité de Notch ou de l'expression de ces composants dans certains tissus cancéreux. Toutefois, le rôle physiologique de Notch et des mécanismes qu'il active restent méconnus. P63, une protéine membre de la famille p53, est impliquée dans la différenciation des kératinocytes. Le modèle issu de l'étude des souris p63 knockout a révélé que cette protéine est requise pour la formation des primordia mammaires chez l'embryon et que son isoforme ΔNp63 est exclusivement exprimée dans la couche myoépithéliale de la glande mammaire adulte. Dans le but de comprendre les fonctions physiologiques de Notch, je l'ai activé en exprimant le domaine intracellulaire de Notch 1 (NICD) dans des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine (HBECs). Le NICD a alors réduit la croissance des HBECs et conduit à la régulation négative non seulement de p63 mais également des composants du réseau d'interaction des récepteurs de la matrice extracellulaire (ECM). En exprimant conjointement ΔNp63 et NICD, il est apparu que la réduction de croissance induite par Notch était partiellement compensée, et qu'il y avait également une augmentation des composants ECM. De plus, lorsque ΔNp63 a été inactivé dans les cellules HBECs myoépithéliales, une réduction de croissance cellulaire identique à celle provoquée par l'activation de Notch a pu être mise en évidence, de même qu'une régulation négative des marqueurs myoépithéliaux ainsi qu'une augmentation des marqueurs luminaux. Afin de compléter ces informations, l'expression de ΔNp63 a été forcée dans les HBECs luminales, ce qui a induit un phénotype myoépithélial et une diminution des marqueurs lumineux. In vivo, par l'analyse de souris ayant un gène rapporteur de l'activité de Notch, j'ai démontré que Notch est activé pendant la puberté au niveau des sites de la morphogenèse canalaire, à savoir les bourgeons terminaux. Les analyses par FACS (Fluorescence-activated cell sorting) basées sur l'expression de l'antigène CD24 ont révélé qu'il peut tre détecté dans deux populations différentes : une population qui l'exprime faiblement, qui regroupe les cellules souches/progéniteurs et les cellules myoépithéliales, et une population qui l'exprime fortement qui est composé des cellules luminales. Parallèlement aux résultats in vitro, j'ai mis en évidence un faible niveau d'expression de p63 dans les cellules épithéliales de la glande mammaire de souris, exprimant faiblement l'antigène CD24 et présentant une activité de Notch. De plus, la délétion de RBPjr~, médiateur principal de la signalisation de Notch, ainsi que la surexpression de ΔNp63 in vivo ont inhibé la lignée des cellules luminales. Un autre point important révélé par les souris rapporteur de l'activité de Notch a été l'activation simultanée de Notch et de la signalisation de l'oestrogène pendant le développement pubertaire. L'expression de FOXA1, médiateur de l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux oestrogènes (ER), est en corrélation avec l'activation de Notch in vivo, plus basse dans les cellules avec une faible expression de l'antigène CD24 que dans celles avec une forte expression. De plus, FOXA1 est régulé par NICD in vitro confirmant la présence d'un lien entre Notch et la signalisation des ER. En résumé, la signalisation de Notch est impliquée dans la détermination du destin cellulaire des cellules luminales et ses effets sont partiellement modifiés par l'inhibition de ΔNp63. ΔNp63 est requis pour la maintenance et est suffisant pour l'induction du phénotype myoépithéliale dans les HBECs in vitro et ne peut donc pas se trouver dans les cellules luminales in vivo. Basé sur ces résultats, je propose un modèle de hiérarchisation des cellules épithéliales de la glande mammaire, dans lequel sont présents deux types de progéniteurs des cellules luminales exprimant des niveaux différents d'activité de Notch, les progéniteurs lumineux précoces et tardifs. La signalisation de Notch contribue à la différenciation de la lignée cellulaire luminale au niveau de ces deux progéniteurs : dans la forme précoce, il inhibe la différenciation des cellules myoépithéliales en réduisant l'expression de p63 et dans la forme tardive, Notch est impliqué dans l'induction de la lignée luminale en agissant sur l'axe ER-FOXA1. Il serait nécessaire d'investiguer plus loin si le fait que Notch agisse comme oncogène ou suppresseur de tumeur dépend du stade de différenciation de la cellule dans laquelle il est modulé et laquelle de ces deux fonctions il est le plus probable de rencontrer dans les différents types de cancer du sein.

Characterization of the effect of mammary gland irridiation on experimental brest cancer progression and analysis of the implicated mechanisms

SUMMARY Radiotherapy is commonly and efficiently used to treat solid cancer in the clinic. Experimental evidence however suggests that radiation can promote tumor progression by inducing chronic modifications of the tumor microenvironment. Clinically, these observations are highly relevant to aggressive tumoral lesions relapsing after radiation therapy, a leading cause of patients' death. The investigation and understanding of the biological mechanisms implicated in the malignant progression of post-radiation relapses are therefore of major importance. Here we used a syngeneic (immunocompetent) breast cancer orthotopic xenograft model, to show that local irradiation of the mammary gland promotes the appearance of an invasive and metastatic tumor phenotype. Previous studies in our laboratory revealed that inhibition of tumor-induced angiogenesis and consequent increase in tumor hypoxia promotes metastasis formation through the activation of pro-invasive programs in the tumor cells. Our results extend these observations suggesting that mammary gland irradiation induces the recruitment of CD11b+ cells to both the primary tumor and the lungs at pre-metastatic stages through the hypoxia-dependent induction of Kit-ligand (KITL) expression in primary tumors. Abrogation of KITL expression in tumor cells prevented CD11 b+ cells accumulation in both the primary tumor and lungs and significantly reduced metastases of tumors growing in irradiated mammary gland. Importantly, irradiated mammary gland enhanced tumor-induced mobilization of circulating CD11b+cKit+ myelomonocytic cells through a HIF1- and KITL-dependent process. By cell transfer experiments, mobilized circulating CD11b+cKit+ cells were shown to supply both tumor- and lungs infiltrating CD11b+ cells. Using a blocking antibody against cKit (the KITL receptor), the mobilization of CD11b+cKit+ ceils was prevented as well as lung metastases derived from tumors growing in irradiated mammary gland. Taken together, these results indicate that tumors growing in a pre-irradiated mammary gland partially promote their malignant progression through the distant mobilization of circulating myelomonocytic precursor cells. They identify KITL inhibition and/or cKit receptor neutralization as potentially promising therapeutic approaches for post-radiation relapses. RESUME La radiothérapie est largement utilisée comme traitement de choix de nombreux types de cancers. L'agressivité des récidives tumorales observée en clinique après radiothérapie suggère cependant que le recours à l'irradiation pourrait dans certains cas accélérer la progression tumorale. De récents travaux expérimentaux ont en effet permis d'appuyer cette hypothèse, en montrant notamment l'effet néfaste des modifications chroniques de l'environnement induites par l'irradiation sur la progression tumorale. A l'aide d'un modèle murin syngénique orthotopique de cancer de sein, nous avons pu montrer que l'irradiation locale de la glande mammaire facilite l'invasion et la dissémination métastatique des cellules tumorales en favorisant le recrutement de cellules myéloïdes CD11 b+ vers la tumeur primaire et les poumons à un stade pré-métastatique. Comme mécanisme impliqué dans le recrutement des cellules CD11b+, nous avons pu observer après irradiation locale de la glande mammaire une expression augmentée de Kit-ligand (KITL) dans la tumeur (induite par l'hypoxie) ainsi que la mobilisation de cellules myéloïdes circulantes exprimant le récepteur cKit et précurseurs des cellules CD11b+ infiltrant la tumeur et les poumons. En empêchant la mobilisation par la tumeur de cellules circulantes cKit+ par des approches à la fois génétique et pharmacologique nous avons pu prévenir l'accumulation de cellules myéloïdes CD11 b+ dans la tumeur primaire et les poumons ainsi que la dissémination métastatique induites par' l'irradiation de la glande mammaire. De façon générale, ces résultats montrent que la progression agressive des tumeurs qui se développent dans un environnement irradié repose à la fois sur l'expression tumorale de KITL et la mobilisation de cellules myéloïdes précurseurs cKit*. Ils auront permis d'identifier KITL et/ou cKit comme des cibles thérapeutiques potentielles intéressantes pour le traitement des récidives tumorales après radiothérapie.

Two distinct mechanisms underlie progesterone-induced proliferation in the mammary gland.

The mouse mammary gland develops postnatally under the control of female reproductive hormones. Estrogens and progesterone trigger morphogenesis by poorly understood mechanisms acting on a subset of mammary epithelial cells (MECs) that express their cognate receptors, estrogen receptor alpha (ERalpha) and progesterone receptor (PR). Here, we show that in the adult female, progesterone drives proliferation of MECs in two waves. The first, small wave, encompasses PR(+) cells and requires cyclin D1, the second, large wave, comprises mostly PR(-) cells and relies on the tumor necrosis factor (TNF) family member, receptor activator of NF-kappaB-ligand (RANKL). RANKL elicits proliferation by a paracrine mechanism. Ablation of RANKL in the mammary epithelium blocks progesterone-induced morphogenesis, and ectopic expression of RANKL in MECs completely rescues the PR(-/-) phenotype. Systemic administration of RANKL triggers proliferation in the absence of PR signaling, and injection of a RANK signaling inhibitor interferes with progesterone-induced proliferation. Thus, progesterone elicits proliferation by a cell-intrinsic and a, more important, paracrine mechanism.

The role of Receptor Activator of NFKB Ligand (RANKL) in mammary gland development

Abstract : The female reproductive hormones estrogen, progesterone and prolactin control postnatal breast development and are important to breast carcinogenesis. The mechanisms by which they elicit proliferation and morphogenesis remain poorly understood. Using the mouse as a model to study the molecular mechanisms through which hormones elicit morphogenetic changes in the mammary gland in vivo, we found the Receptor Activator of NFκB Ligand, a Tumor Necrosis Factor family member, to be strongly induced by progesterone. Recent publications suggested that hormone dependant RANKURANK signals are involved in the terminal differentiation of mammary gland alveolar buds into lobulo-alveolar structures competent for lactation. I show that in the absence of epithelial RANKL a distinct earlier stage of mammary gland development, side branch formation, is blocked. RANKL acts as a major mediator downstream of progesterone; it is required for progesterone-induced paracrine proliferation and completely rescues the mutant phenotype when ectopically expressed in progesterone receptor (PR) KO mammary epithelia. RANKL is not required for cell autonomous division of estrogen receptor alpha (ERa) /PR positive cells. Cyclin D1, previously implicated as a mediator of RANKL, is not affected by ablation of RANKL and is not required for RANKL-induced paracrine proliferation but for the cell autonomous proliferation. Gene expression arrays to find specific RANKL downstream targets have identified Id4, ElfS and one secreted metalloprotease (Adamtsl8) as potential candidates validated by Q-RT-PCR. Interestingly, Id4 and Adamtsl8 are expressed by the myoepithelial cells. Their expression additionally coincides with RANKL mRNA expression at mid pregnancy, possibly implying a functional contribution of both genes to RANKL mediated sidebranch formation. ElfS in contrast, is found to be strongly expressed by the end of pregnancy supporting recent findings of a prolactin mediated regulation. As for RANKL, this gene was in particular induced in luminal cells. Taken together, I report that progesterone is the major proliferative stimulus in the adult mammary gland eliciting proliferation of ERaJPR positive cells by a cell autonomous, cyclin D1-dependent and a paracrine RANKL-dependent mechanism. My work moreover suggests, that RANKL acts as a major orchestrator affecting different downstream mediators, through which progesterone exerts its effects concomitantly on different cellular compartments. Résumé : Les hormones sexuelles telles que l'oestrogène, la progestérone et la prolactine contrôlent le développement postnatal du sein et sont impliquées dans la cazcinogenèse. Les mécanismes par lesquels elles induisent la prolifération et la morphogénèse demeurent incompris. En utilisant la souris comme modèle, J'ai trouvé que le ligand activateur du récepteur de NFκB, une protéine de la famille du facteur de nécrose des tumeurs, peut être fortement induit par la progestérone. Les publications récentes ont suggéré que cette protéine est nécessaire à la fin de la grossesse, quand les cellules sécrétrices du lait apparaissent. Par des techniques de transplantation d'épithélium, je montre contrairement aux études précédentes, qu'en l'absence de RANKL dans l'épithélium une partie distincte du développement mammaire, la formation de branches latérales, est bloquée. La progestérone agit de manière pazacrine par l'intermédiaire de 12ANKL pour induire la prolifération tandis que la mort cellulaire n'est pas affectée. De plus, l'injection d'une protéine recombinante RANKL dans une souris mutante pour le récepteur à la progestérone induit la prolifération des cellules épithéliales en l'absence de grossesse ; la surexpression de RANKL dans ces mêmes mutants mène à une réversion complète du phénotype. Mes expériences démontrent que la progestérone induit deux types distincts de prolifération. Un premier type direct dans laquelle les cellules positives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Cette division cellulaire est alors indépendante de RANKL mais dépendante de la cycline D1. Le second type de prolifération est induit par un mécanisme pazacrine et dépend de RANKL mais pas de la cycline D1. Ici, les cellules négatives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Pour détecter des gènes cibles de la voie de signalisation du RANKL, un profil d'expression des gènes a été généré. Les facteurs de transcription Id4, EIf5 et une métalloprotéase sécrétée (Adamtsl8) ont été identifiés en tant que cibles potentielles. D'autres analyses de validation démontrent qu'Id4, Adamtsl8, RANKL mais pas E1f5 sont fortement exprimés au cours de la grossesse, coïncidant avec la formation de branchements latéraux induit par progestérone. EIf5 s'est avéré être exprimé vers la fin de la grossesse appuyant des résultats récents proposant une régulation par la prolactine. Le système canalaire mammaire se compose de couches cellulaires: une couche interne de cellules luminales et une externe de cellules myoépithéliale. Les expériences génétiques d'expression ont révélé que RANKL. et E1f5 sont exprimés dans la partie luminale tandis qu'Id4 et Adamtsl8 sont dans les cellules myoépithéliales. En conclusion, je prouve que la progestérone est le stimulus principal induisant la prolifération dans la glande mammaire d'adulte. Deux mécanismes de prolifération sont impliqués: l'un direct dépendant de la cycline Dl et l'autre paracrine dépendant de RANKI.. Mon travail suggère par ailleurs que RANKL agit en tant que médiateur important, par lequel la progestérone exerce ses effets sur différents compartiments cellulaires tels que la coordination de la prolifération des cellules épithéliales avec la réorganisation de la matrice extracellulaire et de la membrane basale exigées pour la morphogénèse du système canalaire latéral.

Role of amphiregulin in mammary gland development

Abstract Ovarian hormones are key regulators of postnatal mammary gland development and are linked to breast carcinogenesis. In particular, estrogens induce mammary epithelial cells to proliferate at the onset of puberty, leading to the elongation of the rudimental ductal tree into the fatty stromal tissue. Elucidating the molecular events underlying estrogen mitogenic activity in the mammary gland is of value in understanding how the deregulation of this signalling pathway can lead to breast tumorigenesis. Our lab has recently shown that estrogen induces mammary proliferation via epithelial estrogen receptor alpha (ERα) by a paracrine mechanism. Based on the finding that several EGF receptor (EGFR) ligands are able to substitute for estrogens and that amphiregulin (Areg), one of these ligands, is required during mammary development, we have hypothesized that Areg is a key mediator of estrogen induced paracrine signalling during ductal morphogenesis. Our analysis of the Areg -/- mice mammary phenotype reveals that epithelial Areg is required at the onset of puberty for epithelial proliferation, terminal end bud (TEB) formation and, subsequently, ductal elongation. Hormonal stimulation experiments show that among the EGFR ligands, only Arég is specifically controlled by estrogen at the transcriptional level, via ERα, in the mammary gland. Moreover, Areg is required for the estrogen-induced mammotrophic effects of epithelial proliferation and ductal elongation. We have shown that ectopic Areg expression in ERα -/- mammary epithelial cells is sufficient to induce ductal morphogenesis. Our transplantations experiment show that when Areg -/- cells are in the presence of wt cells they contribute to all aspects of ductal development, suggesting that this growth factor acts in a paracrine fashion. Moreover, this result shows that Areg -/- epithelial cells are not intrinsically impaired in proliferation. Our transplantation experiment carried out under physiological conditions confirmed previous reports showing that stromal EGFR is needed for ductal morphogenesis. This suggests that estrogen-driven Areg signalling involves an epithelium-stroma crosstalk. Thus, these data confirmed our hypothesis of Areg being an important estrogen mediator during ductal morphogenesis. Résumé Les hormones ovariennes, régulatrices clés du développement post-natal de la glande mammaire, sont également liées à la carcinogénèse du sein. En particulier, l'oestrogène induit la division des cellules épithéliales au début de la puberté. Cette prolifération amène à l'élongation du réseau canalaire rudimentaire et permet l'invasion du compartiment stromal. L'élucidation des mécanismes moléculaires responsables de l'activité mitogénique de l'oestrogène dans la glande mammaire est précieuse pour une meilleure compréhension du développement du cancer du sein. Notre laboratoire a récemment démontré que l'cestrogène induit la prolifération des cellules épithéliales par un signal paracrine, grâce au récepteur à l'oestrogène alpha (ERα). En se basant sur le fait que plusieurs ligands du récepteur à l'EGF (EGFR) sont capables de se substituer à l'cestrogène et d'induire la prolifération épithéliale et qu'amphiregulin (Areg), un de ces ligands, est essentielle au développement de la glande mammaire, nous avons émi l'hypothèse que Areg est un médiateur essentiel du signal paracrine induit par l'oestrogène pendant la croissance du système canalaire. Nos analyses phénotypiques des glandes mammaires issues de souris transgéniques Areg -/- démontrent que cette protéine est indispensable à la prolifération des cellules épithéliales mammaires au début de la puberté et à la formation des bourgeons terminaux qui conduisent à l'élongation des canaux. Nos expériences de stimulations hormonales démontrent que, parmi l'ensemble des ligands du EGFR, seule Areg est contrôlée au niveau transcriptionnel par l'cestrogène dans la glande mammaire, ceci via le récepteur ERα. De plus, Areg est essentielle pour le effets mammotrophique induit par l'cestrogène, à savoir la prolifération épithéliál et la croissance du système canalaire. Par ailleurs, l'expression ectopique d'Areg dans des cellules epithéliales mammaires de souris transgéniques ERα -/- est suffisante pour permettre la formation du réseau canalaire. En présence de cellules normales, les cellules dépourvues du gène d'Areg contribuent à la formation des canaux. Cette expérience suggère que ce facteur de croissance agit de manière paracrine. De plus, ce résultat montre que les cellules épithéliales Areg -/- conservent leur potentiel prolifératif. Nos expériences de transplantation, réalisées dans des conditions physiologiques, ont confirmé des précédentes études qui montraient que le récepteur stromal à l'EGF est nécessaire pour la morphogénèse du système canalaire. Ceci suggère que la voie de signalisation activée par l'oestrogène et dépendante d' implique une communication entre l'épithélium et le stroma. Ainsi, ces résultats valident notre hypothèse puisqu'ils confirment Areg en tant que médiateur majeur de l'oestrogène dans la morphogénèse du système canalaire.

Forage preservation (grazing vs. hay) fed to ewes affects the fatty acid profile of milk and CPT1B gene expression in the sheep mammary gland

Background: Alterations in lipid metabolism occur when animals are exposed to different feeding systems. In the last few decades, the characterisation of genes involved in fat metabolism and technological advances have enabled the study of the effect of diet on the milk fatty acid (FA) profile in the mammary gland and aided in the elucidation of the mechanisms of the response to diet. The aim of this study was to evaluate the effect of different forage diets (grazing vs. hay) near the time of ewe parturition on the relationship between the fatty acid profile and gene expression in the mammary gland of the Churra Tensina sheep breed. Results: In this study, the forage type affected the C18:2 cis-9 trans-11 (CLA) and long-chain saturated fatty acid (LCFA) content, with higher percentages during grazing than during hay feeding. This may suggest that these FAs act as regulatory factors for the transcriptional control of the carnitine palmitoyltransferase 1B (CPT1B) gene, which was more highly expressed in the grazing group (GRE). The most highly expressed gene in the mammary gland at the fifth week of lactation is CAAT/ enhancer- binding protein beta (CEBPB), possibly due to its role in milk fat synthesis in the mammary gland. More stable housekeeping genes in the ovine mammary gland that would be appropriate for use in gene expression studies were ribosomal protein L19 (RPL19) and glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH). Conclusions: Small changes in diet, such as the forage preservation (grazing vs. hay), can affect the milk fatty acid profile and the expression of the CPT1B gene, which is associated with the oxidation of fatty acids. When compared to hay fed indoors, grazing fresh low mountain pastures stimulates the milk content of CLA and LCFA via mammary uptake. In this sense, LCFA in milk may be acting as a regulatory factor for transcriptional control of the CPT1B gene, which was more highly expressed in the grazing group.