Análise funcional e potencial biotecnológico do gene DHN11 de macieira (Malus x domestica Borkh.)

A deficiência hídrica é o principal fator limitante à agricultura, causando significativas perdas de produtividade nas mais diversas culturas vegetais. Novas tecnologias agrícolas, tais como a geração de plantas geneticamente modificadas melhor adaptadas a condições adversas de cultivo, são necessárias. Em um estudo anterior do grupo caracterizando a família gênica das desidrinas (DHNs) em macieira (Malus x domestica Borkh.), foi verificado que o gene MdDHN11 possui níveis de expressão cerca de 6 mil vezes maior em sementes em relação a outros tecidos. Sugere-se que o acúmulo nos últimos estágios de desenvolvimento de sementes possua papel protetor na tolerância à dessecação. Além disso, as DHNs são proteínas caracterizadas por seu envolvimento na resposta a mudanças na disponibilidade de água, principalmente os causados por estresses abióticos.

Optimierung von Transformationsprotokollen und Entwicklung von SSR-Markern für das Kolumnarwachstum beim Apfel

Ziel war es, molekularbiologische Untersuchungen zum Kolumnarwachstum des Apfels durchzuführen. Anhand Sequenzdaten des ‘Golden Delicious’ Genoms (Velasco et al. 2010) wurden drei neue SSR Marker entwickelt. Sie konnten bei untersuchten Geisenheimer Nachkommenschaften zuverlässig den Kolumnarwuchs auf DNA-Ebene detektieren. Zusätzlich wurden von Bai et al. (2012) veröffentlichte Marker untersucht. Die von Bai et al. (2012) gefundenen Grenzen des co-Lokus konnten in dieser Arbeit anhand der Geisenheimer Nachkommenschaften nicht bestätigt werden. Die „linke“ Begrenzung der co-Region wird nach Untersuchungen dieser Arbeit am ehesten von dem Marker Mdo.chr10.11 (Moriya et al. 2012) bei 18,757 Mbp definiert. Die „rechte“ Begrenzung der co-Region wird vermutlich von den Markern Co04R13 (Baldi et al. 2012) und C1753-3520 (Bai et al. 2012) bei 18,905 Mbp definiert, wodurch die potentielle co-Region auf 148 kb auf Chromosom 10 eingegrenzt werden könnte. Für Funktionsanalysen möglicher Kandidatengene des co-Gens wurde ein Agrobakterien-vermitteltes Transformationssystem für die Geisenheimer Apfelselektionen ‘A 14’ und ‘Procats 28’ adaptiert. Zusätzlich wurde der bereits in der Literatur als transformierbar beschriebene Genotyp ‘Jonagold’ (Viss et al. 2003) transformiert. Bei Transformationen der Apfelselektion ‘A 14’ gelang es, transgene Zellen an den Explantaten, am Kallusgewebe und an den Regeneraten zu erzeugen. Bei Transformationen von ‘Jonagold’ wurde ein fast vollständig transgenes Regenerat erzeugt.

Genomic and transcriptional analysis of allergen genes in apple (Malus x domestica)

Apple consumption is highly recomended for a healthy diet and is the most important fruit produced in temperate climate regions. Unfortunately, it is also one of the fruit that most ofthen provoks allergy in atopic patients and the only treatment available up to date for these apple allergic patients is the avoidance. Apple allergy is due to the presence of four major classes of allergens: Mal d 1 (PR-10/Bet v 1-like proteins), Mal d 2 (Thaumatine-like proteins), Mal d 3 (Lipid transfer protein) and Mal d 4 (profilin). In this work new advances in the characterization of apple allergen gene families have been reached using a multidisciplinary approach. First of all, a genomic approach was used for the characterization of the allergen gene families of Mal d 1 (task of Chapter 1), Mal d 2 and Mal d 4 (task of Chapter 5). In particular, in Chapter 1 the study of two large contiguos blocks of DNA sequences containing the Mal d 1 gene cluster on LG16 allowed to acquire many new findings on number and orientation of genes in the cluster, their physical distances, their regulatory sequences and the presence of other genes or pseudogenes in this genomic region. Three new members were discovered co-localizing with the other Mal d 1 genes of LG16 suggesting that the complexity of the genetic base of allergenicity will increase with new advances. Many retrotranspon elements were also retrieved in this cluster. Due to the developement of molecular markers on the two sequences, the anchoring of the physical and the genetic map of the region has been successfully achieved. Moreover, in Chapter 5 the existence of other loci for the Thaumatine-like protein family in apple (Mal d 2.03 on LG4 and Mal d 2.02 on LG17) respect the one reported up to now was demonstred for the first time. Also one new locus for profilins (Mal d 4.04) was mapped on LG2, close to the Mal d 4.02 locus, suggesting a cluster organization for this gene family, as is well reported for Mal d 1 family. Secondly, a methodological approach was used to set up an highly specific tool to discriminate and quantify the expression of each Mal d 1 allergen gene (task of Chapter 2). In aprticular, a set of 20 Mal d 1 gene specific primer pairs for the quantitative Real time PCR technique was validated and optimized. As a first application, this tool was used on leaves and fruit tissues of the cultivar Florina in order to identify the Mal d 1 allergen genes that are expressed in different tissues. The differential expression retrieved in this study revealed a tissue-specificity for some Mal d 1 genes: 10/20 Mal d 1 genes were expressed in fruits and, indeed, probably more involved in the allergic reactions; while 17/20 Mal d 1 genes were expressed in leaves challenged with the fungus Venturia inaequalis and therefore probably interesting in the study of the plant defense mechanism. In Chapter 3 the specific expression levels of the 10 Mal d 1 isoallergen genes, found to be expressed in fruits, were studied for the first time in skin and flesh of apples of different genotypes. A complex gene expression profile was obtained due to the high gene-, tissue- and genotype-variability. Despite this, Mal d 1.06A and Mal d 1.07 expression patterns resulted particularly associated with the degree of allergenicity of the different cultivars. They were not the most expressed Mal d 1 genes in apple but here it was hypotized a relevant importance in the determination of allergenicity for both qualitative and quantitative aspects of the Mal d 1 gene expression levels. In Chapter 4 a clear modulation for all the 17 PR-10 genes tested in young leaves of Florina after challenging with the fungus V. inaequalis have been reported but with a peculiar expression profile for each gene. Interestingly, all the Mal d 1 genes resulted up-regulated except Mal d 1.10 that was down-regulated after the challenging with the fungus. The differences in direction, timing and magnitude of induction seem to confirm the hypothesis of a subfunctionalization inside the gene family despite an high sequencce and structure similarity. Moreover, a modulation of PR-10 genes was showed both in compatible (Gala-V. inaequalis) and incompatible (Florina-V. inaequalis) interactions contribute to validate the hypothesis of an indirect role for at least some of these proteins in the induced defense responses. Finally, a certain modulation of PR-10 transcripts retrieved also in leaves treated with water confirm their abilty to respond also to abiotic stress. To conclude, the genomic approach used here allowed to create a comprehensive inventory of all the genes of allergen families, especially in the case of extended gene families like Mal d 1. This knowledge can be considered a basal prerequisite for many further studies. On the other hand, the specific transcriptional approach make it possible to evaluate the Mal d 1 genes behavior on different samples and conditions and therefore, to speculate on their involvement on apple allergenicity process. Considering the double nature of Mal d 1 proteins, as apple allergens and as PR-10 proteins, the gene expression analysis upon the attack of the fungus created the base for unravel the Mal d 1 biological functions. In particular, the knowledge acquired in this work about the PR-10 genes putatively more involved in the specific Malus-V. inaequalis interaction will be helpful, in the future, to drive the apple breeding for hypo-allergenicity genotype without compromise the mechanism of response of the plants to stress conditions. For the future, the survey of the differences in allergenicity among cultivars has to be be thorough including other genotypes and allergic patients in the tests. After this, the allelic diversity analysis with the high and low allergenic cultivars on all the allergen genes, in particular on the ones with transcription levels correlated to allergencity, will provide the genetic background of the low ones. This step from genes to alleles will allow the develop of molecular markers for them that might be used to effectively addressed the apple breeding for hypo-allergenicity. Another important step forward for the study of apple allergens will be the use of a specific proteomic approach since apple allergy is a multifactor-determined disease and only an interdisciplinary and integrated approach can be effective for its prevention and treatment.

Molekulare Analyse des Kolumnar-Gens beim Apfel (Malus x domestica)

Das Kolumnarwachstum beim Apfel (Malus x domestica) geht auf eine in den frühen 1960er Jahren entdeckte Zufallsmutation zurück. Die daraus resultierende Sprossmutante ist von großem wirtschaftlichem Interesse, da diese sehr kompakte Wuchsform unter anderem zu einer enormen Ertragssteigerung durch eine hohe Pflanzdichte der Bäume führt. Das Ziel der Arbeit ist die Entschlüsselung der molekularen Ursache dieser Mutation, die bisher weitgehend ungeklärt ist. Die Analyse wurde durch die Erstellung einer Referenzsequenz der Co-Zielregion einer kolumnaren Apfelsorte sowie durch die Konstruktion eng gekoppelter molekularer Marker realisiert. Durch die Konstruktion von genomischen Apfel-BAC-Bibliotheken mit mehrfacher Genomabdeckung und die Erstellung geeigneter Sonden wurde die Co-Region kloniert und deren Sequenz bestimmt. In Kombination zu dieser klassischen positionellen Klonierungsstrategie wurden genomische Illumina „mate pair“-Bibliotheken erstellt, sequenziert und bioinformatisch analysiert, um die genomische Region vollständig zu annotieren. Somit wurde eine vollständige genomische Referenz der Co-Region einer kolumnaren Apfelsorte erstellt, die die Grundlage für weitere Analysen bildet. Auf Basis dieser Referenz konnte die Co-Mutation in Form der Integration des LTR-Retrotransposons Gypsy-44 im kolumnaren Chromosom an Position 18,79 Mbp auf Chromosom 10 lokalisiert werden. Darüber hinaus konnten Transposon-basierende molekulare Marker erstellt werden, die eine verlässliche Genotypisierung von Apfelbäumen in Bezug auf das Kolumnarwachstum ermöglichen und dies unabhängig von der verwendeten Apfelsorte. Der genaue Wirkmechanismus von Gypsy-44, der zur Ausprägung dieses extremen Phänotyps führt, ist bislang unklar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die molekulare Ursache für das kolumnare Wachstum aufgeklärt werden konnte und zudem die ersten molekularen Marker erstellt wurden, die eine sortenunabhängige Differenzierung zwischen kolumnaren und nicht kolumnaren Apfelbäumen ermöglichen.

Molecular genetic causes of columnar growth in apple (Malus x domestica)

The columnar growth habit of apple is interesting from an economic point of view as the pillar-like trees require little space and labor. Genetic engineering could be used to speed up breeding for columnar trees with high fruit quality and disease resistance. For this purpose, this study dealt with the molecular causes of this interesting phenotype. The original bud sport mutation that led to the columnar growth habit was found to be a novel nested insertion of a Gypsy-44 LTR retrotransposon on chromosome 10 at 18.79 Mb. This subsequently causes tissue-specific differential expression of nearby downstream genes, particularly of a gene encoding a 2OG-Fe(II) oxygenase of unknown function (dmr6-like) that is strongly upregulated in developing aerial tissues of columnar trees. The tissue-specificity of the differential expression suggests involvement of cis-regulatory regions and/or tissue-specific epigenetic markers whose influence on gene expression is altered due to the retrotransposon insertion. This eventually leads to changes in genes associated with stress and defense reactions, cell wall and cell membrane metabolism as well as phytohormone biosynthesis and signaling, which act together to cause the typical phenotype characteristics of columnar trees such as short internodes and the absence of long lateral branches. In future, transformation experiments introducing Gypsy-44 into non-columnar varieties or excising Gypsy-44 from columnar varieties would provide proof for our hypotheses. However, since site-specific transformation of a nested retrotransposon is a (too) ambitious objective, silencing of the Gypsy-44 transcripts or the nearby genes would also provide helpful clues.

Nitrogen and potassium fertilization affect apple fruit quality in southern Brazil

Nitrogen (N) and potassium (K) are usually found in higher concentrations than other macronutrients in apple (Malus x domestica Borkh) fruits and are most frequently associated with changes in fruit quality. The aim of this article was to evaluate the effects of N and K fertilization on some fruit quality attributes of Fuji apple. The experiment was conducted at Sao Joaquim, State of Santa Catarina, Brazil, during 2004 and 2005. A factorial design was used with N and K annual fertilizer rates (0, 50, 100, and 200 kg ha(-1) of N and K2O) replicated in three orchards. Fifteen days prior to harvest, three fruit samples were collected from each treatment and site. One sample was used for total soluble solid content (TSS), titratable acidity, pulp firmness, and fruit color parameter analyses, and the other samples were refrigerated in a conventional atmosphere for 3 and 6 months for subsequent determination of fruit quality. Nitrogen fertilization negatively affected fruit color, flesh firmness, and TSS content. These same variables were positively affected by K fertilization, except for flesh firmness.

Uso de reguladores de crescimento como alternativa tecnológica na cultura da macieira ‘Eva’ (Malus domestica Borkh.)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Modificación de las condiciones ambientales para la mejora de la calidad de diferentes variedades de manzana (Malus domestica Borkh.)

Cataluña es la primera región productora de manzana de España y dedicaba a su cultivo 14.901 ha en el año 2002 de un total nacional de 44.764 ha. Por otra parte en esta especie se está asistiendo a un incremento constante de la competencia con fruta procedente de otros países, principalmente Francia, Italia, Chile, Argentina y Nueva Zelanda que gozan de condiciones climatológicas mas favorables a la producción de manzana de calidad, especialmente en lo referido a la coloración de los frutos y su firmeza. En España la producción se ubica principalmente en el Valle del Ebro, mientras que en Cataluña las principales zonas de producción son Lleida y Girona. Dichas zonas se caracterizan por veranos cálidos y calurosos con pluviometrías escasas y por tanto poco favorables a a la coloración óptima de los frutos de variedades bicolores como ‘Mondial Gala’ o ‘Fuji’. A pesar de ello las principales zonas productoras de España cuentan con la ventaja de ser las primeras en acceder a los mercados tanto de España como de la UE debido a la mayor precocidad, siendo este un aspecto de interés en variedades del grupo ‘Gala’, de amplia difusión en los últimos años. En base a ello se deduce que para hacer frente a la creciente competencia global la mejora de la calidad es un aspecto clave para garantizar el futuro del sector productor.

EFEITO DO CARBARYL SOBRE O 'RUSSETING' DA MAÇÃ (MALUS DOMESTICA BORKH.), CULTIVARES 'GALA', 'FUJI' E 'GOLDEN DELICIOUS'

O "russeting" da maçã caracteriza-se por uma camada de cortiça formada entre as células da epiderme e que dá um aspecto de rugosidade à superfície do fruto, depreciando-o para a comercialização. O raleio de frutos é uma prática cultural bastante difundida entre os produtores de maçã. Pode ser efetuada manualmente, quimicamente ou pela associação de ambos. Dentre os produtos mais usados para raleio químico, estão o ácido naftaleno acético (ANA) e o carbaryl, um inseticida carbamato, conhecido comercialmente como Sevinâ. Há duas formulações de carbaryl no mercado brasileiro, mas não existem dados de pesquisa suficientes que permitam escolher a formulação mais adequada. Há citações de que o carbaryl pode causar "russeting" em maçãs. O objetivo deste trabalho foi testar as duas formulações de carbaryl existentes no mercado, quanto ao seu efeito sobre o "russeting" nas maçãs. Os experimentos foram conduzidos em Fraiburgo e em Caçador, Santa Catarina, Brasil. Foram avaliadas duas concentrações, 500 ppm e 1.500 ppm de carbaryl. Foram testadas duas formulações, uma em pó-molhável com 85% de i.a. e outra em suspensão concentrada com 48% de i.a. Como a incidência de "russeting" varia entre cultivares, testou-se em 'Gala', 'Fuji' e 'Golden Delicious', que são as três mais importantes no mercado brasileiro. Os resultados mostraram que: 1) A ocorrência de "russeting" para as três cultivares foi maior em Fraiburgo do que em Caçador; 2) O carbaryl, na formulação solução concentrada, causou mais "russeting" em 'Golden Delicious', em Caçador, indicando que o seu uso deve ser evitado para essa cultivar, dando-se preferência à formulação pó-molhável; 3)Tanto a formulação quanto a concentração de carbaryl não afetaram a incidência de "russeting" nas cultivares 'Gala' e 'Fuji' nos dois locais.

COMPORTAMENTO DA CULTIVAR DE MACIEIRA FUJI (Malus domestica, Borkh.) SOBRE TRÊS DIFERENTES PORTA-ENXERTOS

Verifica-se, a nível mundial, uma forte tendência para o plantio da macieira em alta densidade de cultivo. Neste sistema de plantio, são utilizados porta-enxertos de pequeno porte, conhecidos como anões. O mais utilizado é o M-9, em virtude do forte controle sobre o porte da copa, da precocidade de produção, da alta produtividade e da boa qualidade dos frutos que induz à copa. No Sul do Brasil, por questões de tradição internacional, facilidade de obtenção e do menor custo de investimento no plantio, até recentemente, têm sido plantados porta-enxertos de vigor médio, como o MM-106, o M-7 e o MM-111, para plantios de média densidade. O primeiro é atualmente pouco usado devido à alta suscetibilidade à podridão-do-colo (Phytophthora cactorum). O objetivo deste trabalho foi comparar o desempenho do anão M-9, do semi-anão M-7 e do semivigoroso MM-111 no controle do vigor da copa, na precocidade de produção, na produtividade e no tamanho dos frutos da cv. de macieira Fuji. O experimento foi conduzido em blocos ao acaso, com 4 repetições de 3 plantas por parcela. Como copa, foi utilizada a cv. Fuji, polinizada pela cv. Gala. O experimento foi implantado em 1996, em Fraiburgo-SC, principal pólo produtor de maçãs do País. O espaçamento de cultivo foi de 2,0 m por 5,0 m. O experimento foi conduzido por 4 anos, avaliando-se a precocidade (n0 de gemas de flor/cm² de área transversal do caule), produção (kg/planta), produtividade (t/ha), peso médio dos frutos (g) e distribuição dos frutos por categoria de tamanho (%). Os resultados obtidos indicaram que o M-9 foi o mais precoce, produzindo, no terceiro ano, 1,94 vez mais gemas de flor que o M-7 e 2,70 vezes mais que o MM-111. Em termos de produção, no terceiro ano, o M-9 produziu 2,53 vezes mais que o M-7 e 2,70 vezes mais que o MM-111. No quarto ano, o M-9 produziu 1,28 vez mais que o M-7 e 1,26 vez mais que o MM-111. O peso médio dos frutos foi de 159,2 g, 135,5 g e 131,2 g, para o M-9, o M-7 e o MM-111, respectivamente. Em termos de distribuição por categoria de tamanho, o M-9 produziu 90,8% de frutos maiores que 62 mm, o M-7 produziu 79,5% e o MM-111, 70,9%, indicando que o M-9, além de mais precoce e mais produtivo, também produz frutos de maior calibre.

Quebra da dormência da maciera (Malus domestica Borkh) em São Joaquim-SC

A macieira é uma fruteira de clima temperado que se caracteriza pelo fenômeno de dormência das gemas, necessitando de determinado número de horas de frio (< 7,2ºC) para abertura de gemas. No Brasil, São Joaquim-SC, é o local que apresenta as melhores condições climáticas para o cultivo desta espécie. Entretanto, não é correto afirmar que sempre apresenta horas de frio suficientes para satisfazer as exigências das cultivares. Foram desenvolvidos experimentos no ano 1998 e 1999, em microclimas específicos, que vão de 900 a 1400 metros de altitude, no município de São Joaquim -- SC, permitindo afirmar que apenas para a cultivar Gala, nos locais mais altos, acima de 1300 m, em anos acima de 2.300 unidades de frio, é dispensada a superação de dormência artificial.

Regeneração de brotações de macieira (Malus domestica, Borkh.) cv. Gala

Por meio deste trabalho, foi desenvolvido um protocolo de regeneração de brotações em explantes de macieira, cultivar Gala, visando a sua utilização em programas de transformação genética. Para tanto, testaram-se diferentes tipos de explante (folha escarificada, segmento foliar e entrenós), em diferentes meios de cultura, com Benzilaminopurina (BAP) e Thidiazuron (TDZ), em concentrações de 0; 3,0; 4,0 e 5,0mg.L-1, e a exposição ou não das brotações, de onde foram retirados os explantes, a uma semana de escuro antes da retirada dos mesmos. As variáveis avaliadas foram percentagem de explantes regenerados, número de brotações por explante e presença de vitrificação. Concluiu-se que a folha escarificada e os segmentos foliares foram os melhores tipos de explantes; a colocação das brotações no escuro durante uma semana aumentou a taxa de regeneração e o número de brotações e diminuiu a necessidade de BAP para formar o mesmo número de brotações do que naqueles mantidos na luz; as melhores concentrações de BAP foram de 4,0 a 5,0mg.L-1 e o TDZ, nas maiores concentrações, causou vitrificação.

Temperaturas efetivas para a dormência da macieira(Malus domestica Borkh)

As cultivares de macieira exigem diferentes requerimentos em frio, ou seja, o total de horas abaixo de um limite de temperatura do ar, porém são poucas as informações sobre quais temperaturas são mais eficientes para superar a dormência. As cultivares de macieira Condesa, Baronesa, Daiane, Imperatriz, Fuji e Gala foram estudadas quanto à quantidade de frio e as temperaturas do ar para a indução da brotação. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, no esquema fatorial, com seis cultivares, cinco níveis de unidades de frio ( 300; 600; 900; 1200 e 1500 UF) e três temperaturas do ar ( 5; 10 e 15ºC). O tempo médio para brotação foi menor quando as cultivares foram submetidas a 1.500 unidades de frio, independentemente da temperatura. A temperatura efetiva para acumular frio varia com a cultivar, podendo chegar até 15ºC para cultivares de menor exigência em frio.

Pré-resfriamento de maçã (Malus domestica Borkh.), cv. Fuji, em função da temperatura e velocidade do ar

O objetivo do trabalho foi determinar o efeito de três velocidades e três temperaturas do ar, no pré-resfriamento de maçã, cv. Fuji, até 5ºC. Os tratamentos utilizados originaram-se da combinação de três temperaturas (-1,-2 ou -3ºC) e três velocidades do ar de resfriamento (1, 2 ou 3m.s-1). O decréscimo da temperatura dos frutos é maior e seu tempo de resfriamento diminui com o aumento da velocidade de 1m.s-1 para 3m.s-1 e a redução da temperatura do ar de refrigerado de -1ºC para -3ºC; sendo o decréscimo da temperatura e o tempo de resfriamento das maçãs mais dependentes da velocidade do ar de refrigeração do que da temperatura obtida na entrada do túnel. Existe uma relação direta entre o decréscimo de temperatura dos frutos e a posição das caixas no túnel pré-resfriador. Com uma velocidade de 3m.s-1 e temperatura de -3ºC foi possível resfriar maçãs de 25 para 5ºC, em 40 minutos.

Efectes de la poda mecànica del dosser foliar i les arrels sobre la productivitat i qualitat de fruits en pomera (Malus domestica Borkh.)

Els anys 2008 i 2009 es va dur a terme un assaig en una plantació de pomera cv. Golden Smoothee® per a avaluar l’efecte de la poda mecànica del dosser foliar i la poda mecànica d’arrels sobre el rendiment de l’arbre, el pes promig del fruit i la qualitat del fruit. Els resultats confirmen que la poda mecànica del dosser foliar no redueix el rendiment de fruits de qualitat comercial i tampoc afecta la qualitat dels fruits; la poda d’arrels quan es duu a terme durant l’hivern tampoc suposa cap reducció de rendiment ni de qualitat dels fruits de pomera.