厚朴中α-葡萄糖苷酶抑制活性成分研究

本论文由三章组成。 第一章是关于厚朴中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的研究。凹叶厚朴的乙醇提取物显示了较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。为了确定其活性成分，在活性测试的指导下，通过溶剂萃取、树脂吸附和反复硅胶柱层析等分离方法从凹叶厚朴乙醇提取物中分离得到6 个生物碱，并用质谱和核磁共振等波谱方法分别鉴定为：木兰箭毒碱，木兰花碱，鹅掌楸碱，蕃荔枝碱，罗默碱和Lysicamine。应用小肠α-葡萄糖苷酶模型测定了它们对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。其中，番荔枝碱和木兰箭毒碱对α-葡萄糖苷酶相对抑制活性最好，分别为60%和62%；其它四个生物碱成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性几乎相当，鹅掌楸碱为46%，罗默碱为51%，Lysicamine 为49%，木兰花碱为51%。 第二章报道了厚朴酚的衍生物及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。根据糖苷酶抑制剂的结构特点，设计合成了一系列厚朴酚的衍生物。厚朴酚经过Mannich 反应和环氧化及开环反应制备了一系列衍生物，经活性测试发现衍生物活性与取代基关系较大，其中5,5′-diallyl-3-((bis(2-hydroxyethyl)amino)methyl)biphenyl-2,2′-diol 的抑制活性最高，为72%。 第三章综述了厚朴的化学成分及药理活性两个方面的研究进展。 The dissertation consists of three chapters. The first chapter is about the study on the constituents with α-glycosidase inhibitory activity from Magnolia officinalis. The EtOH extracts of M. officinalis Rehd. et Wils showed good inhibitory activity against α-Glucosidase. In order to determine the active compounds, bio-assay was used to guide the isolation. Six known alkaloids were isolated by solvent extraction and repeated silica gel column chromatography, and their structures were identified as liriodenine, anonaine, roemerine, lysicamine, magnoflorine and magnocurarine by spectroscopic methods. The inhibitory activity against α-Glucosidase of these alkaloids was measured with alvine screening model of α-glucosidase. Among them, lysicamine and liriodenine have the best inhibitory activity at 60% and 62%, respectively. The other four alkaloids have close inhibitory activity, from 46% to 51%. The second chapter is about the derivation of magnolol and the inhibitory a ctivity of the derivatives. Seven derivatives of magnolol were prepared by Manni-ch reaction, epoxidation followed by ring-opening reaction. Biological activity as say indicated the inhibitory activity was related to substituting groups. Among them, 5,5′-diallyl-3-((bis(2-hydroxyethyl)amino)methyl)biphenyl-2,2′-diol had the highest activity at 72%. The third chapter is a review on the progress of M. officinalis including chemical constituents and pharmacological activity.

Moderate concentrations of 4-O-methylhonokiol potentiate GABAA receptor currents stronger than honokiol

BACKGROUND Magnolia bark preparations from Magnolia officinalis of Asian medicinal systems are known for their muscle relaxant effect and anticonvulsant activity. These CNS related effects are ascribed to the presence of the biphenyl-type neolignans honokiol and magnolol that exert a potentiating effect on GABAA receptors. 4-O-methylhonokiol isolated from seeds of the North-American M. grandiflora was compared to honokiol for its activity to potentiate GABAA receptors and its GABAA receptor subtype-specificity was established. METHODS Different recombinant GABAA receptors were functionally expressed in Xenopus oocytes and electrophysiological techniques were used determine to their modulation by 4-O-methylhonokiol. RESULTS 3μM 4-O-methylhonokiol is shown here to potentiate responses of the α₁β₂γ₂ GABAA receptor about 20-fold stronger than the same concentration of honokiol. In the present study potentiation by 4-O-methylhonokiol is also detailed for 12 GABAA receptor subtypes to assess GABAA receptor subunits that are responsible for the potentiating effect. CONCLUSION The much higher potentiation of GABAA receptors at identical concentrations of 4-O-methylhonokiol as compared to honokiol parallels previous observations made in other systems of potentiated pharmacological activity of 4-O-methylhonokiol over honokiol. GENERAL SIGNIFICANCE The results point to the use of 4-O-methylhonokiol as a lead for GABAA receptor potentiation and corroborate the use of M. grandiflora seeds against convulsions in Mexican folk medicine.

Dracocephalum moldavica L. and Melissa officinalis L. : Chemistry and Bioactivities Relevant in Alzheimer’s Disease Therapy

Oksidatiivisen stressin eli liiallisen reaktiivisten happiyhdisteiden määrän soluissa on jo pitkään arveltu olevan tärkeä Alzheimerin taudin kehittymiseen ja etenemiseen vaikuttava tekijä. Tämän vuoksi kiinnostus erilaisten antioksidanttien (yhdisteitä, jotka neutraloivat näitä happiradikaaleja soluissa) mahdollisia terapeuttisia ominaisuuksia Alzheimerin taudin hoidossa on tutkittu laajalti. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole vielä onnistuttu löytämään antioksidanttia, joka olisi hyödyksi Alzheimerin taudin hoidossa. Tämän vuoksi on tärkeää pyrkiä löytämään uusia antioksidanttien lähteitä sekä tutkia niistä löytyviä aktiivisia yhdisteitä. Kiinnostus luonnon antioksidantteja kohtaan on kasvanut voimakkaasti viime aikoina. Huomio on kiinnittynyt erityisesti aromaattisista sekä lääkekasveista löytyviin antioksidantteihin. Lamiaceae- perheeseen kuuluvia tuoksuampiaisyrttiä (Dracocephalum moldavica L.) ja sitruunamelissaa (Melissa officinalis L.) on käytetty Iranissa pitkään sekä ruoanlaitossa että lääkinnässä, minkä vuoksi näiden kasvien uutteiden antioksidanttisisältöä päätettiin analysoida käyttäen useaa erilaista in vitro- menetelmää. Näissä kokeissa ilmeni, että uutteilla oli useita antioksidanttisia vaikutuksia. Näistä antioksidanttisista vaikutuksista vastaavia yhdisteitä pyrittiin tunnistamaan käyttäen HPLC-PDA- tekniikkaa, minkä seurauksena niiden havaittiin sisältävän erilaisia polyfenoleita, kuten hydroksyloituneita bentsoeeni- ja cinnamamidihapon johdannaisia sekä flavonoideja. Kummankin kasvin uutteissa runsaimmin esiintynyt yhdiste oli rosmariinihappo. Sitruunamelissaa (M. officinalis) on käytetty antiikin ajoista alkaen kognitiivisten toimintojen häiriöiden hoidossa. Perustuen tietoon kasvin käytöstä perinteisessä lääkinnässä, sen tehoa Alzheimerin taudin hoidossa on tutkittu viime aikoina kliinisin kokein. Sitruunamelissan todettiinkin olevan hyödyksi lievää ja keskivaikeaa Alzheimeimerin tautia sairastavien potilaiden hoidossa. Väitöskirjan osanan olevasta kooste-artikkelista käy ilmi, että tutkimalla lääkekasvien ominaisuuksia voidaan saada arvokkaita suuntaa-antavia vihjeitä Alzheimerin taudin lääkehoidon kehittämiseen. Tämän perusteella päätettiinkin testatata myös sitruunamelissauutteen kykyä estää asetyylikoliiniesteraasin (AChE) toimintaa, koska tämän entsyymin toiminna estämisen tiedetään olevan hyödyksi Alzheimerin taudin hoidossa. Uute kykeni estämään AChE:n toimintaa, minkä vuoksi uutteen sisältämiä komponentteja päätettiin tutkia terkemmin. Uute jaettiin erilaisiin fraktioihin käyttäen HPLC-menetelmää, minkä jälkeen testattiin jokaisen fraktion kykyä inhiboida AchE. Suurin osa fraktioista kykeni inhiboimaan AChE:n toimintaa selkeästi tehokkaammin, kuin raakauute. Kaikista tehokkainta fraktiota analysoitiin tarkemmin sen aktiivisten yhdisteiden tunnistamiseksi, minkä seurauksena sen sisältämät yhdisteet tunnistettiin cis ja trans-rosmariinihapoiksi. Tässä tutkimuksessa tunnistettujen yhdisteiden hyödyllisyyttä Alzheimerin taudin hoidossa tulisi seuraavaksi tutkia erilaisissa in vivo-malleissa. Lisäksi jäljellä olevien fraktioiden kemiallinen koostumus tulisi selvittää sekä antioksidanttiaktiivisuuden ja AChE:n toiminnan inhiboinnin välistä mahdollista yhteyttä tulisi tutkia tarkemmin. Tämä tutkimus osoittaa tuoksuampiasyrtin (D. moldavica) sekä sitruunamelissan (M. officinalis) sisältävän monenlaisia aktiivisia antioksidantteja. Lisäksi sitruunamelissan sisältämät yhdisteet kykenivät estämään asetyylikoliiniesteraasin (AchE) toimintaa. Nämä tulokset tukevat osaltaan väitöskirjan osana olevan kooste-artikkelin johtopäätöksiä, joiden mukaan etnofarmakologinen kasvitutkimus voi osoittautua erittäin hyödylliseksi kehitettäessä uutta lääkehoitoa Alzheimerin tautiin. Lisäksi tässä väitöskirjassa kuvattu tutkimus osoittaakin, että perinteisesti lääkekasvina käytettyä sitruunamelissaa voidaan mahdollisesti hyödyntää uusien Alzheimerin taudin hoitoon käytettävien lääkkeiden kehityksessä.

Development of tissue culture and virus-induced gene silencing for Calendula officinalis

Calendula officinalis is grown widely as an ornamental plant across Europe. It belongs to the large. Asteraceae family. In this study, the aim was to explore the possibilities to use Calendula officinalis as a new model organism for flower development and secondary mechanism studies in Asteraceae. Tissue culture of Calendula officinalis was established using nine different cultivars. Murashige & Skoog (MS) medium with four different combinations of plant growth regulators were tested. Of all these combinations, the medium containing 1mg/l BAP, 0.1 mg/l IAA, and 1mg/l Zeatin achieved highest frequency of adventitious shoot regeneration from hypocotyl and cotyledon explants. Virus-induced gene silencing is a recent developed genetic tool for charactering the gene functions in plants, and extends the range of host plants that are not accessible for Agrobacterium transformation. Here, tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS technique was tested in calendula (cv. Single Orange). We used TRV carrying Gerbera hybrid phytoene desaturase (PDS) gene fragment to induce PDS silencing in calendula. Vacuum infiltration and syringe infiltration methods both resulted in photo-bleaching phenotypes in leaves, bracts and petals. Loss-of-function phenotypes occurred on calendula 13 days post-infiltration. In conclusion, the data indicates that calendula explants can be regenerated through tissue culture which is a prerequisite for development of stable transformation methods. However, further optimization is still needed to improve the frequency. In addition, VIGS was applied to silence PDS marker gene expression indicating that this method has potential for gene functional studies in future.

Producción de primicia en invernadero de híbridos de espárrago verde (Asparagus officinalis var. Altilis) en su cuarto año productivo

Resumen: La producción de espárragos en Argentina está caracterizada por una elevada estacionalidad concentrada en el periodo octubre-diciembre, por lo que el empleo de invernaderos brinda la posibilidad de ampliar el calendario de oferta, anticipando la entrada en producción. Con el objetivo de evaluar el rendimiento de primicia de diferentes híbridos de espárrago verde, se realizó un ensayo en invernadero con ocho híbridos, en UCA Buenos Aires, iniciado el 15/11/2006, mediante plantines de 100 días a 1m*0,3m. Se evaluaron los siguientes genotipos: Italo, Zeno, Eros, Ercole, H-668, Marte, y Giove, de origen italiano, y UC-157 de origen americano, como testigo por ser el tradicionalmente cultivado en Argentina. Se evaluaron 22 cosechas, con una frecuencia de día por medio, del 17/08/2011-25/10/2011. Se estudiaron diferencias en kg totales y comerciales (PFT y PFC), Nº turiones totales y comerciales/ha (NTT y NTC) y distribución de calibres (DC): Jumbo (J), Extra-Large (XL), Large (L), Medium (M), Small (S) y Asparagina (A). Se efectuó un análisis multifactor ANOVA LSD test (P>0.05). En promedio se obtuvieron: PFT: 17053; PFC: 7904 kg.ha-1; NTT: 670566 y NTC: 520938 turiones.ha-1. Se destacaron: en PFT: Italo: 29458a, Zeno: 23056b, Giove: 23034b y H-668: 18568bc; en PFC: Italo: 14850a, Giove: 9856b, Zeno: 9130bc y H-668: 8228bcd; en NTT: Italo: 842512a, H-668: 754512a, Giove: 715000b y Eros: 707498b; en NTC: Italo: 844998a, H-668: 667502b y Eros: 542498bc y en DC: en J: Italoa, Gioveb, Zenobc y UC-157bcd; en XL: Italoa, Zenoab y Gioveb; en L: Giovea, Italoa, Zenoab, H-668abc y UC-157abc; en M: Italoa, H-668ab y Erosab; en S: H-668a, Erosa e Italoab y en A: H-668a y Marteab. Por lo expuesto resulta alentadora la productividad de Italo, Giove, Zeno y H-668 para producción de espárrago verde de primicia en invernadero.

Evaluación del crecimiento y producción de turiones de espárrago verde (Asparagus officinalis L.) producidos bajo dos sistemas de inicio, arañas y plantines, en Azul, Buenos Aires

En dos plantaciones de espárrago verde (Asparagus officinalis L.) en el centro de la Pcia. de Buenos Aires, del cultivar UC 157 F2, iniciadas con arañas y plantines, durante su primer año de cosecha, se determinó la tasa de elongación diaria y total hasta el momento de la ramificación de los turiones, el número de días hasta alcanzar el largo exportable (22.5 cm) y los días hasta el momento de la ramificación con el objetivo de estudiar su comportamiento en la zona centro de la provincia de Buenos Aires. Las mediciones se efectuaron durante seis semanas, desde el 26 de septiembre hasta el 4 de noviembre de 2005, desde la emergencia del turión hasta el día de su ramificación (rama de 5 mm sobre su bráctea). La elongación máxima hasta el día de ramificación en promedio y para ambos sistemas de inicio, varió 2 desde 35.3 cm al principio de la cosecha hasta 22.8 cm al final de la misma. Las tasas de elongación relativas variaron en promedio para ambos sistemas de inicio, entre 0.11 cm cm-1 d-1 y 0.38 cm cm-1 d-1 dependiendo de la temperatura del aire. Al mismo tiempo las parcelas constituyentes del ensayo fueron sometidas a una cosecha comercial durante las seis semanas de evaluación. Los espárragos cosechados constituyeron el rendimiento total (kg ha-1) para cada sistema de inicio entre los cuales no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Este estudio permitiría explicar las diferencias de rendimiento comercial para un mismo cultivar en diferentes zonas de producción. Se concluye que para una zona dada, la elongación y sobre todo la ramificación, son variables prioritarias para la determinación del potencial productivo de un cultivar, debiendo tener en cuenta las condiciones de temperatura en las cual se pretende producir este cultivo y el mercado de destino de la producción debido a las mercadas preferencias entre sus consumidores.

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）精油和抗氧化剂的研究

本文应用植物引种驯化，栽培学及植物化学的理论方法对引入我国的迷迭香（Rosmarinus officinalisL．）精油和抗氧化剂进行了研究．主要结果如下; 1、昆明地区的生态气候条件最适宜迷迭香生长。南京地区局部良好环境也能满足迷迭香正常生长需要。北京地区在保护栽培的情况下,迷迭香才能够安全越冬。 2、用GC-MS和GC-IR鉴定了迷迭香精油的23种成分。不同采收期精油成分含量变化有3种类型，即似单峰曲线，似8曲线和w曲线。一年生与二年生苗在精油成分含量上略有差异。与主要栽培国相比，我国不同引种地精油成分化学类型各具特点，北京地区α—蒎稀（31.58%）含量很高，南京地区富含樟脑（14.86%）乙酸龙脑酯（7.97%）和龙脑（6.90%）含量也相对较高，昆明地区则是α—蒎稀（24.32%）和1.8—桉叶油素（24.43%）含量并重。 乙酸龙脑酯含量的高低对精油香气质量优劣起关键作用。北京地区雨季来临收获（7月初）精油香气质量最好。南京地区，11月初精油香气质量也属优质。本实验未能得到高质量的昆明地区精油。 3、从迷迭香蒸油残渣中分离得到三种抗氧化成分，迷迭香酚( Rosrmanol)、鼠尾草酚(Carnosol)和迷迭香双醛（R0smadial），并用质谱，核磁做了鉴定．硫氰铁酸法、TBA法、AOM法检测了三种成分的抗氧化效能．Rosmanol对多双键不饱和脂肪酸抗氧化效果显著,Carnosol和BHT在不同双键脂肪酸中抗氧化效果稳定，Rosmadial的抗氧化效果则随不饱和双键数目的增加而降低。在猪油中，抗氧化效能的强度顺序为Rosmanol >carnosol>BR>Rosmadial。 抗氧化物质在植株体内是不断积累的。不同引种地迷选香抗氧化效能的强弱差异表现为昆明>北京>南京。 迷迭香的正己烷，两酮提取物抗氧化效能都是随着添加量的增加而增强、丙酮提取物的抗氧化效能优于正己烷提取物。 对迷迭香抗氧化剂提取工艺做了探讨，得到R-1，R—2，R-3三种小试样品，R-2，R-3的抗氧化效果优于BHT．B—l接近于BET。

稻属Oryza officinalis复合体基因组研究－兼论基因组原位杂交的原理和方法

稻属（Oryza L.）属于禾本科稻族（Oryzeae Dumortier）。本属包括AA，BB，BBCC，CC，CCDD，EE，FF，GG，HHJJ和HHKK十个基因组，二十余种。其中Oryza officinalis复合体包括BB，BBCC，CC，CCDD和EE五个基因组，九个种。众多的学者对该复合体进行了广泛深入的研究，为后续研究奠定了坚实的基础。然而，迄今为止，多倍体物种形成问题许多没有解决，基因组间的关系尚未完全阐明，甚至有些多倍体物种的基因组组成仍未确认。 本文评述了Oryza officinalis复合体中基因组研究的历史和现状，用基因组原位杂位（GISH）的方法，对该复合体四倍体物种的基因组组成作了验证;对B，C，D和E四个基因组间的关系进行了研究。同时对基因组原位杂交的方法，原位杂交鉴定多倍体基因组的组成以及研究基因组间关系的方法作了一些探讨。其主要研究结果如下： 一. 原杂交方法的研究：1）染色体制片：比较研究了不同的制片方法，发现压片法适用于大染色体的材料;将酶解/空气干燥法（Fukui et al., 1992）加以改进后，特别适宜于小染色体植物材料的制片。2）根尖储存时间和条件对原位杂交的影响：发现在-20 ℃的酒精（70%）中储存8个月以内的根尖材料，可用于原位杂交;而在-20 ℃的固定液中储藏18个月的根尖，DNA降解严重，不能用于GISH。3）探针标记：比较了随机引物法、缺口平移法和两步标记法（先用随机引物标记后，再用缺口平移法进行标记的方法）的优缺点。结果显示两步标记法是最佳标记方法。 二. GISH鉴定异源多倍体的方法：用两个异源四倍体Oryza minuta和Scilla sinensis (2n = 34)做染色体制片，进行原位杂交实验，结果表明：1）用二倍体亲本基因组之一做探针而不用封阻DNA， 可以鉴别Oryza minuta而不能鉴别Scilla sinensis中的基因组。2）用一个二倍体亲本做探针而用另一个做封阻，能够区分Scilla sinensis的两个基因组;但过量的封阻DNA将可以造成一些实验假象。3）同时用两个亲本的DNA做探针，不仅能够有效分辨不同的基因组，还能够根据交叉杂交程度推测基因组间的分化程度，是鉴别异源多倍体最有效的方法。 三. GISH鉴定稻属四倍体的基因组组成：1）Oryza minuta, O. punctata和O. malampuzhaensis的基因组的组成都为BBCC。2）Oryza minuta中B基因组和二倍体O. punctata中的B基因组之间存在着明显的基因组内分化。3）O. alta是一个异源多倍体，其基因组组成为CCDD。但C和D之间的分化不彻底，可以认为它不是一个严格意义上的异源多倍体。 四. GISH研究B，C，D和E基因组间的关系：1）B基因组和C基因组之间的关系最远;E和C之间的分化同E和B之间的分化程度接近，但E和C之间的分化比E和D之间的分化要小一些;C和D之间的分化不彻底，关系最近。