Diversidade de Magnaporthe grisea em arroz de terras altas no sul do Estado do Tocantins, na safra 2008/09

A brusone do arroz, causada pelo fungo Magnaporthe grisea, é uma das mais importantes doenças orizícolas no Brasil e no mundo, principalmente em arroz de terras altas. Objetivou-se, neste trabalho, identificar as raças fisiológicas de M. grisea nas lavouras comerciais de arroz, cultivadas em sistema de terras altas, na região sul do Estado do Tocantins. Para isso, realizaram-se amostragens de plantas de arroz com sintomas de brusone, no campo experimental da Universidade Federal do Tocantins/Campus de Gurupi e em lavouras comerciais dos municípios de Aliança, Dueré, Figueirópolis e Peixe. Para identificação das raças de M. grisea, foram feitos isolamentos monospóricos em laboratório e plantio das linhagens diferenciadoras em casa de vegetação. Constataram-se 21 raças fisiológicas de M. grisea, distribuídas em seis grupos de raças da Série Internacional Diferenciadora, sendo IA e ID os grupos de maior prevalência, que apresentaram 52,38 e 14,28% dos isolados, respectivamente. As quatro raças mais prevalentes foram IA-1, IA-33, IC-1 e ID-9, sendo a IA-1 considerada muito agressiva. Maior número de raças foi encontrado no cultivar Primavera.

Variation in virulence in the rice blast fungus Magnaporthe grisea in São Paulo State

Resistant varieties have been the preferred means to control Magnaporthe grisea, the causal organism of the rice blast disease. The objective of this study was to examine the degree of diversity of the pathogen in different rice growing regions of São Paulo State, Brazil. Blast samples collected from rice varieties in three different regions (Tremembé, Mococa and José Bonifácio) were analyzed for race structure employing the Japanese rice differentials. The highest degree of virulence diversity was observed in Tremembé with 22 different races in three different varieties. Furthermore, no resistance gene in the Japanese differentials was effective to all isolates of M. grisea from São Paulo State.

Inter-relação sexual de Magnaporthe grisea do trigo e de outros hospedeiros

Foram identificados isolados de Magnaporthe grisea do Brasil a serem utilizados como parentais em estudos de determinação do tipo compatível ("mating type") do fungo. A escolha dos melhores parentais baseou-se naqueles isolados que determinaram o tipo compatível de maior número de isolados de M. grisea do trigo (Triticum aestivum). A inter-relação sexual da brusone do trigo com a brusone de diversos hospedeiros foi avaliada de acordo com os seguintes parâmetros: determinação de tipo compatível (MAT1-1 e MAT1-2), sexualidade (hermafrodita, fêmea e macho), fertilidade (número de peritécios) e produção de órgãos sexuais (peritécio, ascas e ascósporos). Os parentais Bp3a e Br118.2D possibilitaram a identificação do tipo compatível de maior porcentagem dos isolados da brusone do trigo. Entre as diversas gramíneas estudadas, os isolados de brusone provenientes de Brachiaria plantaginea e T. aestivum podem influenciar na alta variabilidade de M. grisea do trigo. Verificou-se variabilidade genética dentro de isolados de Setaria geniculata, sugerindo que a brusone desse hospedeiro pode influir na variabilidade da brusone do trigo. Isolados de brusone do arroz (Oryza sativa) apresentaram baixa fertilidade sexual.

Análise da segregação de avirulência de Magnaporthe grisea do trigo

A segregação de avirulência entre progênies de cruzamento entre isolados de Magnaporthe grisea provenientes de trigo (Triticum aestivum) foi estudada utilizando cinco variedades de trigo. A população segregante desse estudo foi formada por 37 progênies resultantes do cruzamento entre dois isolados de campo que diferiram na reação de avirulência/virulência a essas variedades. Os resultados obtidos mostraram que para as variedades CNT 8, BR 17 e OR 1 a relação avirulência/virulência foi de 1:1, demonstrando segregação de um gene de avirulência, que foi diferente para cada uma das variedades. A segregação observada para as variedades BR 31 e Iapar 3 foi de 1:3 avirulência/virulência indicando segregação de um gene de avirulência e do supressor desse gene de avirulência. Além disso, a recombinação sexual entre isolados de M. grisea em condições de laboratório possibilitou produzir isolados virulentos a todas as variedades podendo ser uma das causas para a quebra de resistência de variedades resistentes.

Resistance spectra of wheat cultivars and virulence diversity of Magnaporthe grisea isolates in Brazil

Seventy-two monoconidial isolates of Magnaporthe grisea were obtained from the States of Mato Grosso do Sul and Paraná. The isolates were inoculated on seedlings of 20 wheat (Triticum aestivum) cultivars under greenhouse conditions. The virulence diversity of M. grisea was assessed based on compatible and incompatible reactions of leaf blast on wheat cultivars. Fifty-four distinct virulence patterns were identified on test cultivars among the isolates collected from the two wheat growing States. Sixteen of these isolates corresponding to 22.2% showed similar virulence pattern. None of the wheat cultivars was resistant to all isolates of M. grisea, but the cultivars differed in degree of resistance as measured by the relative spectrum of resistance (RSR) and disease index (DI). Among the cultivars the RSR ranged from 0 to 53.3% and DI from 0.4662 to 0.9662 (0 to 1 scale). The wheat cultivar BR18 exhibited a broad resistance spectrum in relation to the rest of the tested cultivars to the isolates of M. grisea, and can be used in wheat resistance breeding.

Reação do trigo à Magnaporthe grisea nos diferentes estádios de desenvolvimento

A brusone em trigo (Triticum aestivum), causada por Magnaporthe grisea, foi relatada pela primeira vez no Paraná em meados da década de 80, estando atualmente disseminada nos principais estados produtores do país. A relação da resistência à brusone nas folhas e espigas de trigo foi estudada utilizando-se 15 variedades de trigo e três diferentes isolados do fungo. Foram empregados cinco variedades e três isolados de M. grisea para estudar a relação entre resistência de espigas e percentagem de infecção das sementes colhidas. Os resultados demonstraram que houve correlação positiva entre suscetibilidade nas folhas no estádio vegetativo e nas espigas. A variedade BH1146 foi a única que apresentou correlação positiva da resistência, pois foi a única a apresentar plântulas resistentes que posteriormente se refletiu numa menor incidência de espigas doentes com menor severidade da doença. Detectou-se correlação altamente significativa entre incidência e severidade da doença nas espigas. As percentagens de sementes infetadas foram menores nas variedades que apresentaram reação resistente nas espigas do que nas variedades suscetíveis.

Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.

Influência da temperatura e da umidade relativa do ar na esporulação de Magnaporthe grisea em trigo

O fungo Magnaporthe grisea (Anamorfo Pyricularia grisea) é o agente causal da brusone do trigo (Triticum aestivum), uma doença limitante à cultura do trigo no Brasil em regiões produtoras localizadas acima do paralelo 24 °S. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da temperatura e da umidade relativa do ar na esporulação de M. grisea. O número médio de conídios foi determinado em ráquis de plantas de trigo previamente colonizados com o fungo e expostos em câmaras de crescimento sob temperaturas de 23 e 28 ºC, e com umidade relativa do ar de 80, 85, 90, 95 e 100%. A determinação do número de conídios produzidos foi feita após 24, 48, 72 e 96 horas de exposição em cada combinação de temperatura e umidade. Os efeitos da temperatura e da umidade foram significativos (P<0.001), mas não o da interação. A produção de conídios também foi determinada sob condições naturais de ambiente onde se verificou flutuação da temperatura e da umidade relativa do ar. Os resultados do presente trabalho permitiram observar que quando a umidade relativa é elevada (> 90%) e a temperatura se encontra ao redor de 28 ºC, a produção de conídios de M. grisea é favorecida.

Estimation of phenotypic diversity in field populations of Magnaporthe grisea from two upland rice cultivars

The phenotypic diversity of Magnaporthe grisea was evaluated based on leaf samples with blast lesions collected from eight commercial fields of the upland rice cultivars 'BRS Primavera' and 'BRS Bonança', during the growing seasons of 2001/2002 and 2002/2003, in Goias State. The number of M. grisea isolates from each field utilized for virulence testing varied from 28 to 47. Three different indices were used based on reaction type in the eight standard international differentials and eight Brazilian differentials. The M. grisea subpopulations of ´Primavera' and 'Bonança', as measured by Simpson, Shannon and Gleason indices, showed similar phenotypic diversities. The Simpson index was more sensitive relation than those of Shannon and Gleason for pathotype number and standard deviation utilizing Brazilian differentials. However, the Gleason index was sensitive to standard deviation for international differentials. The sample size did not significantly influence the diversity index. The two sets of differential cultivars used in this study distinguished phenotypic diversity in different ways in all of the eight subpopulations analyzed. The phenotypic diversity determined based on eight differential Brazilian cultivars was lower in commercial rice fields of 'Primavera' than in the fields of 'Bonança,' independent of the diversity index utilized, year and location. Considering the Brazilian differentials, the four subpopulations of 'BRS Primavera' did not show evenness in distribution and only one pathotype dominated in the populations. The even distribution of pathotype was observed in three subpopulations of 'BRS Bonança'. The pathotype diversity of M. grisea was determined with more precision using Brazilian differentials and Simpson index.

Isolamento e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.

Caracterização da virulência de Magnaporthe grisea em cultivares diferenciadoras japonesas e linhas quase-isogênicas das cultivares IAC-25 e de CO-39 de arroz

Foi estudada a virulência de 681 isolados de Magnaporthe grisea provenientes de oito lavouras de arroz de terras altas, quatro da cv. BRS Bonança e quatro da cv. Primavera, localizadas em cinco municípios no Estado de Goiás. Foram avaliados 321 isolados de M. grisea de folha e de panícula obtidos da cv. BRS Bonança e 360 da cv. Primavera. Para diferenciar a virulência dos isolados foram utilizados nove cultivares diferenciadoras japonesas, seis linhagens quase-isogências (NIL's) da cv. IAC-25, cinco linhagens quase-isogênicas da cv. CO-39, e as cultivares Primavera, BRS Bonança, IAC-25 e CO-39. Os isolados de M. grisea provenientes da cv. BRS Bonança foram mais virulentos nas NIL's de IAC-25 do que isolados da cv. Primavera. A maioria das subpopulações de M. grisea provenientes de folhas e panícula, de ambas as cultivares, foram avirulentos à linhagem quase-isogênica CNA-8212. A virulência, em baixa freqüência, foi observada nos isolados de M. grisea provenientes de BRS Bonança aos genes Pi-z t (Toride-1) e de Primavera aos genes Pi-z (Fukunishiki). Uma baixa freqüência de isolados virulentos foram virulentos nas NIL's C101 LAC (Pi-1) e C101 A 51(Pi-2). Considerando as reações compatíveis e incompatíveis das NIL's de IAC-25 à população de M. grisea de BRS Bonança, o dendrograma mostrou um grupo (90% de similaridade), diferindo do parental recorrente. Por outro lado, a população de 'Primavera', com exceção da CNA-8199, formou um grupo (93% de similaridade), incluindo o parental recorrente. Os genes de resistência Pi-z e Pi-z t das cultivares Fukunishiki e Toride-1, respectivamente, os genes Pi-1 e Pi-2 das NIL's de CO-39 e os genes desconhecidos das NIL's IAC-25, que apresentaram maior espectro de resistência às populações estudadas podem ser utilizados no programa de melhoramento, para desenvolvimento de linhas isogênicas de BRS Bonança e Primavera.

Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz

Ensaios foram conduzidos para verificar a presença, o número de cópias e de sítios de integração de pAN7-1 no genoma de mutantes de M. grisea I-22 com patogenicidade alterada em arroz. Foram analisados T41, T93, T251 (gerados por mutagênese REMI) e T108 (oriundo de mutagênese convencional), os quais exibiram diferentes fenótipos mutantes. O DNA total desses mutantes foi submetido à reação em cadeia de polimerase (PCR) e às análises de hibridização com o vetor (Southern blot). A presença de pAN7-1 no genoma de todos os mutantes foi confirmada por PCR. Segundo as análises de Southern blot, T41 exibiu duas integrações do vetor, ambas na forma de cópia única. No genoma de T93 também foram detectados dois sítios de inserção de pAN7-1, um dos quais envolvendo múltiplas cópias do vetor. Os resultados indicaram a presença de apenas uma cópia do vetor em um único sítio nos genomas de T108 e T251. O padrão de integração em T251 foi o único a sugerir a ocorrência de evento REMI. As diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1 refletiram a possível aleatoriedade dos eventos de integração no genoma de M. grisea. Os resultados evidenciaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea, quando conduzida com pAN7-1 e HindIII

Identificação de genes de resistência à brusone (Magnaporthe grisea) em cultivares de arroz (Oryza sativa) utilizando marcadores moleculares

A brusone, causada por Magnaporthe grisea, é a doença mais importante do arroz. Uma vez que, o uso de cultivares resistentes é o método mais efetivo para o controle da doença, a pesquisa visa a identificação de novos genes que confiram resistência mais durável. O objetivo deste trabalho foi a identificação de cultivares que contenham os genes de resistência Pi-1, Pi-2 e Pi-11 utilizando marcadores moleculares. RG64, um marcador RFLP baseado em PCR, foi utilizado para verificar a presença do gene Pi-2 em 250 cultivares de arroz. Trinta e três cultivares apresentaram o mesmo perfil eletroforético da linha-quaseisogênica (NIL) C101A51, que contém o gene Pi-2. Verificou-se que 28 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados, indicando que RG64 possui alta eficiência para a seleção de cultivares que contêm o gene Pi-2. Três marcadores microssatélites (RM) foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-1 em 104 cultivares de arroz. Trinta cultivares, analisadas com RM254, apresentaram o mesmo perfil da NIL C104LAC, que contém o gene Pi-1. Verificou-se que 19 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados. Três marcadores microssatélites foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-11 em 104 cultivares de arroz. Oito cultivares, analisadas com RM210, apresentaram o mesmo perfil da NIL IR1529, que contém o gene Pi-11, mas somente uma foi resistente. Com exceção do RM254, os demais marcadores microssatélites tiveram baixa eficiência de seleção de cultivares com o mesmo perfil das NILs. Estes resultados indicam que o uso de marcadores moleculares pode ser útil para acelerar o processo de lançamento de cultivares com resistência à brusone. No entanto, ainda é preciso aumentar a eficiência de seleção, através de marcadores microssatélites com localização cromossomal mais próxima dos genes Pi-1 e Pi- 11. Em um futuro próximo, isto poderá ser possível com a disponibilização de mapas moleculares de maior resolução.

Análise da variabilidade de Magnaporthe grisea no Estado de Santa Catarina

A rápida perda da resistência das cultivares de arroz à brusone, causada por Magnaporthe grisea (Herb.) Barr, é geralmente atribuída à variabilidade genética do patógeno ou ainda à ocorrência de escape durante a seleção de novas cultivares. Com o objetivo de caracterizar a estrutura genética de um grupo de isolados de M. grisea em Santa Catarina (SC), plantas com sintomas de brusone foram coletadas em 12 municípios e na Estação Experimental da Epagri em Itajaí (EEI), SC. Os isolados foram analisados através de rep-PCR baseado no transposon Pot-2. Para a identificação das raças, um subgrupo de isolados foi inoculado na série internacional de cultivares diferenciais de arroz. As raças identificadas tiveram seu espectro de virulência avaliado em um grupo de cultivares com genes de resistência conhecidos (isolinhas). Isolados que apresentaram características genéticas distintas, foram avaliados quanto a capacidade de recombinação parassexual. Noventa e dois isolados monoconidiais obtidos foram agrupados através de rep-PCR em 13 haplótipos e 2 linhagens. Nove haplótipos encontrados na amostragem dos municípios não foram encontrados na EEI, indicando a ocorrência de escape. Seis raças de M. grisea foram identificadas a partir da inoculação de 28 isolados, representando 12 haplótipos na série diferencial, sendo que, 5 destas, foram avirulentas à isolinha que possui os genes de resistência Pi-1 e Pi-11. Por outro lado, o isolado 25, agrupado na raça IA-65, superou 4 das 5 isolinhas testadas. A análise da capacidade de recombinação parassexual mostra a existência de compatibilidade vegetativa associado à ocorrência de anastomoses entre três haplótipos, sendo identificados três possíveis isolados recombinantes.

Identificação de genes envolvidos na interação entre Magnaporthe grisea e arroz (Oryza sativa L.)

A brusone, causada pelo fungo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr, é uma das mais importantes doenças da cultura do arroz. A resistência genética é a forma mais efetiva para o controle da doença. Os objetivos do presente trabalho foram: identificar genes envolvidos na resposta de resistência à infecção de M. grisea em arroz através das técnicas de expressão diferencial; obter e caracterizar uma biblioteca de cDNAs utilizando como modelo linhas quase-isogênicas de arroz (NILs = Near Isogenic Lines), contendo os genes de resistência Pi-1 e Pi-2; e avaliar e comparar a expressão diferencial de mRNAs, através dos cDNAs isolados em uma série de cultivares com resposta distinta à infecção de M. grisea. Foram identificados dois isolados com virulência diferencial para as NILs e um isolado para os cultivares. Os cDNAs relacionados à resistência do arroz à M. grisea foram identificados a partir de mRNAs isolados das NILs. Foram obtidos 30 fragmentos de cDNAs e 232 clones de cDNAs pelas técnicas de cDNA-AFLP e SSH, respectivamente. A análise das seqüências permitiu identificar genes envolvidos nos processos de metabolismo, transporte de íon inorgânico; transdução de sinais; fatores de transcrição; metabolismo de coenzima; conversão e produção de energia; metabolismo e transporte de carboidrato e biossíntese de proteína. Noventa clones isolados através da técnica de SSH foram selecionados e a expressão diferencial foi avaliada via hibridização em macroarranjos de cDNAs. A ausência de conservação entre os mRNAs diferencialmente expressos nas interações analisadas e a diversidade dos grupos de genes reflete a complexidade das respostas. A análise funcional in vivo desses genes poderá contribuir para utilização dos mesmos na obtenção de uma resistência de espectro amplo à brusone do arroz.