Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Les récepteurs 5-HT4b adoptent différentes conformations ligand-spécifique ayant des propriétés de signalisation et de régulation distinctes

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur.

GPCR structure, function, drug discovery and crystallography: report from Academia-Industry International Conference (UK Royal Society) Chicheley Hall, 1-2 September 2014

G-protein coupled receptors (GPCRs) are the targets of over half of all prescribed drugs today. The UniProt database has records for about 800 proteins classified as GPCRs, but drugs have only been developed against 50 of these. Thus, there is huge potential in terms of the number of targets for new therapies to be designed. Several breakthroughs in GPCRs biased pharmacology, structural biology, modelling and scoring have resulted in a resurgence of interest in GPCRs as drug targets. Therefore, an international conference, sponsored by the Royal Society, with world-renowned researchers from industry and academia was recently held to discuss recent progress and highlight key areas of future research needed to accelerate GPCR drug discovery. Several key points emerged. Firstly, structures for all three major classes of GPCRs have now been solved and there is increasing coverage across the GPCR phylogenetic tree. This is likely to be substantially enhanced with data from x-ray free electron sources as they move beyond proof of concept. Secondly, the concept of biased signalling or functional selectivity is likely to be prevalent in many GPCRs, and this presents exciting new opportunities for selectivity and the control of side effects, especially when combined with increasing data regarding allosteric modulation. Thirdly, there will almost certainly be some GPCRs that will remain difficult targets because they exhibit complex ligand dependencies and have many metastable states rendering them difficult to resolve by crystallographic methods. Subtle effects within the packing of the transmembrane helices are likely to mask and contribute to this aspect, which may play a role in species dependent behaviour. This is particularly important because it has ramifications for how we interpret pre-clinical data. In summary, collaborative efforts between industry and academia have delivered significant progress in terms of structure and understanding of GPCRs and will be essential for resolving problems associated with the more difficult targets in the future.

Étude de la pharmacologie de ligands du récepteur EP4 de prostaglandine E2

La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë.

Développement d'un biosenseur BRET permettant le criblage de drogues qui causent l'activation de canaux Kir3 via les récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3.

Développement de modulateurs allostériques peptidiques inhibiteurs de l’activité des récepteurs de l’interleukine 1 et de la vasopressine

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques.

La sélectivité fonctionnelle des ligands du récepteur delta opiacé

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance.

Étude du trafic du récepteur delta-opiacé suite à sa stimulation par différents agonistes

Les opiacés figurent parmi les analgésiques les plus puissants pour le traitement des douleurs sévères. Les agonistes du DOR (récepteur delta opiacé) induisent moins d'effets secondaires que ceux du mu, ce qui les rend une cible d'intérêt pour le traitement des douleurs chroniques. Cependant, ils induisent la tolérance à l'analgésie. Des hypothèses récentes proposent que le potentiel des drogues à induire la tolérance soit la conséquence de la stabilisation de différentes conformations du récepteur induites par la liaison avec différents ligands, chacune ayant différentes propriétés de trafic. Dans ce contexte, nous avons déterminé si différents ligands du DOR différaient dans leur capacité à induire la signalisation et le trafic du récepteur. Nos résultats indiquent que DPDPE et SNC-80 sont les drogues les plus efficaces à inhiber la production d’AMPc, suivis par UFP-512, morphine et TIPP. DPDPE et SNC-80 induisent à eux seuls l’internalisation du DOR dans les cellules HEK-293 de façon dépendante de la β-arrestine mais pas de la GRK2 ni PKC. Ces deux drogues induisent également l’internalisation du DOR dans les neurones corticaux et c’est seulement le DPDPE qui permet au DOR de regagner la membrane des cellules HEK-293 et des neurones après récupération. Cette capacité de recyclage était suggérée comme un mécanisme protégeant contre la survenue de la tolérance. Ces observations indiquent que le DOR peut subir différentes régulations en fonction du ligand lui étant associé. Cette propriété de sélectivité fonctionnelle des ligands pourrait être utile pour le développement de nouveaux opiacés ayant une activité analgésique plus durable.

Mutational analysis and molecular modeling of the nonapeptide hormone binding domains of the [Arg8]vasotocin receptor.

To identify determinants that form nonapeptide hormone binding domains of the white sucker Catostomus commersoni [Arg8]vasotocin receptor, chimeric constructs encoding parts of the vasotocin receptor and parts of the isotocin receptor have been analyzed by [(3,5-3H)Tyr2, Arg8]vasotocin binding to membranes of human embryonic kidney cells previously transfected with the different cDNA constructs and by functional expression studies in Xenopus laevis oocytes injected with mutant cRNAs. The results indicate that the N terminus and a region spanning the second extracellular loop and its flanking transmembrane segments, which contains a number of amino acid residues that are conserved throughout the nonapeptide receptor family, contribute to the affinity of the receptor for its ligand. Nonapeptide selectivity, however, is mainly defined by transmembrane region VI and the third extracellular loop. These results are complemented by a molecular model of the vasotocin receptor obtained by aligning its sequence with those of other G-protein coupled receptors as well as that of bacteriorhodopsin. The model indicates that amino acid residues of transmembrane regions II-VII that are located close to the extracellular surface also contribute to the binding of vasotocin.

Structure-Function Studies of Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Selective Agonists and Positive Allosteric Modulators

This dissertation primarily describes chemical-scale studies of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in order to better understand ligand-receptor selectivity and allosteric modulation influences during receptor activation. Electrophysiology coupled with canonical and non-canonical amino acids mutagenesis is used to probe subtle changes in receptor function.

The first half of this dissertation focuses on differential agonist selectivity of α4β2-containing nAChRs. The α4β2 nAChR can assemble in alternative stoichiometries as well as assemble with other accessory subunits. Chapter 2 identifies key structural residues that dictate binding and activation of three stoichiometry-dependent α4β2 receptor ligands: sazetidine-A, cytisine, and NS9283. These do not follow previously suggested hydrogen-bonding patterns of selectivity. Instead, three residues on the complementary subunit strongly influence binding ability of a ligand and receptor activation. Chapter 3 involves isolation of a α5α4β2 receptor-enriched population to test for a potential alternative agonist binding location at the α5 α4 interface. Results strongly suggest that agonist occupation of this site is not necessary for receptor activation and that the α5 subunit only incorporates at the accessory subunit location.

The second half of this dissertation seeks to identify residue interactions with positive allosteric modulators (PAMs) of the α7 nAChR. Chapter 4 focuses on methods development to study loss of potentiation of Type I PAMs, which indicate residues vital to propagation of PAM effects and/or binding. Chapter 5 investigates α7 receptor modulation by a Type II PAM (PNU 120596). These results show that PNU 120596 does not alter the agonist binding site, thus is relegated to influencing only the gating component of activation. From this, we were able to map a potential network of residues from the agonist binding site to the proposed PNU 120596 binding site that are essential for receptor potentiation.

Identifying novel molecular mechanisms of ghrelin receptor signalling underlying neural control of food intake: interaction with stress and impulsivity

The gut-hormone, ghrelin, activates the centrally expressed growth hormone secretagogue 1a (GHS-R1a) receptor, or ghrelin receptor. The ghrelin receptor is a G-protein coupled receptor (GPCR) expressed in several brain regions, including the arcuate nucleus (Arc), lateral hypothalamus (LH), ventral tegmental area (VTA), nucleus accumbens (NAcc) and amygdala. Activation of the GHS-R1a mediates a multitude of biological activities, including release of growth hormone and food intake. The ghrelin signalling system also plays a key role in the hedonic aspects of food intake and activates the dopaminergic mesolimbic circuit involved in reward signalling. Recently, ghrelin has been shown to be involved in mediating a stress response and to mediate stress-induced food reward behaviour via its interaction with the HPA-axis at the level of the anterior pituitary. Here, we focus on the role of the GHS-R1a receptor in reward behaviour, including the motivation to eat, its anxiogenic effects, and its role in impulsive behaviour. We investigate the functional selectivity and pharmacology of GHS-R1a receptor ligands as well as crosstalk of the GHS-R1a receptor with the serotonin 2C (5-HT2C) receptor, which represent another major target in the regulation of eating behaviour, stress-sensitivity and impulse control disorders. We demonstrate, to our knowledge for the first time, the direct impact of GHS-R1a signalling on impulsive responding in a 2-choice serial reaction time task (2CSRTT) and show a role for the 5-HT2C receptor in modulating amphetamine-associated impulsive action. Finally, we investigate differential gene expression patterns in the mesocorticolimbic pathway, specifically in the NAcc and PFC, between innate low- and high-impulsive rats. Together, these findings are poised to have important implications in the development of novel treatment strategies to combat eating disorders, including obesity and binge eating disorders as well as impulse control disorders, including, substance abuse and addiction, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and mood disorders.

A crystallographic and modelling study of a human telomeric RNA (TERRA) quadruplex

DNA telomeric repeats in mammalian cells are transcribed to guanine-rich RNA sequences, which adopt parallel-stranded G-quadruplexes with a propeller-like fold. The successful crystallization and structure analysis of a bimolecular human telomeric RNA G-quadruplex, folded into the same crystalline environment as an equivalent DNA oligonucleotide sequence, is reported here. The structural basis of the increased stability of RNA telomeric quadruplexes over DNA ones and their preference for parallel topologies is described here. Our findings suggest that the 2'-OH hydroxyl groups in the RNA quadruplex play a significant role in redefining hydration structure in the grooves and the hydrogen bonding networks. The preference for specific nucleotides to populate the C3'-endo sugar pucker domain is accommodated by alterations in the phosphate backbone, which leads to greater stability through enhanced hydrogen bonding networks. Molecular dynamics simulations on the DNA and RNA quadruplexes are consistent with these findings. The computations, based on the native crystal structure, provide an explanation for RNA G-quadruplex ligand binding selectivity for a group of naphthalene diimide ligands as compared to the DNA G-quadruplex.

Effects of the Allosteric Antagonist 1-(4-Chlorophenyl)-3-[3-(6-pyrrolidin-1-ylpyridin-2-yl)phenyl]urea (PSNCBAM-1) on CB1 Receptor Modulation in the Cerebellum

PSNCBAM-1 has recently been described as a cannabinoid CB1 receptor allosteric antagonist associated with hypophagic effects in vivo; however, PSNCBAM-1 effects on CB1 ligand-mediated modulation of neuronal excitability remain unknown. Here, we investigate PSNCBAM-1 actions on CB1 receptor-stimulated [35S]GTPγS binding in cerebellar membranes and on CB1 ligand modulation of presynaptic CB1 receptors at inhibitory interneurone-Purkinje cell (IN-PC) synapses in the cerebellum using whole-cell electrophysiology. PSNCBAM-1 caused non-competitive antagonism in [35S]GTPγS binding studies, with higher potency against the CB receptor agonist CP55940 than for WIN55,212-2 (WIN55). In electrophysiological studies, WIN55 and CP55940 reduced miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) frequency, but not amplitude. PSNCBAM-1 application alone had no effect on mIPSCs; however, PSNCBAM-1 pre-treatment revealed agonist-dependent functional antagonism, abolishing CP55940-induced reductions in mIPSC frequency, but having no clear effect on WIN55 actions. The CB1 antagonist/inverse agonist AM251 increased mIPSC frequency beyond control, this effect was reversed by PSNCBAM-1. PSNCBAM-1 pre-treatment also attenuated AM251 effects. Thus, PSNCBAM-1 reduced CB1 receptor ligand functional efficacy in the cerebellum. The differential effect of PSNCBAM-1 on CP55940 versus WIN55 actions in [35S]GTPγS binding and electrophysiological studies and the attenuation of AM251 effects are consistent with the ligand-dependency associated with allosteric modulation. These data provide the first description of functional PSNCBAM-1 allosteric antagonist effects on neuronal excitability in the mammalian CNS. PSNCBAM-1 allosteric antagonism may provide viable therapeutic alternatives to orthosteric CB1 antagonists/inverse agonists in the treatment of CNS disease.

Differential phosphorylation, desensitization, and internalization of α1A-adrenoceptors activated by norepinephrine and oxymetazoline

Loss of response on repetitive drug exposure (i.e., tachyphylaxis) is a particular problem for the vasoconstrictor effects of medications containing oxymetazoline (OXY), an α1-adrenoceptor (AR) agonist of the imidazoline class. One cause of tachyphylaxis is receptor desensitization, usually accompanied by phosphorylation and internalization. It is well established that a1A-ARs are less phosphorylated, desensitized, and internalized on exposure to the phenethylamines norepinephrine (NE), epinephrine, or phenylephrine (PE) than are the a1B and a1D subtypes. However, here we show in human embryonic kidney-293 cells that the low-efficacy agonist OXY induces G protein-coupled receptor kinase 2-dependent a1A-AR phosphorylation, followed by rapid desensitization and internalization (∼40% internalization after 5 minutes of stimulation), whereas phosphorylation of α1A-ARs exposed to NE depends to a large extent on protein kinase C activity and is not followed by desensitization, and the receptors undergo delayed internalization (∼35% after 60 minutes of stimulation). Native α1A-ARs from rat tail artery and vas deferens are also desensitized by OXY, but not by NE or PE, indicating that thisproperty of OXY is not limited to recombinant receptors expressed in cell systems. The results of the present study are clearly indicative of agonist-directed a1A-AR regulation. OXY shows functional selectivity relative to NE and PE at a1A-ARs, leading to significant receptor desensitization and internalization, which is important in view of the therapeutic vasoconstrictor effects of this drug and the varied biologic process regulated by α1A-ARs. Copyright © 2013 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics.

Investigação de agonismo tendencioso em α1A- e α1B-adrenoceptores

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)