Imobilização da lacase em micropartículas de quitosana obtidas por spray drying e usadas na construção de biossensores

Biosensors based on laccase immobilized on microparticles of chitosan crosslinked with tripolyphosphate (biosensor I) and glyoxal (biosensor II) obtained by spray drying for the determinations of rutin in pharmaceutical formulations were developed. Under optimized operational conditions (pH 4.0, frequency of 30 Hz, pulse amplitude of 40 mV and scan increment of 2.0 mV) two analytical curves were obtained for both biosensors showing a detection limit of 6.2x10-8 mol L-1 for biosensor (I) and 2.0x10-8 mol L-1 for biosensor (II). The recovery of rutin from pharmaceutical sample ranged from 90.7 to 105.0% and the lifetime of these biosensors were 4 months (at least 400 determinations).

Imobilização e caracterização de lacase e seu uso na biodegradação de efluentes de indústrias papeleiras

Laccase from Aspergillus sp was immobilized on glutaraldehyde-activated chitosan beads. A comparative study between free and immobilized laccase was conducted and the potential of the resulting immobilized derivative in the biodegradation of pulp and paper mill effluent was evaluated. The immobilized laccase is more resistant to various denaturing conditions, which allows for the reduction of 65% of the phenols (total and low molecular weight) and loss of 60% of total color in the effluent. These results show the potential of the immobilized laccase in the biodegradation of phenols, the chemical agents responsible for the high toxicity of the effluent generated in cellulose pulp industries.

Imobilização de lacase de Aspergillus sp. em quitosana e sua aplicação na bioconversão de fenóis em reatores de leito fixo

The immobilization of laccase on chitosan by cross-linking and application of the immobilized laccase in the bioconversion of phenolic compounds in batch and fixed bed reactors were studied. The process for immobilization of enzyme was optimized using a rotational central composite design. The optimized conditions to generate immobilized laccase with maximal activity were determined to be a glutaraldehyde concentration of 1.0% (v/v), a pH of 6.0, an immobilization time of 5.0 hours and an enzyme concentration of 5.2 g L-1. In packed bed reactors, the activity of the immobilized enzyme is maintained for a longer time in the bioconversion of 2,6-dimethoxyphenol than in the bioconversion of syringaldazine.

Seleção de um suporte sintético para imobilizar células do Botryospaheria rhodina e comparação da produção de lacase por células livres e imobilizadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Processo de obtenção da enzima lacase por fungo marinho, enzima lacase e uso da mesma

A presente invenção está relacionada com a otimização das condições de cultivo para produção de lacase por um 5 fungo derivado de ambiente marinho. Tais condições permitiram a obtenção de quantidades significativas de lacase após a purificação (1.300 U/L) com atividade enzimática ótima em PH 3,0 e 60ºC e com peso molecular na faixa de 60 a 70 KDa. Nas condições de cultivo otimizadas a 10 enzima apresentou eficiente estabilidade frente a diferentes valores de pH e temperatura, com manutenção de 100% da estabilidade térmica após 1 h mesmo em temperatura de 62ºC, e da estabilidade frente a diferentes PHs após 48h, além da resistência a íons metálicos.

Alternativas de uso da borra de café através de hidrólise ácida, enzimática, ou como substrato para a produção das enzimas: lacase e celulase

In the industrial production of soluble coffee, huge amounts of extracted coffee residues are generated; onaverage, for eachtonne of green coffee extracted, 480 kg of coffee ground waste is produced. This is a solid residue currently used to generate energy at the steam boilers from the soluble coffee industry. Some is also used or as fertilizer on agriculture fields. Seeking a better end use, the work reported here aimed to study the viability of hydrolyzing the coffee ground residue for the production of carbohydrates. Hydrolysis was undertaken with hydrochloric acid at different temperatures and pressures, using a water bath or autoclave.An enzymatic hydrolysis with Viscozyme Lwas developed using Whatman filter paper No1 and the optimal conditions were determined using a rotational central composite experimental design (DCCR).The best conditions to hydrolyze filter paper cellulose were 50 FBG (Fungal β-glucanase) of Viscozyme L at pH 4.0 for 1.0 h and 45 ºC. The ground coffee was hydrolyzed under the same conditions as described above for filter paper, however this enzymatic hydrolysis was not efficient. A combination of enzymatic hydrolysis as a pre-treatment for the ground coffee followed by acid hydrolysis using HCl conducted in an autoclave (120 C for 2.0 h) resulted in higher production of glucose as analyzed by HPLC. Another end use of the ground coffee evaluated was as source of substrate in the culture medium to grow Botryosphaeria rhodina MAMB-05 to produce the enzymes laccase and cellulase. Highest enzyme titres obtained were with 8% (w/v) coffee grounds to which was added a minimum salts medium(Vogel), under agitation conditions (180 rpm) at 28ºC. The phenolic compounds present in the coffee grounds appear to have induced laccase by Botryosphaeria rhodina.

Biodegradação enzimática de aminas aromáticas tóxicas

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

BIiossensor Enzimático para avaliação da Capacidade Antioxidente

Os radicais livres formam-se naturalmente nos organismos vivos, pois a sua produção/geração está interligada com o processo de produção de energia (respiração), processos inflamatórios (fagocitose), regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas relevantes. Estes também podem ser introduzidos por vias exógenas (poluição, radiação, tabaco, alimentação, etc). Os radicais livres têm capacidade de reagir com o material nucleico (ADN e ARN), proteínas e substâncias oxidáveis, causando danos oxidativos responsáveis pelo envelhecimento e originar doenças degenerativas, tais como, o cancro, arteriosclerose, artrite reumatoide, entre outras. De forma a combater os efeitos pejorativos provocados pelos radicais, os organismos vivos desenvolveram complexos sistemas de defesa antioxidante. Estes sistemas são constituídos por antioxidantes endógenos, produzidos pelos seres vivos, tais como enzimas ou por antioxidantes exógenos obtidos por via da alimentação (por exemplo o ácido ascórbico). Neste sentido, um antioxidante tem capacidade de eliminar ou reduzir a propagação da cadeia de geração de radicais livres. Neste trabalho foi desenvolvido um biossensor enzimático para a quantificação da capacidade antioxidante total de matrizes alimentares. A construção deste biossensor consistiu na eletroimobilização da adenina no elétrodo de pasta de carbono (EPC) ou na adsorção física da dA20 na superfície do EPC. O dano oxidativo foi induzido pelo radical hidroxilo gerado pela reação de Fenton. Nesta dissertação, foi estudada a capacidade de alguns antioxidantes em eliminar o efeito pejorativo dos radicais livres e combater a integridade das bases de adenina ou do dA20.Os antioxidantes estudados foram o ácido ascórbico e alguns ácidos fenólicos como o ácido hidroxibenzoico (ácido gálico) e ácidos hidroxicinâmicos (ácido cafeico e ácido cumárico). Estes antioxidantes têm a capacidade de neutralizar o radical hidroxilo e proteger a adenina/dA20 imobilizado na superfície do EPC. O comportamento da Lacase foi estudado na presença do ácido gálico e do ácido ascórbico. Os estudos eletroquímicos foram realizados através da voltametria de onda quadrada (VOQ), sendo que a interação entre a adenina/ou o dA20 imobilizada na superfície do EPC e os radicais livres na ausência e presença de antioxidantes foi avaliada por meio de mudanças no pico anódico produzido pela oxidação da adenina /dA20. Os resultados demonstraram que estes biossensores permitem a avaliação da capacidade antioxidante total em águas aromatizadas.

HDL in HIV-1 infection: a quality perspective through paraoxonase-1 activities

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Triagem de hidrolases por metagenômica de solos agrícolas do Norte do Paraná.

Hidrolases englobam um grupo de enzimas que catalisam a quebra de ligações covalentes em reação com água; entre elas estão as proteases, amilases, lipases, pectinases, celulases e catalases. Essas enzimas são muito importantes, com ampla utilização na indústria em geral. O solo é um ambiente muito rico e diverso em microrganismos, sendo considerado a maior fonte para obtenção de substâncias, enzimas e antibióticos, por exemplo. Com a metagenômica, passou a ser possível acessar melhor esse potencial microbiano, permitindo a descoberta de novos genes e biomoléculas. Neste estudo foram coletadas amostras de solos (0-10 cm de profundidade) do norte do Paraná visando buscar hidrolases microbianas funcionais. Foi realizada a extração do DNA de um Latossolo Vermelho Eutroférrico sob quatro manejos de solo e de culturas distintos e as amostras foram submetidas ao sequenciamento utilizando a plataforma 454 (Applied Science). As sequências de DNA foram comparadas com o banco de dados não redundante (NR) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) para busca de similaridade com proteases, amilases, lipases, pectinases, celulases e catalases. A partir do DNA total foram realizadas reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) com primers degenerados direcionados para a amplificação de pectinases, celulases e lacases e os produtos de PCR foram purificados com Purelink kit (Invitrogen®) e sequenciados (ABI 3500xL, Aplied Biosystems®). A comparação com as sequências do NCBI e KEGG resultou na identificação de 1.137 sequências com grande similaridade com a enzima lacase; 16.883 sequências para celulase; 2.001 para pectinase; 1.006 para amilase; e 3.725 para lipase. Esses resultados mostram que esses solos agrícolas representam uma fonte importante de recursos biológicos para aplicação industrial, principalmente de enzimas celulases. Até o presente momento, o sequenciamento de 26 produtos amplificados por PCR apresentou identidade para uma amostra, que foi identificada como a enzima celulase.

Molecular targeting of proteins by homocysteine: implications in familial and clinical hypercholesterolemia

Cardiovascular diseases (CVDs) are one of the leading causes of death and disability worldwide and one of its underlying causes is hypercholesterolemia. Hypercholesterolemia can have genetic (familial hypercholesterolemia, FH) and non-genetic causes (clinical hypercholesterolemia, CH), the first much more severe, with occurrence of premature atherosclerosis. While the pathophysiological role of homocysteine (Hcy) on CVD is still controversial, molecular targeting of protein by S and N-homocysteinylation offers a new paradigm to be considered in the vascular pathogenesis of hypercholesterolemia. On this regard, the present study aims to give new insights on protein targeting by Hcy in both CH and FH conditions. A total of 187 subjects were included: 65 normolipidemic and 122 hypercholesterolemic. Total (tHcy) and free (fHcy) fractions were quantified in serum samples after validation of an HPLCFD method, to assess S-homocysteinylation. Also, the lactonase (LACase) activity of paraoxonase-1 (PON1) was quantified by a colorimetric assay, as a surrogate of N-homocysteinylation. tHcy does not differ among groups. Nevertheless, fHcy declines in the hypercholesterolemic groups, with more evidence to the FH population. Consequently, there seems to be an increase of Shomocysteinylation, regardless of lipid lowering therapy (LLT). Also, despite of LLT use, LACase activity is lower in FH, thus the risk for protein N-homocysteinylation seems to be higher. Moreover, the decrease in LACase/ApoA1 and LACase/HDL ratios in FH, shows that HDL is dysfunctional in this population, despite its normal concentration values. Data supports that the pathophysiological role of Hcy on hypercholesterolemia may reside in its ability to post-translationally modify proteins. This role is particularly evident in FH condition. In the future, it will be interesting to identify which target proteins are modified and thus involved in vascular pathology progression.

Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel): detecção de enzimas extracelulares em isolados normais e alterados por temperatura

O fungo Cylindrocladium spathiphylli causa podridão no colo e nas raízes de espatifilo, induzindo amarelecimento e murcha nas folhas da parte aérea. Há poucos estudos com o fungo quanto às enzimas extracelulares. Assim, delineou-se ensaio inteiramente casualizado in vitro, com três tratamentos (dois isolados normais: LFEEI016 - EPAGRI/SC e MMBF 01/01 - IB/SP; mais testemunha) e seis repetições, visando a detecção de enzimas. A amilase (AM), lipase (LP), carboximetilcelulase (CMC) e lacase (LC) foram mensuradas pelo cálculo da área da coroa circular, local de atividade das enzimas. A catalase (CT) e gelatinase (GL) foram mensuradas por símbolos, depois transformados em notas (1 a 4, de ausência à intensa produção). O isolado MMBF 01/01 produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC e depois a LP. LFEEI016 e MMBF 01/01 não apresentaram área para AM e CMC e exibiram intensidade fraca e igual para CT. A intensidade de GT foi moderada no MMBF 01/01 (nota média 3,0) e ausente para o LFEEI016 (nota média 1,0). Após a produção das enzimas extracelulares, os isolados foram alterados vegetativamente por temperatura. Instalou-se ensaio inteiramente ao acaso, em fatorial contendo disco de micélio dos isolados do fungo versus três temperaturas [23ºC (T1); 33ºC (T2) e de 33ºC para 23ºC (T3)] versus quatro períodos (3; 6; 9 e 12 dias), com oito repetições, em placa de Petri com BDA mantida em BOD. O diâmetro das colônias foi medido diariamente (mm) em dois sentidos. As alterações de temperatura vistas foram: inócuo, fungistático (FS) e fungicida (FC). Aplicou-se estatística nas temperaturas T1 e T3 dos isolados para checar efeito FS e escolher aqueles com maior e menor efeito. O isolado LFEEIO16 mostrou efeito FS com três dias às temperaturas 33ºC e de 33ºC para 23ºC. Nos demais períodos, o isolado sofreu efeito FC. O MMBF 01/01 mostrou efeito FS em todos os períodos. Ambos isolados sofreram, estatisticamente, efeito FS. O MMBF 01/01 mostrou maior efeito FS aos nove dias, nas temperaturas referidas e menor com três dias. Após a constatação de alteração na taxa de crescimento micelial dos isolados, procurou-se verificar, novamente, a produção de enzimas extracelulares. Os isolados alterados e utilizados foram o MMBF 01/01 com três e nove dias e o LFEEIO16 com três dias. A produção e a avaliação das enzimas foram realizadas da mesma maneira para os isolados normais. O isolado MMBF 01/01 - três dias produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC. Após LC, a área da LP foi maior que a da CMC nos isolados. Não se detectou área de AM nos isolados. A intensidade de GL foi maior que a da CT nos isolados MMBF 01/01 com três e nove dias. Para LFEEI016 - três dias, a intensidade média de CT foi nota 2,0 e ausência de GL (nota média 1,3). Sugere-se investigar a severidade da doença na planta entre os isolados e em condições naturais investigar a evolução da LC em comparação as demais enzimas na patogênese do fungo na cultura.

Produção de enzimas extracelulares por Ceratocystis spp.

O gênero Ceratocystis contempla diversas espécies distribuídas em vários lugares do mundo. No Brasil ocorrem relatos da existência de três espécies, sendo elas: C. cacaofunesta, C. paradoxa e C. fimbriata, sendo esta última relacionada a doença em culturas de importância econômica. O trabalho objetivou verificar, em meios de cultura específicos, a produção das enzimas extracelulares amilase, lipase, celulase, protease, lacase e lignina peroxidase e pectiliase (pectato-liase) por isolados de Ceratocystis sp. Foram usados 41 isolados: 3 de mangueira (Mangifera indica), 19 de eucalipto (Eucalyptus spp.), 15 de cacaueiro (Theobroma cacao), 2 de Teca (Tectona grandis) e 2 de atemóia (Annona sp.). As colônias foram incubadas no escuro a 25ºC , com exceção do meio para detecção de pectinase que foi incubado sob fotoperíodo alternado. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 4 repetições. A partir dos meios específicos foi possível detectar a produção de amilase, lacase e protease quase na totalidade dos isolados Ceratocystis sp. testados. Não foi observada a produção de celulase, lípase e pectatoliase. A produção da enzima lignina peroxidade foi detectada em pouca quantidade e em somente alguns isolados do fungo. Este perfil enzimático obtido da população do fungo pode auxiliar em futuros estudos relacionados com a caracterização deste.

Produção in vitro de enzimas extracelulares por fungos e sua relação com os sintomas descritos em planta hospedeira

RESUMOOs fungos fitopatogênicos habitantes de solo causam perdas econômicas em muitas culturas e são difíceis de serem controlados. Esses fungos podem ser agrupados pelos sintomas comuns que causam nas plantas, bem como pelas enzimas extracelulares que podem produzir. O objetivo do trabalho foi verificar a produção in vitro de enzimas extracelulares por fungos de solo e tentar relacionar essas enzimas com os sintomas que cada fungo causa em planta hospedeira. O ensaio foi delineado em esquema inteiramente casualizado, com dois fatores, sete fungos (Cylindrocladium spathiphylli, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Ceratocystis fimbriata, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi e Verticillium dahliae) mais testemunha e seis enzimas (amilase, carboximetilcelulase, lipase, lacase, catalase e gelatinase) com 10 repetições. Catalase e gelatinase foram mensuradas por escala de notas, enquanto que as demais pelo cálculo da área da coroa circular. O ensaio foi repetido e a análise foi realizada com os dados de dois ensaios. Os fungos que causam podridão na raiz ou no colo da planta apresentaram maior produção de lacase, enquanto os que causam obstrução, fendas ou até a destruição do sistema vascular demonstraram a prevalência da lipase.

Aproveitamento do resíduo de laranja para a produção de enzimas lignocelulolíticas por Pleurotus ostreatus (Jack:Fr)

Neste trabalho propomos o aproveitamento dos resíduos de laranja gerados após remoção do suco como substrato para a obtenção de enzimas hidrolíticas e oxidativas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos, tais como: lacase (EC 1.10.3.2), manganês peroxidase (EC 1.11.1.14), xilanase (EC 3.2.1.8) e endo-1,4 glucanase (EC 3.2.1.4), pelo basidiomiceto Pleurotus ostreatus cultivado em estado sólido. O fungo desenvolveu-se bem no resíduo, em diferentes umidades iniciais e sem a necessidade de qualquer suplementação. O meio à base de resíduo de laranja proporcionou a obtenção de elevadas atividades de enzimas com grande potencial de uso industrial, especialmente lacase (74,3 U.g -1 substrato após 15 dias de cultivo) e manganês peroxidase (6,8 U.g -1 substrato após 30 dias de cultivo).