Mediterranean spotted fever and identification of new agents of rickettsioses in Portugal : epidemiological determinants, host and microbial features in portuguese patients

Resumo: a febre botonosa, também conhecida por febre escaro-nodular (FEN) é uma doença endémica nos Países da bacia do Mediterrâneo, África, Médio Oriente, Índia e Paquistão. O agente etiológico responsável por esta patologia é a bactéria Rickettsia conorii. Contudo, em alguns países, como Portugal e Itália, esta patologia é causada por duas estirpes diferentes: R conorii Malish e R conorii Israeli spotted fever strain. O principal vector e reservatório é o ixodídeo Rhipicephalus sanguineus. Mesmo com uma elevada taxa de subnotificação detectada no nosso País, a taxa incidência da FEN é de 8.4/105 habitantes (1989-2005), uma das mais altas quando comparada coom a de outros países da bacia do Mediterrâneo. De todos os distritos portugueses, Bragança e Beja são aqueles que apresentam as taxas de incidência mais elevadas, 56,8/105 habitantes e 47,4 / 105 habitantes respectivamente. Em Portugal, as alterações climáticas verificadas na última década, nomeadamente a subida das temperaturas médias anuais, parecem ter influenciado o ciclo de vida do vector e a sua dinâmica sazonal, permitindo ao R. sanguineus completar mais de um ciclo de vida por ano. Este facto, e a possibilidade deste vector se manter activo noutros meses do ano, nomeadamente nos meses de inverno, tem influenciado consequentemente o padrão de distribuição anual dos casos de FEN. A febre escaro-nodular caracteriza-se clinicamente como uma doença exantemática, com um processo de vasculite generalizado. Apesar de na generalidade ser considerada uma doença benigna (quando tratada atempadamente e com terapêutica adequada e específica)e de estarem descritos casos graves em cerca de 5-6% dos doentes, em Portugal essa percentagem aumentou e consequentemente levou a um aumento de casos fatais. Este facto tornou-se mais evidente em 1997, no Hospital Distrital de Beja e no Hospital Garcia de Orta, onde a taxa de letalidade atingiu os 32% e 18% respectivamente.Para além dos factores de co-morbilidade encontrados nos doentes mais graves, como diabetes mellitus, ou o atraso na instituição da terapêutica específica, foi colocada de que a estirpe R. conorii Israel spotted fever strain pudesse ser mais virulenta ou então estivesse associada a diferentes manifestações clínicas que dificultassem o diagnóstico clínico e a instituição atempada da terapêutica. Houve ainda a necessidade de avaliar alguns parâmetros imunológicos dos doentes e tentar identificar que factores, nomeadamente que citoquinas, poderiam estar envolvidos na resposta a uma infecção por R.conorii.Face a estas questões foi avaliada e comparada a epidemiologia, manifestações clínicas e laboratoriais de 140 doentes (71 infectados com R. conorii Malish e 69 infectados com R. conorii Israel spotted fever strain). Concluiu-se que existe uma sobreposição de manifestações clinicas entre os dois grupos de doentes, mas que a percentagem da escara de inoculação é significativamente inferior em doentes infectados com R. conorii Israel spotted fever strain. Dos resultados mais importantes encontrados neste estudo concluiu-se que a estirpe R. conorii Malish e é demonstrado, pela primeira vez, estatisticamente que o alcoolismo é um factor de risco para a morte de doentes com FEN. Associadas a factores de um mau prognósitco da doença, estão as manifestações gastrointestinais, que poderão ser ou não reflexo de alterações do sistema nervoso central, e ainda a alteração de parâmetros laboratoriais como a presença de hiperbilirubinemia e aumento dos valores da ureia.A maior parte dos estudos realizados sobre os mecanismos da resposta imunitária à infecção por R. conorii e as interacções hospedeiro - agente etiológico têm sido elucidados com base em modelos animais. Poucos estudos têm sido efectuados em doentes e nenhum estudo prévio tinha sido realizado no sentido de avaliar localmente (escara/pele) quais os mediadores ou outras moléculas envolvidas na resposta imunitária às rickettsioses. Foi avaliado o nível de expressão génica de RNA mensageiro (RNAm)de diferentes citoquinas em amostras de pele de doentes com FEN pela técnica de PCR em tempo real.Os resultados deste estudo mostraram que, quando comparado com o grupo controlo, os 23 doentes analisados apresentavam níveis estatisticamente significativos, mais elevados de expressão génica de interferão (IFN-γ, Tumor necrosis factor (TFN-α, interleucina 10 (IL-10, RANTES (regulated by activation, normal T-cell-expressed and secreted chemokine)e indolamina 2-3 desoxigenase (IDO),uma enzima envolvida no controlo e limitação do crescimento intracelular das rickettsias, através da degradação do triptofano. Seis dos 23 doentes apresentaram ainda niveis de expressão elevados de óxido nítrico indutível (iNOS)que actua como microbicida. Encontrou-se uma correlação positiva entre a expressão de RNAm de TNF-α, γ, iNOS e IDO e os casos menos graves de FEN sugerindo um tipo de resposta imunitária tipo Th1, i.e. com papel protector na resposta à infecção.Verificou-se também que os valores de expressão genética do RNAm de IL-10, estavam inversamente correlacionados com a expressão do RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão génica do RNAm de IL-10 estavam inversamente correlacionados com a expressão RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre uma resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão RNAm da quimoquina RANTES foram estatisticamente mais elevados em doentes graves.Nesta dissertação é ainda descrita uma nova rickettsiose presente em Portugal, causada pela bactéria R. sibirica mongolitimonae, que foi identificada laboratorialmente por isolamento do agente, e por detecção do DNA em biopsia de pele. A presença deste agente foi ainda corroborada pela detecção em paralelo do mesmo agente no ixodídeos como R. africae like e em pulgas como R. felis e R.typhi alertam para a possibilidade de existência de outras rickettsioses que possam estar diagnosticadas em Portugal. Abstract: Mediterranean spotted fever (MSF), a tick-borne disease caused by Rickettsia conorii, is widley distributed in the Old World, being endemic in the southern Europe, Africa, Middle East, India and Pakistan. In Portugal two strains cause disease: R.conorii Malish and R.conorii Israeli spotted fever.Rhipicephalus sanguineus, the brown dog tick, is considered the main vector and reservoir. MSF is characterized by seasonality, and most of cases are encountered in late spring and summer, peaking in July and August. However, CEVDI/INSA laboratory has observed that the incidence of MSF cases has changed during winter season.The increasing annual averages of air temperatures and warmer and drier winters might have influenced the dynamics of the life cycle and activity of R. sanguineus, and indirectley the number MSF cases during the so called MSF off-season.In the period of 1989-2005, the incidence rate of MSF was 8.4/105 inhabitants, one of the highest rates compared with other endemic countries. In the Portugal during the same period, the highest incidence rates were reported in the districts of Bragança, with 56.8/105 inhabitants, and Beja, with 47.4/105 inhabitants. Severe cases of MSF are reported in 6% of the patients, but it seems that this pattern of disease in Portugal has been changing.This factor became more evident in 1997, with a reported case fatality rate of 32% and 18% in patients with MSF admited at Beja and Garcia Orta Hospitals, respectively. Although it was found that diabetes mellitus and delay in therapy have been implicated as a risk factor for death, the hypothesis was considered, that the new ISF strain isolated from Portugueses patients in the same year (1997)causes different or atypical clinical conorii Malish strain. The local (skin biopsies) immune response to R. conorii infection was also evaluated.A prospective study was performed to characterized epidemiological, clinical, laboratory features and determined risk factors for a fatal outcome. One hundred forty patients (51% patients were infected with Rickettsia conorii Malish stain and 49% with Israeli spotted fever strain)with diagnosis documented with identification of the causative rickettsial strain were admitted to 13 Portugueses Hospitals during 1994-2006.Comparison of the clinical manifestations of MSF caused by Malish and ISF strains revealed tremendous overlap that would not permit clinical recognition of the strain envolved, but an eschar was observed in a significantly higher percentage of patients with Malish than ISF strain.A fatal outcome was significantly more likely for patients with ISF strain infection meaning that ISF strain was more virulent than Malish strain, and also alcoholism was a host risk factor for a fatal outcome.The pathophysiology of a fatal outcome involved significantly greater incidence of petechial rash, gastrointestinal symptoms, confusion/obtundation, dehydration, tachypnea, hepatomegaly, leukocytosis, coagulopathy, azotemia, hyperbilirubinemia, and elevated hepatic enzymes and creatine kinase. Multivariate analysis revealed that acute renal failure and hyperbilirubinemia were most strong associated with a fatal oucome of infections with both strains.The immune response to R. conorii infection determined with both strains. The immune response to R. conorii infection determined by the expression levels of inflammatory and immune mediators in skin biopsies collected from untreated patients with Mediterranean spotted fever reveal that intralesional expression of mRNA of TNF-α, IFN-γ, IL-10, RANTES, and indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO)an enzyme involved in limiting rickettsial growth by tryptophan degradation, were elevated in skin of MSF patients compared to controls. Six patients had elevated levels of inducible nitric oxide synthase (NOS2, a source microbicidal nitric oxide.Positive correlations among TNF-α, IFN-γ, NOS2,IDO and mild-to-moderate disease suggested that type 1 polarization plays a protective role. Significantly high levels of intralesional IL-10 were inversely correlated with IFN-γ and TNF-α. The chemokine RANTES was significantly higher in patients with several MSF. It seems that MSF patients with mild-to-moderate disease have a strong and balanced intralesional pro-inflammatory and anti-inflammatory response, while severe disease is associated with higher chemokine expression.Whether these findings are simply a correlate of mild and severe disease or contribute to anti-rickettsial immunity and pathogenesis remains to be determined.In this dissertation is also described a new rickettsiois present in Portugal caused by R.sibirica mongolitimonae strain, identified based on agent isolation and DNA detection by PCR technique in a skin biopsy.The presence of this agent corroborated by its detection also in Rhipicephalus pusillus tick. Also, pathogenic tick and flea-borne rickettsial agents such as R. africae strain detected in Rhipicephalus bursa tick, and R.felis and R.typhi detected in different fleas species raise the alert for the possible existence of other rickettsioses in Portugal that might be underdiagnosed.

Caracterização da população de ectoparasitos em cães de núcleos de expansão urbana de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil

No presente trabalho caracterizou-se a população de ectoparasitos em cães de núcleo de expansão urbana de Juiz de Fora, MG. As coletas foram realizadas de julho a setembro de 2003, examinando-se 101 cães SRD (sem raça definida). Os ectoparasitos foram coletados através de inspeção visual e tátil dos animais e acondicionados em frascos com etanol 70°GL e identificados sob estereoscopia. Espécimes foram clarificados e montados para análise em microscopia fotônica. Dentre os sifonápteros, Ctenocephalides felis foi mais prevalente (64,35%) com intensidade média de 6,12 ± 5,37 sifonápteros/cão, seguido por Rhopalopsyllus lutzi (3,96%), híbrida C. felis X C. canis (1,98%), Tunga penetrans (1,98%). Aúnica espécie de fitiráptero encontrada foi Trichodectes canis (7,92%) com 1,3 ± 0,51 fitiráptero/cão. Dentre os ixodídeos, Rhipicephalus sanguineus foi a espécie mais prevalente (49,50%) com intensidade média de 6,44 ± 10,2 ixodídeos/ cão, seguido por Amblyomma cajennense (3,96%), Boophilus microplus (2,97%), A. ovale (1%) e A. aureolatum (1%). As ninfas de ixodídeos foram separadas em ninfas de Amblyomminae (58,41%) com 10,11 ± 10,09 ninfas/cão e ninfas Rhipicephalinae (24,75%) com 2,64 ± 3,25 ninfas/cão. em 3,96 % dos cães foram encontradas larvas de ixodídeo.

Avaliação da resistência em caprinos a ninfas do carrapato Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) e da reatividade cruzada com A. hebraeum (Koch, 1844) (Acari:Ixodidae)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Caracterização fitoquímica e avaliação dos potenciais antimicrobiano e carrapaticida de extrativos vegetais de Tagetes patula L. (Asteraceae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Potencial acaricida do óleo de andiroba Carapa guianensis Aubl. sobre fêmeas adultas ingurgitadas de Anocentor nitens Neumann, 1897 e Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806

Avaliou-se o potencial acaricida in vitro do óleo da semente da andiroba (Carapa guianensis) sobre fêmeas ingurgitadas de Anocentor nitens (n=210) e Rhipicephalus sanguineus (n=140), coletadas manualmente, respectivamente, de equinos e de cães naturalmente infestados. Para o teste de imersão, empregaram-se cinco diluições do óleo de andiroba, 100%, 50%, 30%, 25% e 10%, em água destilada, utilizando-se tween 80 como dispersante. No teste com A. nitens, foram usadas três repetições para cada diluição, utilizando-se 10 fêmeas ingurgitadas para cada tratamento. No teste com R. sanguineus, usaram-se duas repetições, e formaram-se, ainda, dois grupos-controle para cada espécie de ixodídeo, um com água destilada e outro com tween 80 mais água destilada. Após os testes, as fêmeas foram mantidas em laboratório sob temperatura ambiente. Observou-se mortalidade das fêmeas ingurgitadas e redução de postura, neste caso, com ovos inférteis, demonstrando eficácia de 100% nas duas espécies em todas as diluições testadas. Os dados obtidos evidenciaram a potencialidade do uso do extrato de andiroba contra A. nitens e R. sanguineus.

Ação do extrato de glândulas salivares de fêmeas do carrapato Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) sobre a inibição da proliferação de células de linhagem tumoral

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Clínica e cirurgia de animais de companhia

Este relatório foi realizado no âmbito da conclusão do mestrado integrado em medicina veterinária da Universidade de Évora, encontrando-se dividido em duas partes. A primeira é referente à casuística acompanhada ao longo do estágio curricular, decorrido no Hospital Veterinário do Restelo (HVR), com a duração de quatro meses, desde 03 de Agosto de 2015 a 06 de Dezembro de 2016, sob orientação da Doutora Sandra Branco e coorientação do Dr. Diogo Magno, subdiretor clínico do HVR. A segunda parte é constituída por uma monografia subordinada ao tema “Erliquiose Monocítica Canina”, seguida de um caso clínico acompanhado pelo autor no âmbito do referido tema. A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença infeciosa transmitida por um vetor, o ixodídeo Riphicephalus sanguineus, cujos controlos químicos e ambientais são essenciais para reduzir a prevalência da doença. É causada por uma bactéria intracelular, Ehrlichia canis, que afeta o sistema imunitário dos cães, manifestando diferentes fases de evolução e podendo apresentar formas aguda e crónica da doença. O tratamento de primeira escolha é o uso da antibioterapia com tetraciclinas, dentre as quais a doxiciclina, para além do tratamento de suporte, como a fluidoterapia. O prognóstico é variável, dependendo da precocidade e eficiência da terapêutica instituída; ABSTRACT: The present report, wrote to get the master degree in veterinary medicine area, on Universidade de Évora, is divided up into two distinct parts. On one hand it describes the clinical situations’ roll, assisted through the experimental trainee, that took place on Hospital Veterinário do Restelo (HVR), for a period of four months, specifically since 3 august 2015 until 6 december 2015, and this trainee was led by Doctor Sandra Branco, and also the HVR’s clinical subdirector Dr. Diogo Magno. On other hand the second parts reveals a monograph titled “ehrlichiosis monocytic canine” (EMC), specifying a particular clinical case followed by the author. The EMC an infectious disease transmitted by a tick - Riphicephalus sanguineus – whose chemical controls and even the environmental ones are crucial to reduce the disease’s prevalence. The disease has an intracellular bacteria origin - Ehrlichia canis – responsability for the dog’s immune system infection, and it reveals different evolution phases and present acute or in some cases chronic forms. The treatment’s first step is to use an antibiotic with tetracycline that include doxycycline, and as a fluid’s therapy addition is use to do the supportive treatment. The diagnosis is variable so it depends on precocity evaluation and even on the therapeutics efficiencies.