Novas fontes de antioxidantes e inibidores de enzimas relevantes para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2 e doença de Alzheimer

Dissertação de mest., Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2009

Variabilidade da protease NS3 do vírus da hepatite C e avaliação das mutações de resistência em pacientes não tratados com inibidores de protease

Pós-graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) - FMB

Herança genética e marcadores moleculares associados à resistência de Euphorbia heterophylla L. aos herbicidas inibidores da ALS e PROTOX

This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.

Boronic acids as partners in multicomponent reactions

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Novas alternativas terapêuticas para a administração oral da insulina

A Diabetes Mellitus é uma doença metabólica que se caracteriza fundamentalmente pela ausência de produção de insulina (sendo por isso designada de diabetes tipo 1), ou no caso de produzir a hormona, o organismo não consegue utilizá-la eficazmente (neste caso designada de diabetes tipo 2). Trata-se de uma doença em franca expansão e surge nos dias de hoje como uma das grandes preocupações para os profissionais de saúde. O aparecimento das complicações associadas à doença está relacionado com o controlo dos níveis sanguíneos de glucose. Nos casos de total ausência de produção de insulina (diabetes do tipo 1), o controlo da doença engloba injecções de insulina diárias, geralmente mais do que uma vez por dia, aliadas a um exercício físico frequente e a uma alimentação cuidada. Em termos terapêuticos, a insulina continua a ser a única forma de tratamento da diabetes do tipo 1. Até à data, a insulina tem sido administrada exclusivamente pela via parentérica. A investigação nesta doença incide na procura de novas vias de administração alternativas de insulina e na procura de novas terapêuticas com recurso, por exemplo, de implantação de células Pancreáticas. Entre as vias de administração alternativas de insulina, destaca-se a investigação na via de administração oral de insulina uma vez que esta é considerada a via mais favorável do ponto de vista do doente mas também porque reproduz mais fielmente o que se passa num indivíduo sem a doença. O presente artigo resume algumas das estratégias que foram investigadas e/ou outras estratégias que ainda se encontram sob investigação nomeadamente as tecnologias que envolvem promotores de absorção, inibidores enzimáticos, células, micro e nanopartículas ou combinações de estratégias anteriores.

Preparação e determinação da atividade toxicológica do pró-fármaco hidroximetilnitrofural, potencialmente antichagásico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Atividades biológicas de extratos salinos de sementes de plantas da caatinga contra Aedes Aegypti e investigação da participação de proteínas bioativas

Dengue fever, currently the most important arbovirus, is transmitted by the bite of the Aedes aegypti mosquito. Given the absence of a prophylactic vaccine, the disease can only be controlled by combating the vector insect. However, increasing reports of resistance and environmental damage caused by insecticides have led to the urgent search for new safer alternatives. Twenty - um plant s eed extracts from the Caatinga were prepared , tested and characterized . Sodium phosphate ( 50 mM pH 8.0) was used as extractor. All extracts showed larvicidal and ovipositional deterrence activity . Extracts of D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses , C. ferrea and C. retusa were able to attract females for posture when in low co ncentration . In the attractive concentrations, the CE of E. contortisiliquum and A. cearenses were able to kill 52% and 100% of the larvae respectively . The extracts of A. cearenses , P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva and S. brasiliensis were also pupicides, while extracts of P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum , A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora , B. cheilantha , S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana displayed adulticidal activity. All extracts were toxic to C. dubia zooplankton . The EB of E. velutina and E. contortisiliquum did not affect the viability of fibroblasts . In all extracts were identified at least two potential insecticidal proteins such as enzyme inhibitors, lectins and chitin - binding proteins and components of secondary metabolism . Considering all bioassays , the extracts from A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum , S. brasiliensis, E. velutina and M. urundeuva were considered the most promising . The E. contortisiliquum extracts was the only one who did not show pupicida activity, indicating that its mechanism of action larvicide and adulticidal is related only to the ingesti on of toxic compounds by insect , so it was selected to be fragmenting. As observed for the CE , th e protein fractions of E. contortisiliquum also showed larvicidal activity, highlighting that F2 showed higher larvicidal activity and lower en vironmental toxicity than the CE source. The reduction in the proteolytic activity of larvae fed with crude extra ct and fractions of E. contortisiliquum suggest ed that the trypsin inhibitors ( ITEc) would be resp onsible for larvicidal activity . However the increase in the purification of this inhibitor resulted in loss of larvicidal activity , but the absence of trypsin inhibitor reduced the effectiveness of the fractions , indicating that the ITEC contributes to the larvicidal activity of this extract. Not been observed larvicidal activity and adulticide in rich fraction vicilin, nor evidence of the contribution o f this molecule for the larvicidal activity of the extract. The results show the potential of seeds from plant extracts of Caatinga as a source of active molecules against insects A. aegypti at different stages of its development cycle, since they are comp osed of different active compounds, including protein nature, which act on different mechanisms should result in the death of insec

Estudo fitoquímico e biológico das folhas de Banisteriopsis argyrophylla (A. Juss.) B. Gates (Malpighiaceae)

With the increasing fungi resistance compared with existing drugs on the market and the side effects reported by some compounds with antioxidant properties and enzymatic inhibitors, in particular against α-amylase and α-glucosidase, the discovery of new compounds with biological potential, becomes a need. In this context, natural products can be an important source for the discovery of new active molecular architectures. Then, this study aimed to evaluate the antioxidant activity, the enzymatic inhibitory activity of α-amylase and α-glucosidase, the antifungal and cytotoxic activities of ethanolic extract (EE) the leaves of Banisteriopsis argyrophylla (Malpighiaceae) and their fractions, obtained by liquid-liquid extraction using solvents of increasing polarity. The antioxidant activity was evaluated by the free radical DPPH scavenging method (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and the ethyl acetate fractions (FAE) and n-butanol (FB) were the most active, confirmed by the peak current and the oxidation potential obtained by differential pulse voltammetry (DPV). The inhibitory activity of the α-amylase and α-glucosidase was analyzed considering the reactions between substrates α-(2-chloro-4-nitrophenyl)-β-1,4-galactopiranosilmaltoside (Gal-α-G2-CNP) and 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (p-NPG), respectively. Initially, it was found that the EE showed considerable activity against α-amylase (EC50 = 2.89±0.1 μg m L–1) compared to the acarbose used as positive control (EC50 = 0.08±0.1 μg mL–1) and that did not showed promising activity against the α-glucosidase. After this observation we evaluated the inhibitory activity of α-amylase fractions, with FAE (EC50 = 2.33±0.1 μg mL–1) and FB (EC50 = 2.57 ± 0.1 μg mL–1) showing the best inhibitions. The antifungal activity was evaluated against Candida species, and the FAE had better antifungal potential (MIC's between 93.75 and 11.72 μg mL–1) compared with amphotericin as positive standard (MIC = 1.00 and 2.00 μg L–1 for C. parapsilosis and C. krusei used as controls, respectively). The EE (CC50 = 360.00 ± 12 μg mL–1) and fractions (CC50's> 270.00 μg mL–1) were considerably less toxic to Vero cells than the cisplatin used as positive control (CC50 = 7.01 ± 0 6 μg mL–1). The FAE showed the best results for the activities studied, this fraction was submitted to ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS)), and the following flavonoids have been identified: (±)-catechin, quercetin-3-O-β-D-Glc/ quercetin-3-O-β-D-Gal, quercetin-3-O-β-L-Ara, quercetin-3-O-β-D-Xyl, quercetin-3-O-α-L-Rha, kaempferol-3-O-α-L-Rha, quercetin-3-O-(2''-galoil)-α-L-Rha, quercetin-3-O-(3''-galoil)-α-L-Rha and kaempferol-3-O-(3''-galoil)-α-L-Rha,. FAE was submitted to column chromatography using C18 phase, and (±)-catechin was isolated (FAE-A1, 73 mg) and three fractions consisting of a mixture of flavonoids were obtained (FAE-A2, FAE-A3 and FAE-A4). These compounds were identified by thin layer chromatography (TLC) and (–)-ESI-MS. The (±)-catechin fraction showed an MIC = 2.83 μg ml–1 in assay using C. glabrata, with amphotericin as positive control. The fractions FAE-A2, FAE-A3, FAE-A4, showed less antifungal potential in tested concentrations. The identified flavonoids are described in the literature, regarding their antioxidant capacity and (±)-catechin, quercetin-3-O-Rha and kaempferol-3-O-Rha are described as α-amylase inhibitors. Thus, B. argyrophylla is an important species that produces compounds with antioxidant potential that can be related to the traditional use as anti-inflammatory and also has antifungal compounds and inhibitors of α-amylase. Therefore, these leaves are promising resources for the production of new drugs.

Efeitos da administração de inibidores de fosfodiesterases na reversão da hiperatividade de camundongos expostos ao etanol no período correspondente ao terceiro trimestre de gestação em humanos

O consumo de etanol durante a gestação é um grave problema de saúde pública. Durante o desenvolvimento, o sistema nervoso é especialmente susceptível aos efeitos tóxicos do etanol e a exposição ao etanol durante este período pode gerar um amplo espectro de distúrbios neurocomportamentais, sendo o mais frequente, a hiperatividade. Recentemente, estudos têm sugerido que distúrbios na plasticidade neuronal podem estar relacionados com a hiperatividade. Os inibidores de PDE são drogas que agem impedindo a degradação de segundos mensageiros celulares como AMPc e GMPc, mantendo a ativação de proteínas quinases e de fatores de transcrição como o CREB, levando a expressão de genes relacionados à plasticidade. Neste trabalho, avaliamos através do teste de campo aberto se a administração de Vinpocetina ou Rolipram (inibidores de PDE) seria capaz de amenizar ou reverter a hiperatividade de camundongos Suíços expostos ao etanol no período correspondente ao terceiro trimestre de gestação humana. Para tanto, foram realizadas duas etapas: na primeira etapa, durante o período neonatal, os animais receberam injeções intraperitoneais de etanol (5g/Kg em solução salina a 25%, no 2, 4, 6 e 8 dias de vida pós-natal - PN2 a PN8) ou de salina, e 4 horas antes do teste comportamental no campo aberto (10 min), em PN30, receberam Vinpocetina (10mg/Kg ou 20mg/Kg diluídas em DMSO ip) ou somente DMSO ip. Na segunda etapa, os animais foram expostos ao etanol ou à salina no período neonatal nas mesmas condições da primeira etapa e no dia do teste comportamental receberam Rolipram (0,5mg/Kg diluídas em DMSO ip ou somente DMSO ip). Posteriormente aos testes, foram coletados o córtex cerebral frontal e o hipocampo dos animais para avaliação dos níveis de AMPc. Os resultados comportamentais indicam que somente o tratamento com Vinpocetina (20mg/Kg) reverteu a hiperatividade de camundongos expostos ao etanol, resultado que não foi observado com o tratamento com Rolipram. Desta forma, a dosagem dos níveis de AMPc foi realizada apenas nos animais que receberam injeção de Vinpocetina (20mg/Kg). A exposição neonatal ao etanol reduziu significativamente os níveis de AMPc no córtex e no hipocampo. O tratamento com Vinpocetina gerou um aumento nos níveis de AMPc no córtex e restaurou estes níveis no hipocampo. Nossos resultados sugerem que a reversão da hiperatividade pelo tratamento com Vinpocetina pode estar associada ao aumento da plasticidade neural induzida por esta droga.

Emprego da técnica de emissão por fluorescência de ultravioleta no monitoramento de inibidores de corrosão em água produzida

Para aumentar os volumes de extração de petróleo, resolver e prevenir problemas nas operações de produção são utilizados diversos produtos químicos, dentre os quais se destacam os inibidores de corrosão, que são utilizados em toda cadeia produtiva do petróleo visando proteger o sistema da deterioração por corrosão. Os sais de amônio quaternário são uma das classes de inibidores mais utilizadas pela indústria do petróleo devido a sua grande eficiência. Entretanto, sua solubilidade em água faz com que estejam presentes na água produzida representando um risco para contaminação ambiental, visto que possuem baixa biodegrabilidade e potencial de bioacumulação. Como se encontram misturados a outros produtos químicos e sob efeitos das variações do ambiente em que são aplicados, definir um método de análise confiável e viável para monitoramento em linha representa um desafio para os laboratórios de campos de produção. Neste trabalho, foi estudado o emprego da fluorescência de ultravioleta na quantificação de um inibidor de corrosão do tipo sal de amônio quaternário em água. Foram obtidos espectros de emissão do produto comercial em água, além do estudo de variáveis instrumentais e interferentes presentes na água produzida. A comparação com padrões de sal de amônio quaternário permitiu identificar como principal fluorófilo, um sal alquil-aril de amônio quaternário. Estudos de estabilidade revelaram que a adsorção do inibidor de corrosão nas superfícies dos frascos plásticos provoca a queda do sinal fluorescente e que a adição de isopropanol reduz este efeito de 40 para 24%. Foram obtidas curvas de calibração com a formulação comercial e com o cloreto de 2-metil-4-dodecil-benzil-trimetil amônio com uma boa correlação. Amostras sintéticas do inibidor foram determinadas com um erro relativo de 2,70 a 13,32%. O método de adição padrão foi avaliado usando uma amostra de água produzida, e os resultados não foram satisfatórios, devido à interferência, principalmente, de compostos orgânicos aromáticos presentes

Avaliação de aminoácidos como inibidores de corrosão para cobre em meio de água do mar artificial

Inibidores de corrosão são substâncias que quando adicionadas a um meio agressivo, diminuem ou previnem a reação de oxidação de um metal com este meio e/ou as reações de redução de espécies presentes no meio. Para a inibição da corrosão de cobre e suas ligas em meios ácidos ou neutros, o inibidor mais empregado é o benzotriazol (BTAH), o qual forma complexos com os íons Cu (I) e Cu (II) na superfície do metal, diminuindo o processo corrosivo. A preocupação com a preservação ambiental e a toxicidade de inibidores de corrosão vem sendo discutida na literatura. Vários estudos têm-se intensificado usando aminoácidos, como proposta para substituição ao BTAH, considerado tóxico. Entre os aminoácidos estudados, dois apresentavam enxofre em suas moléculas (cisteína e metionina) e um outro sem heteroátomo na cadeira lateral (glicina). As concentrações variaram entre 10-2 a 10-4 mol/L e pH da solução entre 7,2 e 8,4. Foram realizadas medidas gravimétricas (ensaios de imersão total) e técnicas eletroquímicas, tais como polarização potenciodinâmica e espectroscopia de impedância eletroquímica. A caracterização morfológica da superfície do substrato após os ensaios de imersão total (743 horas) foi feita por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDS ou EDX) e difração de raios X (DRX). Embora os resultados com aminoácidos tenham sido sempre muito inferiores àqueles obtidos na presença de BTAH, comportamentos semelhantes em função da concentração dos aminoácidos puderam ser observados pelos diagramas de Nyquist. Contudo, com exceção dos resultados verificados para o meio contendo cisteína 10-2 mol/L, todas as eficiências de inibição para os meios contendo aminoácidos, obtidas pelos ensaios de imersão total, foram negativas, mostrando que o tempo de exposição também pode ser relevante para o desempenho destes inibidores. Entre todos os aminoácidos testados, os meios contendo glicina apresentaram os piores desempenhos anticorrosivos, inclusive acelerando o processo de dissolução anódica do cobre. Esse resultado pode estar relacionado à faixa de pH das soluções testadas e à solubilidade dos complexos de cobre formados com os aminoácidos, mostrando que uma faixa ótima de pH também deve ser assegurada para aprimorar a ação destes aminoácidos como inibidores de corrosão

Sinalização da MAPK/ERK na diferenciaçãao da oligodendroglia: efeitos de inibidores da MEK sobre a morfologia e distribuição de proteínas de oligodendrócitos/mielina in vitro

A via de sinalização da cinase regulada por fatores extracelulares, da família das proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK/ERK) é importante tanto para a sobrevivência como para a progressão da diferenciação de oligodendrócitos. Neste trabalho, a via da MAPK/ERK foi avaliada na oligodendroglia in vitro com a utilização de inibidores da MEK. A morfologia celular, assim como a distribuição de proteínas foram analisadas em diferentes estágios de maturação da oligodendroglia. Culturas primárias de oligodendrócitos foram tratadas com os inibidores da MEK PD98059 ou U0126, aos 5 ou 11dias in vitro (div), por 30min, 24 ou 48h. A oligodendroglia foi distinguida com marcadores estágio-específicos: A2B5, 23nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) e proteína básica de mielina (MBP), e classificada de acordo com sua morfologia em diferentes estágios de desenvolvimento. O tratamento aumentou significativamente o número de células com morfologia mais imatura e diminuiu o número de células maduras. Além disso, aumentou o número de células redondas e sem prolongamentos as quais não puderam ser classificadas em nenhum dos estágios de desenvolvimento da oligodendroglia. Os efeitos mais evidentes foram observados logo após o menor tempo de tratamento. Células redondas eram positivas para CNPase e MBP, porém não foram marcadas com A2B5 ou com NG2, indicando que seriam células maduras incapazes de estender ou manter seus prolongamentos. De fato, estas mudanças foram acompanhadas por alterações na distribuição de proteínas de oligodendrócitos como a MBP e a CNPase, assim como alterações em proteínas de citoesqueleto, como actina, tubulina e na cinase de adesão focal (FAK). A MBP foi observada nas células tratadas em um padrão de distribuição desorganizado e disperso, oposto ao padrão contínuo que é observado nas células das culturas controle. Além disso, o tratamento causou uma desorganização na distribuição da CNPase, actina e tubulina. Nas células das culturas controle, estas proteínas apresentam um padrão organizado compondo as estruturas de citoqueleto semelhantes a nervuras. Após um pequeno período de tratamento (30min), actina e tubulina apresentaram o mesmo padrão de marcação puntiforme que a CNPase apresentou. O tratamento também reduziu os pontos de adesão focal demonstrados pela FAK. Com o decorrer do tratamento, após 24 e 48h, actina e tubulina aparentavam estar se reorganizando em um padrão filamentar. Estes resultados indicam um efeito importante da via da MAPK/ERK na ramificação e alongamento dos prolongamentos dos oligodendrócitos, com possíveis consequências para a formação da bainha de mielina.

Utilização de alinhamento estrutural de proteínas no estudo de Interface Forming Residues de proteína-quinases com inibidores protéicos.

Alinhamento estrutural de proteínas e análise de interação proteína-inibidor. As proteínas-quinases (PK) como alvo biológico. Três grupos de estruturas diferentes no domínio catalítico de PK. Superposição dos dados obtidos no alinhamento sequencial e estrutural.

Inibidores de germinacao em frutos e sementes de pequi.

Utilizando frutos de pequi, coletados na regiao de Sete Lagoas-MG, em 1986, foi avaliada a presenca de inibidores de germinacao nas sementes e nas partes do fruto que envolvem (polpa, espinhos e endocarpo). A extracao foi a 5ºC por 24 horas, utilizando dois solventes: agua e metanol a 80%. Para testar a presenca de inibidores, foram utilizadas sementes de alface (Lactuca sativa L.), cultivar repolhuda, com 88,5% de germinacao. Os extratos aquoso e metanolico do endocarpo e dos espinhos e o extrato metanolico da polpa diminuiram, significativamente, tanto a velocidade como a porcentagem de germinacao. O extrato aquoso da polpa não afetou o numero de sementes germinadas, porem diminuiu a velocidade de germinacao. Os extratos aquosos e metanolicos da semente não apresentaram qualquer efeito de inibicao da germinacao.

Via de sinalização mTOR e efeito dos seus inibidores no tratamento do cancro

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas