Zur Rolle der Antigendosis in IgE-vermittelten Immunantworten und der allergischen Atemwegsentzündung

Die Verabreichung von hohen Antigendosen im Rahmen der allergenspezifischen Immuntherapie (SIT) resultiert in der Induktion einer allergenspezifischen Toleranz in sensibilisierten Patienten. Vorangegangene Studien der Klinischen Forschergruppe Allergie identifizierten CD4-CD8- doppelt-negative T-Zellen (dnTZ), welche nach wiederholter intraperitonealer Injektion von hohen Dosen (HD) des an das Adjuvans Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens Keyhole Limpet Hemocyanin in Mäusen induziert wurden, als potente Suppressorzellen für die IgE-Produktion. Mäuse, die hingegen mit niedrigen Dosen (LD) desselben Antigens behandelt wurden, entwickelten eine starke, persistierende IgE-Immunantwort. rnIm Fokus meiner Doktorarbeit stand die phänotypische Charakterisierung der dnTZ aus HD-Mäusen sowie die Aufklärung möglicher inhibitorischer Wirkmechanismen. In Erweiterung der bisherigen Arbeiten und in Anlehnung an die klinische Praxis bei der Durchführung der SIT habe ich bei meinen Untersuchungen die subkutane Injektion ohne Adjuvans als alternative Applikationsroute verwendet. In meinen Studien konnte ich durch die zusätzliche Verwendung des klinisch relevanten Allergens Ovalbumin die Allgemeingültigkeit des Konzepts der antigendosisabhängigen Regulation der IgE- Produktion durch dnTZ verifizieren. Die Vakzinierung mit hohen Antigendosen verhinderte die Ausbildung einer IgE-Produktion in antigenspezifischer Weise. HD- Mäuse wiesen in vitro eine geringere Aktivierung von TH2-Zellen als LD-Mäuse auf. Im Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung wiesen HD-Mäuse eine reduzierte Atemwegsreaktivität sowie eine geringere pulmonale TH2-Zytokin- produktion auf. rnIch konnte zudem tendenziell eine leicht erhöhte Anzahl von dnTZ in HD-Mäusen messen. Die in HD-Mäusen induzierten dnTZ habe ich durchflusszytometrisch charakterisiert, konnte jedoch keinen eindeutigen Marker für suppressive dnTZ identifizieren. In einem adoptiven Transferexperiment war eine T-Zellpopulation von HD-Mäusen aus der γδ-T-Zell-Rezeptor-tragende T-Zellen depletiert worden waren, ähnlich wie die Ausgangs-T-Zellpopulation in der Lage die IgE-Produktion in den Rezipienten zu inhibieren, was darauf schließen lässt, dass die untersuchten regulatorischen dnTZ einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimieren. rn

~(166)Ta高自旋态及A～160区S IG NATURE反转的研究

本论文以A～160区奇奇核的高自旋态核结构为研究对象，详细地总结分析了该区奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带的性质，利用在束核谱学实验手段布居和测量了166Ta核高自旋态能级结构、借助模型理论对该核实验结果进行分析，还从理论方面系统地研究了A～160区奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带的signature反转现象与形变的关系，取得了一些创新成果。 奇奇核高j组态带的signature反转现象系统地存在于A～160、A～130和A～80核区，目前理论上提出的各种可能机制还不能彻底解释清楚这一现象。本文中较详细地归纳了A～160区奇奇核signature反转带，即[h11/2]p[i13/2]n带，实验数据的一些系统学规律，具体贡献在于 1、总结了晕态[h11/2]p[i13/2]n带的跃迁能量系统学规律，指出存在这种规律的原因在于形变和价核子耦合性质随质子数和中子数增减的有规律变化。 2、展示了随质子数增大和中子数减小该带准粒子顺排角动量相加性逐渐变差的现象，指出这种变差的原因可能是形变减小导致剩余n-p相互作用的增强，以及奇奇核带和与之相比较的奇核带形变差异增大。文中强调了使用顺排角动量相加性规则时要考查相加前后两个signature分支顺排角动量的相对大小。跃迁能量系统学规律和顺排角动量相加性规则是目前指定该区奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带核态自旋值的有效工具，上述工作有益于研究新核时正确运用这些工具。文中其它归纳和总结工作也为后续研究提供了较为系统的参考资料。 此前尚未有人对166Ta核做过在束研究，我们在中国原子能科学研究院利用HI-13串列加速器通过141Pr（28Si，3n）反应布居和测量了166Ta核高自旋态。实验中使用了5片厚500μg/cm2纯度98.0%的141Pr自衬靶，7台HpGe反康谱仪和1台平面型HpGe探测器。用改变束流能量测量在束单谱和剩余放射性的方法确认实验中生成了166Ta核并为符合实验选定了束流能量。γ-γ符合实验束流能量为127MeV，实验中共收集到约50×106个两重符合事件。实验后用152Eu放射源对探测系统进行了能量和效率刻度。符合实验数据被反演成γ-γ、X-γ和DCO二维谱。通过处理和分析实验数据，得到以下主要结果： 1、用TaKX射线开窗、比较不同束流能量下的在束单谱和排除已知核射线等方法确认了属于166Ta的射线，根据这些射线的级联关系首次建立起了166Ta核的在束能级纲图，其中包括4条转动带，60条射线。166Ta核的晕带是一条耦合性较强的带，建立起的该带能级纲图中包括16条能级和29条射线，每一signature分支有7条E2拉伸跃迁。另外三条带是两条耦合带和一条双退耦带。其中一条耦合带的耦合性较强、位置较高，可能是4准粒子带。 2、计算γ-γ符合矩阵和DCO矩阵开窗谱中峰下面积，得到了166Ta核55条射线在实验中的相对强度Iγ、29条射线的方向关联系数Iγ（35°）/Iγ（75°）和21个核态退激过程的跃迁强度分支比λ等数据。 3、借助模型计算，为实验中发现的4条转动带指定了组态。晕核组态定为9/2[514]p3/2[651]n, Kπ值为6-。另外两条耦合带的组态被定为9/2[514]p3/2[521]n和9/2[514]p3/2[521]n{3/2[651]n}2,退偶带的组态可能是1/2[514]p3/2[651]n。 4、通过分析跃迁能量系统学规律和运用顺排角动量相加性规则指定了166Ta核晕带核态的自旋值，还使用其它方法倾向性地指定了另外三条带的自旋值。 5、提取了一些核态退激过程B（M1）/B（E2）理论值比实验值偏大，指示该带可能存在负γ形变。另外两条耦合带的B（M1）/B（E2）计算值与实验值比较接近，这方面支持我们对其组态的指定。回弯之前的166Ta核晕带B（M1）/B（E2）值与已知的同位素和同中子素奇奇核晕带值相比大许多，我们认为这是组态和形变变化造成的。 6、166Ta和邻核晕带集体转动惯量随转动角频率平方的变化关系显示准质子占据h11/2子壳顶部轨道时顺排发生得较晚，准中子占据i13/2子壳低部轨道时顺排发生得较早。 7、实验结果显示166Ta核的晕带出现signature反转，signature反转点自旋值和反转点之下M1跃迁摆动幅度都与全区规律相符。 我们研究166Ta核的高自旋态能级结构旨在为研究奇奇核signature反转提供新的实验数据，实验研究达到了预期的目的，实验结果证实了在轻Ta奇奇核同位素中也系统地存在signature反转。 在讨论A～160区奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带的signature反转机制方面，作者首次利用现有的TRS计算方法系统地考察了该区32个奇奇核该带形变极其随核子数增减的变化趋势，进而通过CSM计算考察了形变对该带signature劈裂的影响。这方面的研究成果主要包括： 1、计算结果显示，该区核芯较容易在γ形变方向受到价核子的形状极化作用，89≤Z≤95时i13/2准中子一般具有正γ形变驱动作用且随着中子数减小此正γ形变驱动作用逐渐增强，67≤Z≤75时h11/2准质子一般具有负γ形变驱动作用且随着质子数增大此负γ形变驱动作用逐渐增强，Z=63和65时h11/2准质子两个signature组态具有不同方向的γ形变驱动作用，总体看h11/2准质子的γ形变驱动作用没有i13/2准中子的强。 2、只考虑ε2和γ形变参量的TSR计算结果显示A～160区中N=89和91奇奇核的[h11/2]p[i13/2]n带有较大的正γ形变，N≥93奇奇核中该带γ形变则较小或为负γ形变。计算出的不同核该带的γ形变值随中子数增加逐渐减小、随质子数变化的规律较复杂且变化幅度没有随中子数变化时那么明显，Z≤67时一些核两signature的形变还有明显的差异。 3、CSM计算表明正γ形变可以导致费米面附近的h11/2准质子轨道signature反转，并且存在正γ形变时ε2形变、ε4形变、质子对力和质子数的不同都对signature反转幅度和反转点对应的角频率都有影响，[h11/2]p[i13/2]n带两个signature组态形变的不同对费米面附近i13/2准中子轨道的位置也有影响。 4、利用从TRS计算出的形变参量所做CSM计算显示，该区部分奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带出现signature反转。计算出的signature反转随中子数或质子数变化趋势有些和实验结果相符，也有一些与实验结果不符，对有些实验上发现signature反转的核还计算不出反转。计算结果预言该区一些没有实验数据的奇奇核[h11/2]p[i13/2]n带中也会存在signature反转，这些核是154Eu、162Ta、164Ta和168Re等。 此前对解释A～160区奇奇核signature反转的系统规律时是否必须考虑γ形变还没有定论，本文工作证实了较明显的正γ形变对signature反转起着重要的作用。但是，单纯考虑γ形变并不能完全再现A～160区奇奇核signature反转规律，今后的研究工作还要系统而细致地考虑各方面因素。

Rapamycin Interferes With Postdepletion Regulatory T Cell Homeostasis and Enhances DSA Formation Corrected by CTLA4-Ig.

Previously, we demonstrated that alemtuzumab induction with rapamycin as sole maintenance therapy is associated with an increased incidence of humoral rejection in human kidney transplant patients. To investigate the role of rapamycin in posttransplant humoral responses after T cell depletion, fully MHC mismatched hearts were transplanted into hCD52Tg mice, followed by alemtuzumab treatment with or without a short course of rapamycin. While untreated hCD52Tg recipients acutely rejected B6 hearts (n = 12), hCD52Tg recipients treated with alemtuzumab alone or in conjunction with rapamycin showed a lack of acute rejection (MST > 100). However, additional rapamycin showed a reduced beating quality over time and increased incidence of vasculopathy. Furthermore, rapamycin supplementation showed an increased serum donor-specific antibodies (DSA) level compared to alemtuzumab alone at postoperation days 50 and 100. Surprisingly, additional rapamycin treatment significantly reduced CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) T reg cell numbers during treatment. On the contrary, ICOS(+) PD-1(+) CD4 follicular helper T cells in the lymph nodes were significantly increased. Interestingly, CTLA4-Ig supplementation in conjunction with rapamycin corrected rapamycin-induced accelerated posttransplant humoral response by directly modulating Tfh cells but not Treg cells. This suggests that rapamycin after T cell depletion could affect Treg cells leading to an increase of Tfh cells and DSA production that can be reversed by CTLA4-Ig.

"Identification and Diversity of Killer Cell Ig-Like Receptors in Aotus vociferans, a New World Monkey "

Previous BAC clone analysis of the Platyrrhini owl monkey KIRs have shown an unusual genetic structure in some loci. Therefore, cDNAs encoding KIR molecules from eleven Aotus vociferans monkeys were characterized here; tenputative KIR loci were found, some of which encoded atypical proteins such as KIR4DL and transcripts predicted to encode a D0+D1 configuration (AOTVOKIR2DL1*01v1) which appear to be unique in the Aotus genus. Furthermore, alternative splicing was found as a likely mechanism for producing activator receptors in A. vociferans species. KIR proteins from New World monkeys may be split into three new lineages according to domain by domain phylogenetic analysis. Although the A. vociferans KIR family displayed a high divergence among paralogous genes, individual loci were limited in their genetic polymorphism. Selection analysis showed that both constrained and rapid evolution may operate within the AvKIR family. The frequent alternative splicing (as a likely mechanism generating activator receptors), the presence of KIR4DL and KIR2DL1 (D0+D1) molecules and other data reported here suggest that the KIR family in Aotus has had a rapid evolution, independent from its Catarrhini counterparts.from its Catarrhini counterparts.

Il cane come modello animale spontaneo di patologie neoplastiche dell'uomo: ene Ataxia-Telangiectasia Mutated (ATM) Nnella predisposizione al cancro ed importanza dei riarrangimanti genici dei geni Ig/TCR per la diagnosi e prognosi delle malattie linfoproliferative

“Naturally occurring cancers in pet dogs and humans share many features, including histological appearance, tumour genetics, molecular targets, biological behaviour and response to conventional therapies. Studying dogs with cancer is likely to provide a valuable perspective that is distinct from that generated by the study of human or rodent cancers alone. The value of this opportunity has been increasingly recognized in the field of cancer research for the identification of cancer-associated genes, the study of environmental risk factors, understanding tumour biology and progression, and, perhaps most importantly, the evaluation and development of novel cancer therapeutics”.(Paoloni and Khanna, 2008) In last years, the author has investigated some molecular features of cancer in dogs. The Thesis is articulated in two main sections. In section 1, the preliminary results of a research project aimed at investigating the role of somatic mutations of Ataxia-Telangiectasia mutated (ATM) gene in predisposing to cancer in boxer dogs, are presented. The canine boxer breed may be considered an unique opportunity to disclose the role of ATM somatic mutation since boxer dogs are known to be dramatically susceptible to cancer and since they may be considered a closed gene pool. Furthermore, dogs share with human the some environment. Overall, the abovementioned features could be considered extremely useful for our purposes. In the section 2, the results of our studies aimed at setting up accurate and sensitive molecular assays for diagnosing and assessing minimal residual disease in lymphoproliferative disorders of dogs, are presented. The results of those molecular assay may be directly translated in the field of Veterinary practice as well as the may be used to improve our objective evaluation of new investigational drugs effectiveness in canine cancer trials.

Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie aus dem marinen Schwamm Geodia cydonium

Der evolutionär älteste Tierstamm der Metazoa, die Schwämme (Porifera), bietet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Selbst/Fremd-Erkennung an. Diese Unterscheidung wurde bei der Evolution von einzelligen zu mehrzelligen Tieren wichtig. Schwämme besitzen ein angeborenes Immunsystem. Ob sie auch Vorläufer der Immunrezeptoren aufweisen, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Einen ersten Schritt stellte die Identifizierung weiterer Gene mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen dar. Mit der Isolierung der beiden 'Schwamm-Adhäsionsmoleküle' GCSAML und GCSAMS durch ein Homologiescreening ist dies gelungen. Die Beteiligung dieser Moleküle an einer Immunantwort wurde mit Hilfe von Transplantationsexperimenten untersucht. Die Gewebe von Autotransplantaten fusionierten, während es bei Allotransplantaten zu einer Abstoßung des eingesetzten Gewebes kam. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen sowohl an Geodia cydonium- als auch an Suberites domuncula-Zellen konnte gezeigt werden, daß Moleküle mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen an den Transplantationsprozessen beteiligt sind. Northern Blot-Analysen zeigten die Beteiligung speziell von GCSAML an der Autotransplantation. Western Blot-Analysen bestätigten diese Ergebnisse und weiteten sie auf Allotransplantationen aus. Beide GCSAM-Gene können der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden. GCSAML kann durch die Existenz des sogenannten ITIM-Motives weiter in die spezielle Klasse der inhibitorischen Rezeptoren gruppiert werden und stellt damit einen Vorläufer der Immunrezeptoren dar.

Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

Signaltransduktion von IgG-Antiphospholipid-Antikörpern in plasmazytoiden Dendriten und Monomac1 Zellen

Das Antiphospholipid-Syndrom (APS) ist eine Autoimmunerkrankung die sich durch venöse und arterielle Thrombosen und/oder Spontanaborte bei gleichzeitigem Nachweis von persistierenden, erhöhten Antiphospholipid-Antikörper (aPL)-Titern charakterisieren lässt. Die zugrunde liegenden Mechanismen, über die aPL Pathogenität vermitteln, sind bislang wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass drei humane monoklonale IgG aPL sowie IgG Fraktionen von APS Patienten eine Überexpression von TLR7 und TLR8 in plasmazytoiden dendritischen Zellen bzw. monozytären Zellen induzieren. Gleichzeitig erfolgt die Induktion der TLR7/8 Translokation vom endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Endosom. Diese Effekte werden durch die Internalisierung der aPL und die nachfolgende Aktivierung einer NADPH Oxidase sowie durch endosomale Superoxid Produktion vermittelt. Als Folge dessen werden die Zellen extrem für TLR7/8 Liganden sensibilisiert. Diese Beobachtungen beschreiben einen neuen Signalmechanismus der innaten Immunität, der seinen Ursprung im Endosom nimmt. Da die Überexpression von TLR7 auch in pDCs von APS Patienten detektiert werden konnte, bieten unsere Ergebnisse eine Erklärung für die proinflammatorischen und prokoagulanten Effekte von aPL. rnWeiterhin führte die kombinierte Stimulation mit aPL und TLR7 Liganden in pDCs zu einem signifikant verstärkten Potential zur CD4+ Th2 Zell Aktivierung bzw. zur Regulation der B-Zell Differenzierung und Immunglobulin Produktion. Die Anwesenheit der pDCs erhöhte dabei synergistisch die CD40/86 Expression, die Proliferation sowie die Plasmazell-Differenzierung von isolierten peripheren B-Zellen, die mit aPL und TLR Liganden stimuliert wurden. Dieser Stimulationsansatz war außerdem ausreichend um naive B-Zellen zur IgM/IgG Produktion anzuregen und die Synthese neuer IgG aPL durch Gedächtnis-B-Zellen einzuleiten. Die Beteiligung der pDCs an diesem Prozess erfolgte durch Zytokin Sekretion sowie direktem Zell-Zell-Kontakt. Die Anwesenheit von Th2-Helferzellen war dabei nicht obligatorisch, konnte jedoch die B-Zell Aktivierung zusätzlich fördern. Eine Hochregulierung von TLR7 oder TLR9 innerhalb der B-Zell Population war nicht involviert. rnrnDiese Ergebnisse zeigen erstmalig die Relevanz einer pDC Aktivierung im Hinblick auf die Aufrechterhaltung der pathogenen Aktivität im Rahmen des APS. Da eine Dysregulierung von TLR7 bereits als ursächlich für die Ausbildung einer systemischen Autoimmunität erachtet wird, sollten unsere Ergebnisse für das generelle Verständnis von Autoimmunität von großer Relevanz sein.rn