The effects of oxidative stress on the retinal structure and function

Des études antérieures ont démontré que le métabolisme de la rétine, son apport sanguin et sa consommation de l'oxygène sont plus élevés dans le noir (Riva C.E. et al. 1983, Wang L. et al. 1996, Tam B.M. and Moritz O.L. 2007). Les stimuli physiologiques jouent supposément un rôle important dans le développement des différents systèmes nerveux (Arthur W. Spira, David Parkinson 1991). La privation de la rétine de son stimulus physiologique, la lumière, est un moyen valable de démontrer la validité de ce concept. D'autres études ont affirmé que les injections de dichlorure de paraquat dans la cavité vitréenne causent une sévère rétinopathie (Rétinopathie induite par paraquat: RIP). Cette rétinopathie est provoquée par les dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) générés par le paraquat (Cingolani C. et al. 2006, Lu L. et al. 2006). Le but de notre premier projet (''Dark rearing project'') était de déterminer si les conséquences nocives de l'hyperoxie postnatale chez les rats albinos SD pourraient être amoindries en élevant une portée de rats au noir. Nos résultats suggèrent qu'une augmentation du métabolisme de la rétine causée par la déprivation de lumière chez les ratons, pourrait protéger ou masquer certains effets néfastes de l'hyperoxie postnatale. Le but de notre deuxième étude (''Paraquat project'') était d'examiner les possibles points de similitude entre RIP et d'autres modèles de rétinopathies oxydatives étudiés présentement par notre équipe, à savoir: Rétinopathie induite par l'oxygène (RIO) et Rétinopathie induite par la lumière (RIL). Nos résultats suggèrent que l'injection de dichlorure de paraquat dans la cavité vitréenne cause des changements sévères de la fonction de la rétine, tandis que sa structure semble intacte. La sévérité de ces changements dépend inversement de la maturité de la rétine au moment de l'injection.

Evaluation of mitochondrial function in a model of developmental programming of hypertension associated with transient neonatal oxygen exposure

UNE EXPOSITION NÉONATALE À L’OXYGÈNE MÈNE À DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: L’exposition à l’oxygène (O2) des ratons nouveau-nés a des conséquences à l’âge adulte dont une hypertension artérielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une néphropénie et des indices de stress oxydant. En considérant que les reins sont encore en développement actif lors des premiers jours après la naissance chez les rats, jouent un rôle clé dans le développement de l’hypertension et qu’une dysfonction mitochondriale est associé à une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions délétères néonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rénal sur la modulation de l’expression de protéines clés du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive d’espèces réactives de l’ O2. Méthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposés à 80% d’O2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considérant que plusieurs organes des rats sont encore en développement actif à la naissance, ces rongeurs sont un modèle reconnu pour étudier les complications d’une hyperoxie néonatale, comme celles liées à une naissance prématurée chez l’homme. À 4 et à 16 semaines, les reins sont prélevés et les mitochondries sont extraites suivant une méthode d’extraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et différentes centrifugations. L’expression des protéines mitochondriales a été mesurée par Western blot, tandis que la production d’ H202 et les activités des enzymes clés du cycle de Krebs ont été évaluées par spectrophotométrie. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± SD. Résultats: Les rats mâles H de 16 semaines (n=6) présentent une activité de citrate synthase (considéré standard interne de l’expression protéique et de l’abondance mitochondriales) augmentée (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), une diminution de l’activité d’aconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondrie), ainsi qu’une augmentation dans la production de H202 (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg protéines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mâles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) présente également une diminution dans l’expression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 unité relative, -23%; p<0.05), une protéine impliquée dans l’élimination d’ H202, de l’expression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 unité relative, -15%; p<0.05), une protéine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que l’expression de la protéine de découplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), impliquée dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmentée (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 unité relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines démontrent une augmentation significative de l’activité de l’aconitase (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondrie), de l’expression de l’ATP synthase sous unité β (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 unité relative, +25%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 unité relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que l’expression de Prx3 est significativement réduite (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 unité relative, -24%; p<0.05). À 4 semaines, les mâles H (vs Ctrl) présentent une augmentation significative de l’expression de Prx3 (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 unité relative, +31%; p<0.05) et les femelles présentent une augmentation significative de l’expression d’UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 unité relative, +18%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 unité relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition néonatale à l’O2 chez le rat adulte mène à des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associée à une augmentation dans la production d’espèces réactives de l’oxygène, suggérant que ces modifications mitochondriales pourraient jouer un rôle dans l’hypertension artérielle et d’un stress oxydant, et par conséquent, être un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires. Mots-clés: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygène, Stress Oxydant, Programmation

Impact du stress hyperoxique en période néonatale sur la structure vasculaire : implication des phénomènes de sénescence et rôle possible dans la programmation développementale de l'hypertension artérielle

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Lorraine (France)

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

Investigation de la régulation vasculaire dans les artères et les veines de la rétine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Investigation de la régulation vasculaire dans les artères et les veines de la rétine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Assessing microvascular function with breathing maneuvers : an oxygenation-sensitive CMR study

Ce projet illustre cinq études, mettant l'emphase sur le développement d'une nouvelle approche diagnostique cardiovasculaire afin d'évaluer le niveau d’oxygène contenu dans le myocarde ainsi que sa fonction microvasculaire. En combinant une séquence de résonance magnétique cardiovasculaire (RMC) pouvant détecter le niveau d’oxygène (OS), des manœuvres respiratoires ainsi que des analyses de gaz artériels peuvent être utilisés comme procédure non invasive destinée à induire une réponse vasoactive afin d’évaluer la réserve d'oxygénation, une mesure clé de la fonction vasculaire. Le nombre de tests diagnostiques cardiaques prescrits ainsi que les interventions, sont en pleine expansion. L'imagerie et tests non invasifs sont souvent effectués avant l’utilisation de procédures invasives. L'imagerie cardiaque permet d’évaluer la présence ou absence de sténoses coronaires, un important facteur économique dans notre système de soins de santé. Les techniques d'imagerie non invasives fournissent de l’information précise afin d’identifier la présence et l’emplacement du déficit de perfusion chez les patients présentant des symptômes d'ischémie myocardique. Néanmoins, plusieurs techniques actuelles requièrent la nécessité de radiation, d’agents de contraste ou traceurs, sans oublier des protocoles de stress pharmacologiques ou physiques. L’imagerie RMC peut identifier une sténose coronaire significative sans radiation. De nouvelles tendances d’utilisation de RMC visent à développer des techniques diagnostiques qui ne requièrent aucun facteur de stress pharmacologiques ou d’agents de contraste. L'objectif principal de ce projet était de développer et tester une nouvelle technique diagnostique afin d’évaluer la fonction vasculaire coronarienne en utilisant l' OS-RMC, en combinaison avec des manœuvres respiratoires comme stimulus vasoactif. Ensuite, les objectifs, secondaires étaient d’utilisés l’OS-RMC pour évaluer l'oxygénation du myocarde et la réponse coronaire en présence de gaz artériels altérés. Suite aux manœuvres respiratoires la réponse vasculaire a été validée chez un modèle animal pour ensuite être utilisé chez deux volontaires sains et finalement dans une population de patients atteints de maladies cardiovasculaires. Chez le modèle animal, les manœuvres respiratoires ont pu induire un changement significatif, mesuré intrusivement par débit sanguin coronaire. Il a été démontré qu’en présence d'une sténose coronarienne hémodynamiquement significative, l’OS-RMC pouvait détecter un déficit en oxygène du myocarde. Chez l’homme sain, l'application de cette technique en comparaison avec l'adénosine (l’agent standard) pour induire une vasodilatation coronarienne et les manœuvres respiratoires ont pu induire une réponse plus significative en oxygénation dans un myocarde sain. Finalement, nous avons utilisé les manœuvres respiratoires parmi un groupe de patients atteint de maladies coronariennes. Leurs myocardes étant altérées par une sténose coronaire, en conséquence modifiant ainsi leur réponse en oxygénation. Par la suite nous avons évalué les effets des gaz artériels sanguins sur l'oxygénation du myocarde. Ils démontrent que la réponse coronarienne est atténuée au cours de l’hyperoxie, suite à un stimuli d’apnée. Ce phénomène provoque une réduction globale du débit sanguin coronaire et un déficit d'oxygénation dans le modèle animal ayant une sténose lorsqu’un supplément en oxygène est donné. En conclusion, ce travail a permis d'améliorer notre compréhension des nouvelles techniques diagnostiques en imagerie cardiovasculaire. Par ailleurs, nous avons démontré que la combinaison de manœuvres respiratoires et l’imagerie OS-RMC peut fournir une méthode non-invasive et rentable pour évaluer la fonction vasculaire coronarienne régionale et globale.

Imagerie par résonance magnétique fonctionnelle du rat à 7T

Des métastases cérébrales vont se développer chez 10 à 30% des patients atteints de cancer. La radiothérapie fait partie des possibilités de traitement, et ceci même si les dommages induits au cerveau par des rayonnements ionisants sont potentiellement importants. Nous proposons l’utilisation de l’Imagerie par Résonance Magnétique fonctionnelle (IRMf) sur le rat pour mieux comprendre ces effets. Ce mémoire traite de la mise en place d’un tel protocole d’IRMf. Les principaux points abordés sont la préparation de l’animal, les différentes insultes et stimulations sensorielles possibles ainsi que la méthode d’acquisition. Notre protocole d’insulte hyperoxique permet de déceler des dommages physiques d’origine vasculaire suite à une intense irradiation dans le cerveau du rat. Toutefois, la même procédure associée à une stimulation mécanique de la patte arrière de l’animal n’amène pas de changement observable à l’IRMf sur un sujet sain. Malgré tout, ce type de stimulation induit une réponse respiratoire, même sous anesthésie d’isoflurane. Une telle méthode n’est donc pas adéquate à l’étude d’animaux anesthésiés, surtout ceux dont la réponse cérébrale pourra avoir été réduite par une irradiation. Quelques améliorations et modifications du protocole seraient possiblement à même de permettre une mesure reproductible de la réponse d’IRMf à une stimulation sensorielle. Le présent mémoire décrit les tentatives de mise en place d’une stimulation sensorielle donnant lieu à une activation IRMf reproductible et localisée. De plus, un protocole de traitement d’image adapté au petit animal ainsi qu’une implémentation de la méthode keyhole ont été mis en place. L’insulte hyperoxique et ses effets sur le cerveau de rat ont été explorés plus en détail.

Assessing microvascular function with breathing maneuvers : an oxygenation-sensitive CMR study

Ce projet illustre cinq études, mettant l'emphase sur le développement d'une nouvelle approche diagnostique cardiovasculaire afin d'évaluer le niveau d’oxygène contenu dans le myocarde ainsi que sa fonction microvasculaire. En combinant une séquence de résonance magnétique cardiovasculaire (RMC) pouvant détecter le niveau d’oxygène (OS), des manœuvres respiratoires ainsi que des analyses de gaz artériels peuvent être utilisés comme procédure non invasive destinée à induire une réponse vasoactive afin d’évaluer la réserve d'oxygénation, une mesure clé de la fonction vasculaire. Le nombre de tests diagnostiques cardiaques prescrits ainsi que les interventions, sont en pleine expansion. L'imagerie et tests non invasifs sont souvent effectués avant l’utilisation de procédures invasives. L'imagerie cardiaque permet d’évaluer la présence ou absence de sténoses coronaires, un important facteur économique dans notre système de soins de santé. Les techniques d'imagerie non invasives fournissent de l’information précise afin d’identifier la présence et l’emplacement du déficit de perfusion chez les patients présentant des symptômes d'ischémie myocardique. Néanmoins, plusieurs techniques actuelles requièrent la nécessité de radiation, d’agents de contraste ou traceurs, sans oublier des protocoles de stress pharmacologiques ou physiques. L’imagerie RMC peut identifier une sténose coronaire significative sans radiation. De nouvelles tendances d’utilisation de RMC visent à développer des techniques diagnostiques qui ne requièrent aucun facteur de stress pharmacologiques ou d’agents de contraste. L'objectif principal de ce projet était de développer et tester une nouvelle technique diagnostique afin d’évaluer la fonction vasculaire coronarienne en utilisant l' OS-RMC, en combinaison avec des manœuvres respiratoires comme stimulus vasoactif. Ensuite, les objectifs, secondaires étaient d’utilisés l’OS-RMC pour évaluer l'oxygénation du myocarde et la réponse coronaire en présence de gaz artériels altérés. Suite aux manœuvres respiratoires la réponse vasculaire a été validée chez un modèle animal pour ensuite être utilisé chez deux volontaires sains et finalement dans une population de patients atteints de maladies cardiovasculaires. Chez le modèle animal, les manœuvres respiratoires ont pu induire un changement significatif, mesuré intrusivement par débit sanguin coronaire. Il a été démontré qu’en présence d'une sténose coronarienne hémodynamiquement significative, l’OS-RMC pouvait détecter un déficit en oxygène du myocarde. Chez l’homme sain, l'application de cette technique en comparaison avec l'adénosine (l’agent standard) pour induire une vasodilatation coronarienne et les manœuvres respiratoires ont pu induire une réponse plus significative en oxygénation dans un myocarde sain. Finalement, nous avons utilisé les manœuvres respiratoires parmi un groupe de patients atteint de maladies coronariennes. Leurs myocardes étant altérées par une sténose coronaire, en conséquence modifiant ainsi leur réponse en oxygénation. Par la suite nous avons évalué les effets des gaz artériels sanguins sur l'oxygénation du myocarde. Ils démontrent que la réponse coronarienne est atténuée au cours de l’hyperoxie, suite à un stimuli d’apnée. Ce phénomène provoque une réduction globale du débit sanguin coronaire et un déficit d'oxygénation dans le modèle animal ayant une sténose lorsqu’un supplément en oxygène est donné. En conclusion, ce travail a permis d'améliorer notre compréhension des nouvelles techniques diagnostiques en imagerie cardiovasculaire. Par ailleurs, nous avons démontré que la combinaison de manœuvres respiratoires et l’imagerie OS-RMC peut fournir une méthode non-invasive et rentable pour évaluer la fonction vasculaire coronarienne régionale et globale.