Análise do gene PTEN por hibridização in situ fluorescente no carcinoma de células renais

OBJETIVO: avaliar a frequência de deleção do gene PTEN no carcinoma de células renais e o impacto da deleção nas taxas de sobrevida global e livre de doença. MÉTODOS: foram analisados 110 pacientes portadores de carcinoma de células renais submetidos à nefrectomia radical ou parcial entre os anos de 1980 e 2007. Em 53 casos foi possível a análise do gene PTEN pelo método de hibridização in situ fluorescente através da técnica de "tissue microarray". Para a análise estatística, os pacientes foram classificados em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência de deleção. RESULTADOS: o tempo médio de seguimento foi de 41,9 meses. Deleção hemizigótica foi identificada em 18 pacientes (33,9%), ao passo que deleção homozigótica esteve presente em três (5,6%). Em aproximadamente 40% dos casos analisados havia deleção. Monossomia e trissomia foram detectadas, respectivamente, em nove (17%) e dois pacientes (3,8%). Em 21 pacientes (39,6%), a análise por hibridização in situ do gene PTEN foi normal. Não houve diferenças estatisticamente significativas nas taxas de sobrevida global (p=0,468) e livre de doença (p=0,344) entre os pacientes portadores ou não de deleção. Foram fatores independentes para a sobrevida global: estádio clínico TNM, sintomatologia ao diagnóstico, alto grau de Fuhrmann performance status (Ecog) e recorrência tumoral. A livre de doença foi influenciada unicamente pelo estádio clínico TNM. CONCLUSÃO: deleção do gene PTEN no CCR foi detectada com frequência de aproximadamente 40% e sua presença não foi determinante de menores taxas de sobrevida, permanecendo os fatores prognósticos tradicionais como determinantes da evolução dos pacientes.

Tipagem e estado físico de papilomavírus humano por hibridização in situ em lesões intra-epiteliais do colo uterino

OBJETIVO: realizar estudo molecular (hibridização in situ) de pacientes com lesões intra-epiteliais do colo uterino, visando investigar a freqüência e o estado físico do papilomavírus humano (HPV). MÉTODOS: cortes histológicos de biopsias do colo uterino de 84 pacientes foram avaliados pela hibridização in situ, com sonda de amplo espectro, que permite identificação dos HPVs dos tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45 e 56, e com sondas específicas para HPV dos tipos 6, 11, 16, 18, 31 e 33. Os padrões físicos de marcação do DNA dos HPV encontrados foram: epissomal, quando todo o núcleo ficou corado pela biotina (marrom); integrado, onde se visualizaram um ou dois pontos marrons no núcleo hibridizado, ou misto, com a associação dos dois padrões anteriores. Das 84 pacientes avaliadas, 31 (36,9%) tinham lesões intra-epiteliais de baixo grau (LIE-BG) e 53 (63,1%) tinham lesões intra-epiteliais de alto grau (LIE-AG) ao exame histológico. Para a análise estatística foi empregado o teste exato de Fisher. RESULTADOS: do total dos casos, 46 (54,7%) foram positivos para DNA de HPV pela sonda de amplo espectro. Na tipagem dos vírus, o HPV-16 foi mais freqüente nas LIE-AG, com 12 casos - 22,6% (p<0,05). As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes entre os casos com LIE-BG e LIE-AG. Na avaliação do estado físico do DNA de HPV, os percentuais de padrões epissomais (mais comum nas LIE-BG) e integrados não foram diferentes entre os dois grupos. Houve predomínio do tipo misto nas LIE-AG em relação às LIE-BG: 26,4% e 3,2%, respectivamente (p<0,01). O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves. CONCLUSÕES: o HPV-16 foi o mais freqüente nas LIE-AG. As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes quando se compararam os casos com LIE-BG e LIE-AG. O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves.

Papilomavírus humano (HPV) em lesões benignas e malignas de mucosa oral pelos métodos de imuno-histoquímica e hibridização in situ

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Análise citogenética comparativa em espécies de morcegos da subfamília phyllostominae (chiroptera-phyllostomidae) por citogenética clássica e hibridização in situ Flourescente (fish)

Os morcegos representam um grupo amplamente distribuído e diversificado. A diversidade de hábitos alimentares faz da ordem Chiroptera uma das mais bem sucedidas entre os mamíferos, desempenhando, em função de seus hábitos, um importante papel no controle de insetos, na polinização e na dispersão de sementes de numerosos vegetais. A família Phyllostomidae constitui a terceira maior família em número de espécies dentro da Ordem Chiroptera. Entre as representantes neotropicais é a mais numerosa, sendo encontrada em florestas tropicais da America do Sul, particularmente, concentrada na Amazônia que é a região com maior diversidade de morcegos do mundo. No presente trabalho foram analisados citogeneticamente exemplares de três espécies da subfamília Phyllostominae: Chrotopterus auritus, Trachops cirrhosus e Vampyrum spectrum coletados no estado do Pará e Amazonas. Os dados cromossômicos obtidos para Chrotopterus auritus (2n = 28 e NF = 52) e Trachops cirrhosus (2n = 30, FN = 56) estão de acordo com os descritos na literatura. Para Vampyrum spectrum (2n=30 NF=56) relatamos os primeiros padrões de bandeamento e FISH (Hibridização in situ Fluorescente). A técnica de bandeamento C demonstrou um padrão pericentromérico de distribuição da heterocromatina constitutiva nas três espécies estudadas. A técnica de FISH com sondas de DNA teloméricas humanas mostrou apenas marcações distais em todos os cromossomos das três espécies e as sondas de rDNA 18S confirmaram a localização das Regiões Organizadoras Nucleares observadas na técnica de Ag-NOR, presentes no braço longo do par 2 de Chrotopterus auritus, no par 11 de Trachops cirrhosus e no braço longo do par 1 de Vampyrum spectrum. A análise comparativa entre elas sugere um extenso grau de diferenciação cromossômica, com poucos cromossomos compartilhados entre os três gêneros. Contudo, cinco pares cromossômicos inteiros se mantiveram conservados sem nenhum tipo de rearranjo após a divergência das três linhagens. A comparação entre as espécies revela que C. auritus e V. spectrum apresentam mais elementos compartilhados entre si do que em relação à T. cirrhosus. Nossos resultados apoiam a proximidade filogenética entre C. auritus e V. spectrum e sugerem a associação de T. cirrhosus com o clado do gênero Phyllostomus.

Identificação do sexo de embriões humanos através da análise de blastômero pelas técnicas da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) e hibridização in situ fluorescente (FISH)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Detecção do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais e diferenciação do complexo P. brasiliensis da espécie P. lutzii por Nested PCR e hibridização in situ

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Aplicação da técnica de RT-PCR in situ na detecção da co-infecção pelo Coronavírus grupo 3 (TCoV) e Astrovírus (TAstV-2) em perus com quadro agudo de enterite

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

The use of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of hidden mosaicism: apropos of three cases of sex chromosome anomalies

FISH has been used as a complement to classical cytogenetics in the detection of mosaicism in sex chromosome anomalies. The aim of this study is to describe three cases in which the final diagnosis could only be achieved by FISH. Case 1 was an 8-year-old 46,XY girl with normal female genitalia referred to our service because of short stature. FISH analysis of lymphocytes with probes for the X and Y centromeres identified a 45,X/46,X,idic(Y) constitution, and established the diagnosis of Turner syndrome. Case 2 was a 21-month-old 46,XY boy with genital ambiguity (penile hypospadias, right testis, and left streak gonad). FISH analysis of lymphocytes and buccal smear identified a 45,X/46,XY karyotype, leading to diagnosis of mixed gonadal dysgenesis. Case 3 was a 47,XYY 19-year-old boy with delayed neuromotor development, learning disabilities, psychological problems, tall stature, small testes, elevated gonadotropins, and azoospermia. FISH analysis of lymphocytes and buccal smear identified a 47,XYY/48,XXYY constitution. Cases 1 and 2 illustrate the phenotypic variability of the 45,X/46,XY mosaicism, and the importance of detection of the 45,X cell line for proper management and follow-up. In case 3, abnormal gonadal function could be explained by the 48,XXYY cell line. The use of FISH in clinical practice is particularly relevant when classical cytogenetic analysis yields normal or uncertain results in patients with features of sex chromosome aneuploidy. Arq Bras Endocrinol Metab. 2012;56(8):545-51

Scanning electron microscopic study of the in situ effect of salivary stimulation on erosion and abrasion in human and bovine enamel

This in situ study investigated, using scanning electron microscopy, the effect of stimulated saliva on the enamel surface of bovine and human substrates submitted to erosion followed by brushing abrasion immediately or after one hour. During 2 experimental 7-day crossover phases, 9 previously selected volunteers wore intraoral palatal devices, with 12 enamel specimens (6 human and 6 bovine). In the first phase, the volunteers immersed the device for 5 minutes in 150 ml of a cola drink, 4 times a day (8h00, 12h00, 16h00 and 20h00). Immediately after the immersions, no treatment was performed in 4 specimens (ERO), 4 other specimens were immediately brushed (0 min) using a fluoride dentifrice and the device was replaced into the mouth. After 60 min, the other 4 specimens were brushed. In the second phase, the procedures were repeated but, after the immersions, the volunteers stimulated the salivary flow rate by chewing a sugar-free gum for 30 min. Enamel superficial alterations of all specimens were then evaluated using a scanning electron microscope. Enamel prism core dissolution was seen on the surfaces submitted to erosion, while on those submitted to erosion and to abrasion (both at 0 and 60 min) a more homogeneous enamel surface was observed, probably due to the removal of the altered superficial prism layer. For all the other variables - enamel substrate and salivary stimulation -, the microscopic pattern of the enamel specimens was similar.

The influence of residual salivary fluoride from dentifrice on enamel erosion: an in situ study

The objective of this study was to assess the salivary residual effect of fluoride dentifrice on human enamel subjected to an erosive challenge. This crossover in situ study was performed in two phases (A and B), involving ten volunteers. In each phase, they wore acrylic palatal appliances, each containing 3 human enamel blocks, during 7 days. The blocks were subjected to erosion by immersion of the appliances in a cola drink for 5 minutes, 4 times a day. Dentifrice was used to brush the volunteers’ teeth, 4 times a day, during 1 minute, before the appliance was replaced into the mouth. In phases A and B the dentifrices used had the same formulation, except for the absence (PD) or presence (FD) of fluoride, respectively. Enamel alterations were determined using profilometry, microhardness (%SMHC), acid- and alkali-soluble F analysis. The data were tested using ANOVA (p < 0.05). The concentrations (mean ± SD) of alkali- and acid-soluble F (µgF/cm²) were, respectively, PD: 1.27ª ± 0.70/2.24A ± 0.36 and FD: 1.49ª ± 0.44/2.24A ± 0.67 (p > 0.05). The mean wear values (± SD, µm) were PD: 3.63ª ± 1.54 and FD: 3.54ª ± 0.90 (p > 0.05). The mean %SMHC values (± SD) were PD: 89.63ª ± 4.73 and FD: 87.28ª ± 4.01 (p > 0.05). Thus, we concluded that the residual fluoride from the fluoride-containing dentifrice did not protect enamel against erosion.

Vertical alveolar crest bone maintenance around implants in two-stage surgery: an in situ study in dogs

The aim of this study was to evaluate in situ changes in the alveolar crest bone height around immediate implant-supported crowns in comparison to tooth-supported crowns (control) with the cervical margins located at the bone crest level, without occlusal load. In Group I, after extraction of 12 mandibular premolars from 4 adult dogs, implants from Branemark System (MK III TiU RP 4.0 x 11.5 mm) were placed to retain complete acrylic crowns. In Group II, premolars were prepared to receive complete metal crowns. Sixteen weeks after placement of the crowns (38 weeks after tooth extraction), the height of the alveolar bone crest was measured with a digital caliper. Data were analyzed statistically by the Mann-Whitney test at 5% significance level. The in situ analysis showed no statistically significant difference (p=0.880) between the implant-supported and the tooth-supported groups (1.528 + 0.459 mm and 1.570 + 0.263 mm, respectively). Based on the findings of the present study, it may be concluded that initial peri-implant bone loss may result from the remodeling process necessary to establish the biological space, similar to which occurs with tooth-supported crowns.

Expressão da proteína erbB-2 e dos receptores de hormônios na transição das regiões in situ para invasora de tumores da mama

OBJETIVOS: avaliar a expressão de erbB-2 e dos receptores hormonais para estrógeno e progesterona (RE/RP) nas regiões de transição entre as frações in situ e invasoras de neoplasias ductais da mama (CDIS e CDI, respectivamente). MÉTODOS: oitenta e cinco casos de neoplasias mamárias, contendo regiões contíguas de CDIS e CDI, foram selecionados. Espécimes histológicos das áreas de CDIS e de CDI foram obtidos através da técnica de tissue microarray (TMA). As expressões da erbB-2 e dos RE/RP foram avaliadas por meio de imunoistoquímica convencional. A comparação da expressão da erbB-2 e dos RE/RP nas frações in situ e invasoras da mama foi realizada com emprego do teste de McNemar. Os intervalos de confiança foram determinados em 5% (p=0,05). Foram calculados coeficientes de correlação intraclasse (ICC) para avaliar a concordância na tabulação cruzada da expressão de erbB-2 e RE/RP nas frações de CDIS e CDI. RESULTADOS: a expressão da erbB-2 não diferiu entre as áreas de CDIS e CDI (p=0,38). Comparando caso a caso suas áreas de CDIS e CDI, houve boa concordância na expressão da erbB-2 (coeficiente de correlação intraclasse, ICC=0,64), dos RP (ICC = 0,71) e dos RE (ICC = 0,64). Considerando apenas tumores cujo componente in situ apresentasse áreas de necrose (comedo), o ICC para erbB-2 foi de 0,4, comparado a 0,6 no conjunto completo de casos. Os ICC não diferiram substancialmente daqueles obtidos com o conjunto completo de espécimes em relação aos RE/RP: para RE, ICC=0,7 (versus 0,7 no conjunto completo), e para RP, ICC=0,7 (versus 0,6 no conjunto completo). CONCLUSÕES: nossos achados sugerem que as expressões de erbB-2 e RE/RP não diferem nos componentes contíguos in situ e invasivo em tumores ductais da mama.

Dating minerals by ID-TIMS geochronology at times of in situ analysis: selected case studies from the CPGeo-IGc-USP laboratory

Since 1964, the Center for Geochronological Research - CPGeo, one of the interdepartmental centers of the Instituto de Geociências (IG) of São Paulo University, has developed studies related to several geological processes associated with different rock types. Thermal Ionization Mass Spectrometry Isotopic Dilution (ID-TIMS) has been the technique widely used in the CPGeo U-Pb Laboratory. It provides reliable and accurate results in age determination of superposed events. However, the open-system behavior such as Pb-loss, the inheritance problem and metamictization processes allow and impel us to a much richer understanding of the power and limitations of U-Pb geochronology and thermochronology. In this article, we present the current methodology used at the CPGeo-IGc-USP U-Pb laboratory, the improvements on ID-TIMS method, and report high-precision U-Pb data from zircon, monazite, epidote, titanite, baddeleyite and rutile from different rock types of several domains of the Brazilian south-southeast area, Argentina and Uruguay.

Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections

Interference by autofluorescence is one of the major concerns of immunofluorescence analysis of in situ hybridization-based diagnostic assays. We present a useful technique that reduces autofluorescent background without affecting the tissue integrity or direct immunofluorescence signals in brain sections. Using six different protocols, such as ammonia/ethanol, Sudan Black B (SBB) in 70% ethanol, photobleaching with UV light and different combinations of them in both formalin-fixed paraffin-embedded and frozen human brain tissue sections, we have found that tissue treatment of SBB in a concentration of 0.1% in 70% ethanol is the best approach to reduce/eliminate tissue autofluorescence and background, while preserving the specific fluorescence hybridization signals. This strategy is a feasible, non-time consuming method that provides a reasonable compromise between total reduction of the tissue autofluorescence and maintenance of specific fluorescent labels.

Influence of a polyclonal antibody preparation on the in situ degradability of three energy sources

The objective of this study was to evaluate the effect of a polyclonal antibody preparation (PAP) against specific ruminal bacteria on the in situ degradability of dry-grounded maize grain (DMG), high moisture maize silage (HMMS) starch and citrus pulp (CiPu) pectin. Nine ruminally cannulated cows were used in a 3 x 3 Latin square design, replicated three times in a factorial arrangement of treatments of two rumen modifiers represented by monensin and PAP plus a control group, and the three energy sources (DMG, HMMS and CiPu). Each period had 21 days, where 16 were used for adaptation to treatment and five for data collection. The group treated with PAP showed an effect on the soluble fraction (""a"") of DMG starch, decreasing it by respectively 45.3% and 45.4% compared to the CON and MON groups. No effect of PAP was observed for any in situ degradability parameters of starch from HMMS or pectin of CiPu. It was concluded that the polyclonal antibody preparation had limited effect on the in situ degradability of the tested energy sources.