Proteínas recombinantes de Plasmodium Falciparum para deteção de malária por nanoimunoensaios

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Protection of aouts monkeys after immunization with recombinant antigens of Plasmodium falciparum

The genus Aotus spp. (owl monkey) is one of the WHO recommended experimental models for Plasmodium falciparum blood stage infection, especially relevant for vaccination studies with asexual blood stage antigens of this parasite. For several immunization trials with purified recombinant merozoite/schizont antigens, the susceptible Aouts kenotypes II, III, IV and VI were immunized with Escherichia coli derived fusion proteins containg partial sequences of the proteins MSAI (merozoite surface antigen I), SERP (serine-strech protein) and HRPII (histidine alanine rich protein II) as well as with a group of recombinant antigens obtained by an antiserum raised against a protective 41 kD protein band. The subcutaneous application (3x) of the antigen preparations was carried out in intact animals followed by splenectomy prior to challange, in order to increase the susceptibility of the experimental hosts to the parasite. A partial sequence of HRPII, the combination of three different fusion proteins of the 41 kD group and mixture of two sequences of SERP in the presence of the modified Al(OH)3 adjuvant conferred significant protection against a challange infection with P. falciparum blood stages (2-5 x 10 (elevado a sexta potência) i. RBC). Monkey immunized with the MS2-fusion protein carrying the N-terminal part of the 195 kD precursor of the major merozoite surface antigens induced only marginal protection showing some correlation between antibody titer and degree of parasitaemia. Based on the protective capacity of these recombinant antigens we have expressed two hybrid proteins (MS2/SERP/HRPII and SERP/MSAI/HRPII) in E. coli containing selected partial sequences of SERP, HRPII and MSAI. Antibodies raised against both hybrid proteins in rabbits and Aotus monkeys recognize the corresponding schizont polypeptides. In two independent immunization trials using 13 animals (age 7 months to 3 years) we could show that immunization of Aotus monkeys with either of the two hybrid proteins administered in an oil-based well tolerated formulation protected the animals frm a severe experimental P. falciparum (strain Palo Alto) infection.

Estudo fitoquímico, avaliação da toxicidade oral aguda e da atividade antimalárica in vitro e in vivo das cascas de Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae)

Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae), também conhecida como Parahancornia amapa (Hub.) Ducke, é uma espécie vegetal empregada popularmente no tratamento da malária, infecções no útero, gastrite, anemia, problemas respiratórios, entre outros. Os objetivos do presente trabalho foram realizar o estudo fitoquímico, avaliar a toxicidade oral aguda e a atividade antimalárica in vitro e in vivo de extratos, frações e substância isolada obtidas a partir de cascas do caule de P. fasciculata. Foram realizados dois tipos de extrações com o pó das cascas de P. fasciculata, por maceração / percolação, com etanol 96°GL e diclorometano, esta última tendo sido realizada a com o pó das cascas alcalinizado com hidróxido de amônio, obtendo-se os extratos secos EEPF e EDAPF, respectivamente. Uma terceira extração foi realizada a partir do EEPF por aquecimento sob refluxo, sucessivamente, com Hex:DCM (1:1), AcOEt:DCM (1:1) e AcOEt. EEPF foi, também, submetido a fracionamento por extrações ácido-base resultando nas frações de neutros (EEPFN) e de alcalóides (EEPFA). A prospecção fitoquímica realizada com o EEPF foi desenvolvida por CCD em cromatoplacas de sílica gel tendo sido detectada a presença de triterpenos, esteróides, heterosídeos flavônicos, saponinas, polifenóis, taninos, heterosídeos antracênicos e heterosídeos cardiotônicos. EDAPF foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel. Foram recolhidas 30 frações sendo que as frações Fr1-3, Fr4, Fr5-7 e Fr11 concentraram a maior parte da massa do extrato cromatografado. Da Fr5-7 foi isolada uma mistura de ésteres do lupeol que representam os componentes majoritários do EDAPF. Esta fração passou por um processo de hidrólise alcalina e o produto obtido (Fr5-7Hid) foi analisado por espectrometrias no IV, RMN de ¹H e ¹³C e foi identificado como o triterpeno lupeol. A fração insolúvel em AcOEt obtida a partir do EEPF, por aquecimento sob refluxo, apresentou resultado positivo para o teste de proantocianidinas e foi submetido a doseamento desta classe de metabólitos. Os resultados foram expressos em porcentagem dos teores para a amostra não diluída (10,46±0,3419%), amostra diluída a 1:10 (9,94± 0,1598%) e amostra diluída a 1:100 (10,55± 0,9299%). A avaliação da atividade antiplasmódica in vitro em culturas de cepas W2 de Plasmodium falciparum foi realizada pelo teste da Proteína II Rica em Histidina (HRP-II) tendo sido testados EEPF, EEPFN, EEPFA, Fr1-3, Fr4, Fr5-7(ésteres do lupeol), Fr11 e o Fr5-7Hid (lupeol). Os melhores resultados obtidos foram para EEPF, EEPFA E EEPFN (CI₅₀= ~ 50 μg/mL) sendo considerados moderadamente ativos. As demais amostras apresentaram CI₅₀ > 50 μg/mL e foram consideradas inativas. Realizou-se também a avaliação da atividade antimalárica in vivo em camundongos fêmeas suíços infectados com cepas ANKA de P. berghei com o EEPF e o EEPF-HEX:DCM (1:1) em concentrações de 500, 250 e 125mg/kg de peso. EEPF foi parcialmente ativo, somente no 8° dia, em todas as concentrações. Já EEPF-HEX:DCM (1:1) foi parcialmente ativo na dose de 500mg/kg de peso e nas demais doses foi inativo. O teste de toxicidade oral aguda foi realizado em camundongos fêmeas suíços, pelo método da dose fixa (5.000mg/kg), com EEPF e não apresentou nenhum sinal de toxicidade evidente, o que foi confirmado pela ausência de alterações nos exames anátomohistopatológicos realizados.

Suunnatun evoluution menetelmät sekä Rekombinanttivasta-aineen affiniteetin parantaminen suunnatun evoluution avulla.

Erilaisilla mutageneesimenetelmillä pyritään muokkaamaan geneettistä koodia ja luomaan tätä kautta kestävämpiä ja sitomiskyvyltään parempia proteiineja. Ensimmäiset geneettiset mutaatiot olivat poikkeuksetta satunnaisia, jotka tapahtuivat ennalta määräämättömiin kohtiin DNA-sekvenssiä. Tänä päivänä on mahdollista tehdä suunnatun evoluution keinoin tarkoin suunniteltuja tai satunnaisia paikkakohtaisia mutaatioita. Yhdestä kohdegeenistä on mahdollista muodostaa lukemattomia eri variantteja jolloin ongelman muodostaa näiden muokattujen varianttien eristäminen lukemattomien yksilöiden joukosta. Suunnatun evoluution menetelmissä tuotetaan muokattuja proteiineja, jotka omaavat kehittyneitä ominaisuuksia ja sallimalla vain tämän ominaisuuden omaavien yksilöiden lisääntyä. Muokattuja proteiineja seulotaan sekä in vivo - että in vitro -pohjaisilla näyttötekniikoilla, sillä kunkin menetelmän käyttö riippuu seulottavasta molekyylistä. Uusia näyttötekniikoita kehitetään jatkuvasti korjaamaan ja kehittämään edellisissä olevia heikkouksia. Työssä pyrittiin parantamaan synteettisestä vasta-ainekirjastosta eristetyn HRPII-spesifisen Fab-vasta-ainefragmentin affiniteettia suunnatun evoluution avulla. Vasta-ainegeenin hypervariaabelialueisiin tehtiin paikkakohtaisia satunnaisia mutaatioita kahdella eri strategialla: kohdennetulla alukepohjaisella PCR-mutageneesillä ja selektiivisellä RCA-mutageneesillä. Lisäksi kahdella eri strategialla muokatuista sitojista muodostettiin rekombinaatioklooneja yhdistämällä näiden kevyen ketjun hypervariaabelialueita L1 ja L3 keskenään. Mutatoiduista vasta-ainefragmenttigeeneistä valmistettiin geenikirjastot, jotka rikastettiin faaginäyttötekniikalla. Kirjastoista eristettyjen sitojien affiniteetti mitattiin biokerrosinterferometrian avulla ja lämpökestävyys differentiaali pyyhkäisykalorimetrian avulla. Mutageneesimenetelmillä tuotetut kirjastot sisälsivät suunnitelman mukaisia mutaatioita ja tavoitellut kullekin kirjastolle asetetut teoreettiset diversiteetit. Kirjastoista eristettyjen ja rekombinaation avulla muokatun Fab-vasta-ainefragmentin sitoutumisvoimakkuus oli biokerrosinterferometrialla mitattuna 116-kertaisesti parempi alkuperäiseen vasta-ainefragmenttiin verratuna. Rekombinaatiokloonin assosiaatio- ja dissosiaatiovakiot paranivat oleellisesti templaattina toimineeseen alkuperäiseen vasta-ainefragmenttiin nähden. Affiniteettiparannuksen lisäksi myös mutantin sulamislämpötila oli yli 1 °C asteen korkeampi kuin alkuperäisen vasta-ainefragmentin. Kohonneen affiniteetin lisäksi klooni rekombinaatioiden yhteydessä havaittiin myös laskua sitoutumisvoimakkuudessa suhteessa rekombinaatiokloonin muodostamiin CDR-L1 - ja -L3 -osiin.