L’effet de HOXB4 sur l’expansion et la différenciation des progéniteurs myéloïdes

La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques.

Effet de la surexpression du gène Hoxb4 sur la prolifération homéostatique des cellules T mémoires

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles.

Expansion des mégacaryocytes par HoxB4 pour accélérer la reconstitution plaquettaire

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul traitement efficace contre les cancers hématologiques ainsi que plusieurs autres désordres reliés au système hématopoïétique. La greffe autologue est souvent le traitement de choix pour les patients atteints de lymphome ou de myélome. Dans ce cas, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) du patient sont récoltées et congelées. Le patient subit ensuite des traitements de chimiothérapie et/ou radiothérapie qui éliminent les cellules malignes, mais détruisent aussi son système hématopoïétique. Ce dernier sera ensuite reconstitué par la greffe de CSH. Ces traitements ont pour conséquence de plonger le patient en état d’aplasie pour une période variant de 2 à 4 semaines. La thrombocytopénie (faible taux de plaquettes) est une complication majeure nécessitant des transfusions plaquettaires répétées et associée à une augmentation de la mortalité hémorragique post-transplantation. Il serait particulièrement intéressant de développer une thérapie accélérant la reconstitution des mégacaryocytes (MK), ce qui aurait pour effet de raccourcir la période de thrombopénie et donc de diminuer les besoins transfusionnels en plaquettes et potentiellement augmenter la survie. HOXB4 est un facteur de transcription qui a déjà démontré sa capacité à expandre les CSH et les progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) donnant naissance aux MK. Il est donc un bon candidat pour l’expansion des progéniteurs MK. Comme la protéine HoxB4 a par contre une courte demi-vie (~1.1h), des protéines HoxB4 de deuxième génération avec une plus grande stabilité intracellulaire ont été créées (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) et 1427 (HoxB4Y28A)). Nous avons donc étudié la capacité d’HoxB4 sauvage et de deuxième génération à expandre les CSH, ainsi que les MK donnant naissance aux plaquettes. La surexpression rétrovirale de ces protéines HoxB4Y23A et HoxB4Y28A conduit à une expansion des progéniteurs MK murins in vitro supérieure à HoxB4-wt, 1423 et au contrôle GFP. La reconstitution plaquettaire in vivo dans un modèle murin a ensuite été évaluée par des transplantations primaires et secondaires. Les résultats révèlent que la surexpression rétrovirale des différents HoxB4 n’apporte pas de bénéfice significatif à la reconstitution plaquettaire des souris. Lorsque cultivées dans un milieu favorisant la différenciation mégacaryocytaire, le traitement de cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical avec les protéines recombinantes TATHoxB4WT ou de seconde génération n’a pas augmenté la production plaquettaire. Par contre, de manière intéressante, les cellules CD34+ provenant de sang mobilisé de patients atteints de myélome et mises en culture dans un milieu favorisant l’expansion des CSH ont montré des différences significatives dans la différenciation des progéniteurs MK en présence de la protéine recombinante TATHoxB4. La protéine HOXB4 possède donc un avenir prometteur quant à une amélioration de l’état thrombocytopénique chez les patients.

Gynogenesis and sex determination in large-scale loach Paramisgurnus dabryanus (Sauvage)

Gynogenesis was induced using heterologous sperms in large-scale loach, Paramisgurnus dabryanus (Sauvage), in which a ZW/ZZ sex determination was previously proposed. Three microsatellite loci were used to monitor exclusive maternal inheritance of gynogenetic progenies. The results showed that high percentages of meiogynogens were produced at 4 min post-fertilization and mitogynogens were produced at 18 min post-fertilization by heat shocks, while meiotic gynogenesis was induced by cold shocks within a wide period and high heterozygosity was even observed in gynogens produced at 24 min post-fertilization. The sex ratios of the F, progenies in three gynogenetic families were significantly deviated from 1: 1 expectation with a female bias in two families and a male bias in one family (P < 0.05), and the other four gynogenetic families showed approximate 1:1 sex ratios. Moreover, the self-mating between gynogenetic F, progenies and mating between gynogenetic F, progenies and normal individuals produced all-female progenies or identical proportions of females and males. The data of sex ratios generally confirmed that the sex determination in large-scale loach was determined by the putative ZW/ZZ system, and the possible reasons causing the biased sex ratios are discussed.

Nuclear transfer in leach (Paramisgurnus dabryanus Sauvage) by cell-to-cell electrofusion

To study nuclear transfer in the leach (Paramisgurnus dabryanus Sauvage), blastula and gastrula cells were fused with UV-inactivated oocytes by cell-to-cell electrofusion. To facilitate nuclear transfer, blastula and gastrula cells were cultured or incubated at 4 degreesC in different solutions. TC-199 medium supplemented with 20% calf serum was the best culture solution, and effectively retained the totipotence of blastula or gastrula cells for up to 10 days, It was found that gastrula cells incubated at 4 degreesC had the same totipotence as blastula cells, The optimal UV dosage for inactivation of the oocyte chromatin was 180-240 mJ cm(-2). Electrofusion was carried out in a cone-shaped fusion chamber, which permitted the recipient oocyte and the donor blastula cell to contact one another. The electrofusion procedure resulted in a 10% success rate of normal-appearing fish. Genetic analysis indicated that the nuclear material originated from the donor cell (blastomere) and the oocyte pronucleus did not take part in development.

Doctrinal Sauvage, Testament de Jean de Meun, Mélibée et Prudence de Christine de Pisan, Purgatoire de saint Patrice, Vie de saint Thibault, Déduit de chasse de Hardouin de Fontaine-Guérin, etc.

Contient : « Le Doctrinal Sauvage. » Cf. P. Meyer, Romania, t. VI, p. 21 ; F. Bonnardot, Bull. Soc. des Anc. textes, t. II, p. 76 ; Sentences latines, extraites de Sénèque, S. Ambroise, S. Léon, etc. Début : « Quod Deus est, scimus... » ; Extraits d'ouvrages latins sur la pénitence ; « Les enseignemens que le roy saint Louys fist à son filz. » Début : « Chier filz, la premiere chose que je t'enseigne, si est que tu mettes ton cuer en Dieu... » ; Avis sur l'éducation des enfants ; Sur les huit béatitudes. Début : « Pour entendre aucunement en gros la matiere de l'Euvangille de la Toussains... » ; « Traictié de Mellibée et de Prudance, » par Christine de Pisan. Début : « Après, ma treschiere dame, que j'ay fait sur Boece de Consolation a voustre service... » Imprimé ; cf. Brunet, Manuel du Libraire, t. I, col. 1036 ; t. III, col. 1589 ; « La manière de vouloir faire aucum testament. » Début : « In nomine Patris... saichant tout que je, Tel, en plaine vie... » ; « La signification de la messe. » Début : « Nostre Seigneur nous aprent... » ; « S'ensuit ung petit livre contre détraction. Début : « Se aucuns se repute religieux, comme dit saint Jacques... » ; « Douze considerations pour que l'âme soit exaucée de Dieu. » Début : « Cy vient à toy, Sauveur Jhesus, ceste ta serve... » ; Dialogue en vers entre Dieu, la raison, le coeur et les cinq sens ; Exemples moraux. Début : « Ung abbé demanda à ung larron qui le vouloit rober... » ; « La vie monsieur Saint Thiebault. » Début : « Sains Thiebaus fut néz de l'eveschié de Troyes... » ; « Le deduit de chiens et de chacier, » en vers, par « Herdoin, seigneur de Fontaine-Guérin » ; « Li aguillons d'amours. » Début : « O mes doulx Dieux, je qui en toy ay ma fiance... » ; « Medetacion devote et meritoire aux vii heures du jour. Début : « Tu dois savoir, quar ame espirituelment... » ; « Li purgatoire saint Patrice. » Début : « En ce temps que sain Patrices li grans preeschoit... » ; « Le miroer des pecheurs, » sermon traduit du latin. Début : « Mes tres chiers freres, nous sommes en ce monde fuians et passans noz jours... » ; Vers sur la Passion ; Traité sur les fins de l'homme, par G. de Mérucourt ; « Moralité faitte ou college de Navarre à Paris, le jour saint Anthoine l'an mil IIIIc XXVI, a cinq personnages, c'est assavoir, Dieu, le docteur, pechié, le dyable et l'omme. » — « Explicit la vigile de l'Ascension Nostre Seigneur l'an 1433, avant disner »

Le Travail et l'industrie de la construction, recherches et considérations sur leurs conditions économiques dans le passé, le présent et l'avenir, par P.-C.-M. Sauvage,... précédés d'une préface par M. Viollet-le-Duc

Comprend : Préface