Interação de Tomato severe rugose virus com Bemisia tabaci biótipo B, a acessos de Capsicum spp. e ocorrência de espécies de mosca-branca no Estado de São Paulo

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Geminivirus Rep Protein Interferes with the Plant DNA Methylation Machinery and Modifies the Host Epigenome

The apparent simplicity of viruses hides the complexity of their interactions with their hosts. Viruses are masters at circumventing host defenses and manipulating the cellular environment for their own benefit. The replication of the largest known family of single-stranded DNA viruses, Geminiviridae, is impaired by DNA methylation and Arabidopsis mutants affected in cytosine methylation are hypersusceptible to geminivirus infection. This implies that plants might use methylation as a defense against geminiviruses and that the viral genome is a target for plant DNA methyltransferases. We have found a novel counter-defense strategy used by geminiviruses, that reduces the expression of the plant maintenance DNA methyltransferases, MET1 and CMT3, in both, locally and systemically infected tissues. Furthermore, we demonstrated that the virus-mediated repression of these two maintenance DNA methyltransferases is widely spread among different geminivirus species. Additionally, we identified Rep as the geminiviral protein responsible for the repression of MET1 and CMT3, and another viral protein, C4, as an ancillary player in MET1 downregulation. The presence of Rep, suppresses TGS of an Arabidopsis transgene and of host loci whose expression is strongly controlled by CG methylation. Bisulfite sequencing analyses showed that the expression of Rep caused a substantial reduction in the levels of DNA methylation at CG sites. Our findings suggest that Rep, the only viral protein essential for geminiviral replication, displays TGS suppressor activity through a mechanism distinct from the one thus far described for geminiviruses.

Whitefly Transmission and Efficient ssDNA Accumulation of Bean Golden Mosaic Geminivirus Require Functional Coat Protein

Bean golden mosaic geminivirus (BGMV) has a bipartite genome composed of two circular ssDNA components (DNA-A and DNA-B) and is transmitted by the whitefly, Bemisia tabaci. DNA-A encodes the viral replication proteins and the coat protein. To determine the role of BGMV coat protein systemic infection and whitefly transmission, two deletions and a restriction fragment inversion were introduced into the BGMV coat protein gene. All three coat protein mutants produced systemic infections when coinoculated with DNA-B onto Phaseolus vulgaris using electric discharge particle acceleration "particle gun." However, they were not sap transmissible and coat protein was not detected in mutant-infected plants. In addition, none of the mutants were transmitted by whiteflies. With all three mutants, ssDNA accumulation of DNA-A and DNA-B was reduced 25- to 50-fold and 3- to 10-fold, respectively, as compared to that of wild-type DNA. No effect on dsDNA-A accumulation was detected and there was 2- to 5-fold increase in dsDNA-B accumulation. Recombinants between the mutated DNA-A and DNA-B forms were identified when the inoculated coat protein mutant was linearized in the common region.

A protocol for the rapid isolation of full geminivirus genomes from dried plant tissue

A high-throughput method of isolating and cloning geminivirus genomes from dried plant material, by combining an Extract-n-Amp™-based DNA isolation technique with rolling circle amplification (RCA) of viral DNA, is presented. Using this method an attempt was made to isolate and clone full geminivirus genomes/genome components from 102 plant samples, including dried leaves stored at room temperature for between 6 months and 10 years, with an average hands-on-time to RCA-ready DNA of 15 min per 20 samples. While storage of dried leaves for up to 6 months did not appreciably decrease cloning success rates relative to those achieved with fresh samples, efficiency of the method decreased with increasing storage time. However, it was still possible to clone virus genomes from 47% of 10-year-old samples. To illustrate the utility of this simple method for high-throughput geminivirus diversity studies, six Maize streak virus genomes, an Abutilon mosaic virus DNA-B component and the DNA-A component of a previously unidentified New Word begomovirus species were fully sequenced. Genomic clones of the 69 other viruses were verified as such by end sequencing. This method should be extremely useful for the study of any circular DNA plant viruses with genome component lengths smaller than the maximum size amplifiable by RCA. © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

A highly divergent South African geminivirus species illuminates the ancient evolutionary history of this family

Background. We have characterised a new highly divergent geminivirus species, Eragrostis curvula streak virus (ECSV), found infecting a hardy perennial South African wild grass. ECSV represents a new genus-level geminivirus lineage, and has a mixture of features normally associated with other specific geminivirus genera. Results. Whereas the ECSV genome is predicted to express a replication associated protein (Rep) from an unspliced complementary strand transcript that is most similar to those of begomoviruses, curtoviruses and topocuviruses, its Rep also contains what is apparently a canonical retinoblastoma related protein interaction motif such as that found in mastreviruses. Similarly, while ECSV has the same unusual TAAGATTCC virion strand replication origin nonanucleotide found in another recently described divergent geminivirus, Beet curly top Iran virus (BCTIV), the rest of the transcription and replication origin is structurally more similar to those found in begomoviruses and curtoviruses than it is to those found in BCTIV and mastreviruses. ECSV also has what might be a homologue of the begomovirus transcription activator protein gene found in begomoviruses, a mastrevirus-like coat protein gene and two intergenic regions. Conclusion. Although it superficially resembles a chimaera of geminiviruses from different genera, the ECSV genome is not obviously recombinant, implying that the features it shares with other geminiviruses are those that were probably present within the last common ancestor of these viruses. In addition to inferring how the ancestral geminivirus genome may have looked, we use the discovery of ECSV to refine various hypotheses regarding the recombinant origins of the major geminivirus lineages. © 2009 Varsani et al; licensee BioMed Central Ltd.

High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector

We constructed a novel autonomously replicating gene expression shuttle vector, with the aim of developing a system for transiently expressing proteins at levels useful for commercial production of vaccines and other proteins in plants. The vector, pRIC, is based on the mild strain of the geminivirus Bean yellow dwarf virus (BeYDV-m) and is replicationally released into plant cells from a recombinant Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. pRIC differs from most other geminivirus-based vectors in that the BeYDV replication-associated elements were included in cis rather than from a co-transfected plasmid, while the BeYDV capsid protein (CP) and movement protein (MP) genes were replaced by an antigen encoding transgene expression cassette derived from the non-replicating A. tumefaciens vector, pTRAc. We tested vector efficacy in Nicotiana benthamiana by comparing transient cytoplasmic expression between pRIC and pTRAc constructs encoding either enhanced green fluorescent protein (EGFP) or the subunit vaccine antigens, human papillomavirus subtype 16 (HPV-16) major CP L1 and human immunodeficiency virus subtype C p24 antigen. The pRIC constructs were amplified in planta by up to two orders of magnitude by replication, while 50% more HPV-16 L1 and three- to seven-fold more EGFP and HIV-1 p24 were expressed from pRIC than from pTRAc. Vector replication was shown to be correlated with increased protein expression. We anticipate that this new high-yielding plant expression vector will contribute towards the development of a viable plant production platform for vaccine candidates and other pharmaceuticals. © 2009 Blackwell Publishing Ltd.

Evaluación agronómica de cuatro variedades de tomate Lycopersicon esculentum (Mill) con dos técnicas diferentes para el manejo del complejo mosca blanca Bemisia tabaci (Genn) y Geminivirus

Con el objetivo de evaluar la adaptabilidad y rendimiento de Cuatro variedades de tomate Lycopersicum esculentum, en Santa Lucía municipio del departamento de Boaco. Se establecieron dos parcelas, una MIP y otra tradicional en la finca de los productores Holmán bravo y Miguel Álvarez. A cada parcela se le realizó diferente manejo técnico para el complejo mosca blanca Bemisia tabaci­ Geminivirus. Se evaluaron 4 variedades de tomate (UC-82, Peto-95, Río Grande y Pacesetter-502) y se tomaron los siguientes variables fitosanitarias: fluctuaciones de mosca blanca, incidencia de virosis e incidencia de gusanos de fruto, también se evaluaron algunas variables agronómicas para conocer la adaptabilidad de las variables como: Número de racimos florales por planta, altura del primer racimo floral, número de racimos frutales y diámetro horizontal y vertical del fruto.La incidencia de mosca blanca en semillero fue mínima y no alcanzó el nivel de aplicación (10 moscas blancas en 50 plantas) y rolo se encontró un máximo de 9 insectos en el semillero tradicional que fue donde se encontró más. Pero después del trasplante las fluctuaciones aumentaron tanto en la parcela MIP como tradicional y a partir de los 17 días después del trasplante las fluctuaciones superaron el nivel de aplicación (12 moscas blancas en 30 plantas) y así se mantuvieron en todo el periodo del ensayo. Las fluctuaciones de gusanos de fruto fueron bajas y no alcanzaron el nivel de aplicación en la parcela MIP, en la parcela tradicional a los 39 DDT alcanzaron el nivel de aplicación. Las variables agronómicas evaluadas en la parcela MIP, superaron a las de la parcela tradicional exceptuando el número de racimos frutales por planta y en el diámetro horizontal del fruto de la variedad Río Grande que fueron superiores en la parcela tradicional; se obtuvo mayor rendimiento en las cuatro variedades en la parcela MIP que en la parcela tradicional y la variedad UC-82 Y Río Grande presentaron el mayor rendimiento en comparación con las otras variedades evaluadas en las dos parcelas. Las condiciones climáticas presentes durante el ensayo fueron favorables para la adaptabilidad de las variedades. El análisis económico muestra un mayor ingreso neto para las variedades evaluadas en la parcela MIP, y que la variedad RIO GRANDE Género el mayor ingreso neto en las 2 parcelas.

Evaluación de seis variedades de tomate (Lycopersicum esculentum Mill),bajo un manejo Mip, para el complejo mosca blanca geminivirus, en el Valle de Sébaco

El cultivo de tomate es una de las hortalizas mas preferidas para consumo fresco, las altas poblaciones de mosca blanca han provocado que los agricultores realicen excesivas aplicaciones de Insecticidas quimicos los cuales provocan efectos colaterales. En busca de métodos alternativos para el manejo de la mosca blanca geminivirus se planteó este trabajo para evaluar seis variedades de tomate lndustrial: milano, Silverados, FMX-922, NH-4764,NHW-785 y UC-82 B, a través de un B.C.R. con seis réplicas,donde los resultados muestran que la mayor incidencias de mosca blanca se presentó de (10-20) días después del transplante d.d.t. en todas las variedades. Cuando se realizó el análisis de insectos acumulados no se encontró diferencias entre las variedades.La Incidencias de virosis resultó significativas en las fechas 24 y 37 d.d.t. El rendimiento comercial de tomate para todas las variedades fue similar, sobresaliendo la variedad NH-4764.EI daño de frutos por Heliothis sp fue mayor en la variedad testigo UC-82 B,las variedades Silverados,milanos,FMX-922,NH-4764 y NHW-785, presentaron los porcentajes de daño más bajo con respecto al testigo, el daño de fruto por enfermedades fungosas fué medido en dos momentos 67 y 68 ddt, presentando NHW-785 el porcentaje más alto 44.6% en la primer fecha 67 ddt, en la segunda fecha 78 ddt la variedad FMK-922 fue la que presento el porcentaje mas alto.

Aspectos bioecológicos de mosca blanca (Bemisia tabaci gennadius) y geminivirus con énfasis en el cultivo de tomate (Licopersicom esculentum Mill) en el Valle de Santa Lucía, Boaco, Nicaragua

El complejo mosca blanca (Bemisia tabaco Gennadius) – Geminivirus es la causa principal de la reducción en el rendimiento de los cultivos atacados por este insecto vector. Con el objetivo de determinar cuáles son las principales especies de plantas hospederas de mosca blanca y cuál es su papel como reservorios de geminivirus se realizó un estudio en época de postrera en dos comunidades de Valle de Santa Lucia, Boaco. Así mismo se llevaron a cabo prácticas MIP en el cultivo de Tomate (desinfección de suelo para semillero, uso de barreras vivas, trampas amarillas, distancia de siembra en semillero, muestreo de plagas, uso de insecticidas botánicos y químicos) y se evaluó el efecto de tres distancias de siembra sobre el rendimiento del cultivo. A través de muestreos se reconoció y contabilizó las especies de plantas hospederas de mosca blanca posibles reservorios de geminivirus, se registró el número de ninfas por hospedero, ninfas parasitadas, adultos de mosca blanca emergidos y parasitoides emergidos. Las muestras identificadas como posibles reservorios de geminivirus fueron procesadas y enviadas al Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica para determinar posibles geminivirus presente en ellas. Se encontraron 13 especies hospederas (cultivadas y silvestres) de mosca blanca en ambas comunidades, sobresaliendo Phaseolus vulgaris L., Agerantum Conyzoide, Bidens Amaranthus viridis. El aporte de las especies de plantas hospederas al crecimiento poblacional de Bemisia Tabaci fue variable en ambas fincas y en diferentes periodos de muestreo, alcanzando las poblaciones más altas en el mes de Octubre. Se identificó como único parasitoide de B. tabaco a Encarsia spp. No se detectó presencia de geminivirus en las muestras enviadas a Costa Rica. En el semillero de tomate la incidencia de mosca blanca fue mínima debido a las practicas MIP realizadas en esta etapa sin alcanzar el nivel de aplicación, una vez trasplantado, las poblaciones se mantuvieron bajo un promedio de 0.4 moscas blancas por planta mediante aplicaciones semanales de Nim 80 EC y por aplicaciones de THIONEX 35 EC cuando mosca blanca sobrepaso los promedios de 0.8 adultos por planta.

Caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en Nicaragua

El objetivo del presente trabajo consistió en la caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Licopersicon esculentum Mili.), el estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria (UNA), en el período de enero 2001 a enero 2002. Se efectuó en tres fases: la primera fase de invernadero, donde se utilizaron plantas de tomate de la variedad UC-82, crías de mosca blanca (Bemisia tabaci Genn), fuente original del aislado del geminivirus de Condega, con el objetivo de caracterizar biológicamente el geminivirus, a través de periodos de adquisición, inoculación y retención, previamente para la realización de estos periodos, se determinó el porcentaje de transmisibilidad de la colonia de mosca blanca, el cual fue de 45% Jo que indicó que para asegurar la transmisibilidad del virus fue necesario usar 5 moscas por planta. Los períodos de adquisición e inoculación fueron los tiempos de 2, 5, 10 y 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 18, 24 y 48 horas con 3 repeticiones de cada periodo, los datos obtenidos de estos periodos fueron analizados mediante un análisis de regresión logístico binario, resultando que el vector fue capaz de adquirir y transmitir el virus tanto en 1 O minutos (40% y 33%) como en 48 horas (60% y 66.66%) respectivamente, respecto al periodo de retención se estableció realizándose un promedio de los porcentajes de severidad de las 3 repeticiones mostrando como resultado que el vector conservó su capacidad de transmisión del virus hasta el sexto día con 45.07% de transmisibilidad, también se evaluaron 5 especies de la familia solanáceas injertándolas con plantas afectadas con el genminivirus de Condega, para conocer cuáles son hospederas del virus, resultando la especie Nicotiana tabacum cv. Benthamiana con síntomas del virus. En esta misma fase se evaluaron 4 materiales de tomate (55, 111, 148, 112) usando como testigo la variedad UC-82, se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA) y se evaluó la variable severidad de la enfermedad a los datos obtenidos a través de ANDEVA y separación de medias según Duncan, estos materiales se evaluaron mediante cuatro tratamientos (inoculaciones), el primero a los 7 ddt, el segundo a los 14 ddt, el tercero a los 21 ddt y el último tratamiento fueron las plantas sin inocular (testigos), el análisis indicó que la variedad UC-82 fue la más susceptible ante el complejo mosca blanca-geminivirus presentando mayores porcentajes de severidad y el material 112 resultó el más resistente, con menos porcentajes de severidad. La segunda fase se realizó fuera del invernadero, evaluándose ante el complejo mosca blanca-geminivirus 3 materiales, incluyendo la variedad UC-82 como testigo. Se utilizó un Diseño completamente al Azar, tomando en cuenta las variables severidad, incidencia y población de mosca blanca, A los datos obtenidos se les realizó ANDEVA y separación de medias según Duncan, el que mostró que el material 55 fue el mejor, ya que presentó menos porcentaje de severidad (40%), el peor material fue lavar. UC-82 ya que mostró 58.75% de severidad, con relación a la incidencia todos los materiales evaluados resultaron al final de los muestreos con igual porcentaje de incidencia (!00%) y en el caso de la población de mosca blanca la variedad UC-82 fue la que presentó más adultos por planta en comparación con el resto de materiales. La tercera fase fue realizada en el laboratorio de biología molecular en la UNA y Suecia con el propósito de caracteri7ar molecularmente los geminivirus de Condega., Santa Lucía y Sébaco, secuenciando un fragmento de 1200 pares de bases del componente A para comparar a través de las secuencias de nucleótidos los porcentajes de similitud que existen entre ellos, dando como resultado que el geminivirus de Sébaco con el de Santa Lucía alcanzó mayor porcentaje de similitud con un 95.2 con respecto al geminivirus de Condega que obtuvo un 89.0%.

Determinación del período de adquisición, inoculación y retención del geminivirus transmitido por la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn) en el cultivo de tomate (Licopersicon esculentum Mill) en el Valle de Sébaco

El objetivo del presente trabajo consistió en la caracterización biológica de un geminivirus que afectó el cultivo del tomate ( Licpersicon esculentum Mill ). El estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria (UNA), en el periodo de enero 2001 - enero del 2002. Esta i nvestigación se realizó en tres fases: la primera de invernadero, donde se cultivaron plantas de tomate de la variedad UC - 82, se improvisó una cría de moscas blancas ( Bemisia tabaci Genn) vector del geminivirus en estudio y donde se estuvo reproduciendo el geminivirus de Sébaco en las plantas de tomate de la variedad ya mencionada, que servirían posteriormente como fuente de inóculo, esto se hizo por medio de injertos e inoculaciones, con el propósito de caracterizarlo biológicamente determinando los periodos de adquisición, inoculación, retención así como el rango de hospedero. Para este estudio se determinó a demás el porcentaje de infectividad de las colonias de moscas blancas, el cual fue de 66.6%, lo que indicó que se necesitaban cinco moscas por tratamiento, ya que estas garantizarían que al menos tres de ellas serían portadoras del geminivirus una vez que han adquirido el virus de la fuente de inóculo. Los tratamientos consistían en los diferentes tiempos expresados en horas como 0.08, 0.16, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 18, 24, 48, h con tres repeticiones para cada uno de ellos. La fase de laboratorio de vectores consistió en llevar a cabo prácticamente los periodos de adquisición, inoculación y retención, los cuales dieron como resultados que B.tabaci necesita alimentarse de una planta infestada tan sólo 0.16 h que es equivalente a 10 minutos para adquirir el virus y que necesita un mismo tiempo para transmitirlo una vez que se ha alimentado en una planta sana. Respecto al periodo de retención el vector es capaz de retener las partículas virales hasta un séptimo día y que a medida que pasan los días la capacidad de transmisión disminuye. En el estudio era también objetivo conocer cual era el rango de hospedante que tenía el geminivirus de Sébaco, por lo que se evaluaron 5 especies de la familia Solanácea, injertándolas con plantas infestadas del cultivo del tomate, resultando la especie Nicotiana tabacum cv Benthamiana con síntomas del virus. La última fase se llevó a cabo en el laboratorio de Biología Molecu lar donde se analizó a través de la técnica de PCR la presencia y ausencia de geminivirus en las plantas con las que se estuvo trabajando en el transcurso de la investigación. Finalmente los resultados obtenidos en los diferentes periodos fueron analizados mediante un análisis de Regresión Logística Binaria, ya que los datos eran categóricos, es decir, cuyas respuestas son de sí o no en otras palabras presencia o ausencia del geminivirus, donde la presencia era igual a uno y la ausencia de este mismo igual a cero.

Evaluación del comportamiento de cinco materiales de tomate (Lycopersicum esculentum Mill) ante el ataque del complejo mosca blanca -geminivirus- en la región central del pais

El objetivo de este trabajo fue evaluar cinco materiales de tomate (Lycopersicum esculentum Milll) ante infestaciones natura les del complejo mosca blanca- geminivirus en la región Central del país en el período comprendido de Diciembre 2002 – Abril 2003. En este experimento se evaluaron las líneas TY-4, TY-12, TY-13 y las variedades MTT-013 y MTT-019, el diseño utilizado fue el de Bloques Completo al Azar (BCA). Las variables evaluadas fueron: población de moscas blancas/pta, incidencia de la enfermedad, severidad de la enfermedad, número de racimos florales, número de flores, número de frutos por planta y rendimientos (kg/ha). A los datos obtenidos se les aplicó un Análisis de Varianza y una separación de medias según Tukey. Los resultados indicaron que la línea TY-4 y la TY-13 fueron las más tolerantes al complejo mosca blanca – geminivirus, siendo la variedad MTT-013 la más susceptible. En cuanto a la severidad, la mejor línea es la TY-4 seguida de la TY-13 y la TY-12, siendo la más severamente afectada la variedad MTT-013. En el caso de la población de mosca blanca, la variedad MTT-013 fue en la que se encontró el mayor número de adultos y en la que se encontraron el menor número de adultos de mosca blanca fue la línea TY-13. Para las variables racimos florales y flores la variedad que obtuvo el mayor promedio fue la variedad MTT-013 y el menor la línea TY-4. En el caso de los frutos, el material con menor promedio fue la variedad MTT-013 y los mayores promedios los alcanzaron las líneas TY-12 y TY-13, respectivamente. El mayor rendimiento lo alcanzó la línea TY-13 con un rendimiento equivalente de 19,000 kg/ha y el menor la variedad MTT-013 con un rendimiento equivalente de 7,000 kg/ha. En la etapa de laboratorio se comprobó efectivamente la presencia de geminivirus en todos los materiales evaluados.

Estudio epidemiológico del complejo mosca blanca -geminivirus en cultivos de tomate (Lycopersicum esculentum Mill) y chiltoma (Capsicum annuum L.) en el valle de Sébaco, Matagalpa y en el valle San Cristóbal, Managua

El estudio consistió de tres experimentos realizados en el Valle de Sébaco, Valle San Cristóbal y Universidad Nacional Agraria. El primero se realizó con el objetivo de determinar que variedades de tomate (Lycopersicum esculentum Mill) y chiltoma (Capsicum annum L.) eran tolerantes al complejo mosca blanca-geminivirus, utilizando un diseño BCA, once tratamientos que correspondían a las once variedades de cada cultivo; el segundo con el objetivo de determinar si el uso de barreras vivas de maíz son efectivas para disminuir las poblaciones de mosca blanca estableciendo un diseño de parcelas MIP, compuesta por dos parcelas, una con barrera de maíz y otra sin barrera; y el tercero con el fin de obtener mayor conocimiento de la biología de la transmisión viral donde se determinaron tres períodos bajo condiciones de invernadero: adquisición, inoculación y retención del geminivirus de el Valle San Cristóbal transmitido por mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.). Los resultados indican que las variedades de tomate FLA-505, FLA 478-6-3-0, FLA 456-4 presentaron menor porcentaje de incidencia al complejo mosca blanca geminivirus. En el caso de las variedades de chiltoma evaluadas no se detectó la presencia de geminivirus probablemente debido a que los primers utilizados no son capaces de detectar la raza de geminivirus presente. Otra probabilidad es que los síntomas presentes sean causados por otros tipos de virus. En el ensayo de chiltoma Valle San Cristóbal se demuestra que las menores poblaciones de mosca blanca se presentaron en la parcela con barrera, por lo que deducimos que el uso de barrera disminuye las poblaciones de mosca blanca en el cultivo, evitando mayores pérdidas económicas. El período mínimo de adquisición fue de 5 minutos con un 67% de transmisión. En la prueba de inoculación se determinó que el tiempo mínimo de alimentación de la mosca para transmitir el virus fue de 5 minutos con un porcentaje de transmisión del 100%. En el período de retención del geminivirus por mosca blanca se obtuvo que la mosca conservó su capacidad de transmisión del virus sin una nueva adquisición del virus por un período máximo de 7 días.