水稻Phi类谷胱甘肽转移酶基因家族的功能分化研究

在植物中大多数功能基因是以基因家族的形式存在的，而基因重复则是基因家族的一种重要的进化方式。很多基因往往是由重复事件产生形成不同的拷贝，进而分化形成基因家族。谷胱甘肽转移酶（GSTs）是一类古老、庞大、行使解毒、抗逆、信号转导等多种功能的一个基因家族。本研究以栽培水稻（Oryza sativa ssp. japonica c.v. Nipponbare）为研究材料，以栽培水稻的Phi类GST的5个基因（OsGSTF3、OsGSTF6、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16）为研究对象，分析了它们的系统发生和起源历史、不同组织的差异性表达、编码蛋白质的功能差异等问题，探讨了基因重复后5个基因的功能变化，主要结果如下： 1. OsGSTF3、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16由串联重复产生，而OsGSTF6则由DNA转座产生;它们起源时间早在稻属（Oryza）分化之前。 2. 对水稻不同部位组织的RT-PCR结果表明这5个基因在水稻中的特异性表达组织部位有较大差异：OsGSTF3基因在叶、叶鞘、茎、根4个部位均有大量表达;OsGSTF6基因仅在叶中有表达;OsGSTF14基因在叶鞘、茎2个部位中有表达;OsGSTF15基因在茎、根2个部位中有表达;OsGSTF16则在叶、茎、根3个部位中有表达。 3. 将这5个基因连接原核表达载体PET30a并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得了高表达菌株。将表达菌株进行大量表达，表达形式分析显示OsGSTF3蛋白是可溶性表达，而其余4个蛋白以包涵体的形式表达。通过亲和层析获得了纯化的OsGSTF3融合蛋白，OsGSTF3融合蛋白对底物CDNB和NBD-Cl具有高活性，酶动力学分析显示OsGSTF3融合蛋白对GSH与NBD-Cl有较高的亲和力，热力学分析显示该蛋白在40℃以下是热稳定的。通过对包涵体进行洗涤、亲和层析获得了纯化的OsGSTF6、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16的融合蛋白，OsGSTF14融合蛋白对NBD-Cl有微弱活性，OsGSTF15融合蛋白对NBC有较高的活性，而没有检测到OsGSTF6与OsGSTF16融合蛋白的活性。

柠条种子蛋白，同工酶遗传分析与群体遗传结构

本文研究了毛乌素沙地6个不同生态环境的柠条群体和1个锡盟草原站的小叶锦鸡儿群体的同工酶和种子蛋白的遗传变异。利用Brown等(/975)同工酶遗传分析方法对同工酶和种子蛋白的多态性进行了遗传分析。运用Shannon信息指数和Nei指数分析测定了锦鸡儿群体的遗传结构。结果表明： (l) Brown同工酶遗传分析的方法适合于柠条同工酶的遗传分析。 （2用LAP酶对柠条群体进行了精细的遗传结构研究。结果表明毛乌素沙地柠条群体的异交性。GST=D．134，即大部分的变异存在于群体内部，小部分的变异存在于群体之间。柠条群体的繁育系统与水分胁迫有关。随着生境变旱，繁育系统有向近交变化的趋势。 (3) Brown同工酶遗传分析方法也可以运用于种子蛋白遗传分析，柠条种子蛋白各亚基的遗传是孟德尔方式。 (4)由种子蛋白变异所统计测定的柠条群体的遗传分化系数GST=0.l81(Nei指数)或0.179(Shannon指数，Kongkiatngam改进)。群体变异水平按表型多样性依次为人工毛条群体>锡盟群体>滩地群体>硬梁群体>软梁群体>丘下群体>丘上群体。按遗传多样性依次为人工毛条群体>软梁群体>锡盟群体>滩地群体和硬梁群体>丘上群体>丘下群体。群体间基因流水平Nm>/，遗传距离D<0．1。 还试验对玉兰、合欢、紫藤、绿豆几种植物种子蛋白变异的遗传分析。最后对同工酶，种子蛋白遗传分析和群体遗传结构进行了讨论并提出今后工作的一些建议。

烟草FtsZ基因的表达特征分析及其对质体发生的影响

FtsZ (filamentation temperature-sensitive，fts)是广泛存在于原核生物和高等植物中的一种功能蛋白。它控制着原核细胞和质体的分裂过程。研究该基因的表达调控特征，为我们进一步认识原核细胞和质体分裂的分子机制及真核细胞的起源和进化等重要问题提供了新的思路。从烟草克隆FtsZ cDNA，构建了谷胱甘肽转移酶（GST, glutathione S-transferase，EC 2.5.1.18）与FtsZ融合蛋白的表达质粒，并将其导入到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的JM109大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽一琼脂糖(glutathione-agarose)亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后，用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法表明烟草FtsZ基因表达具有明显的组织器官特征，在质体（叶绿体）分裂活跃部位表达强：幼嫩花瓣>幼叶>幼根>老叶>茎。黑暗处理l天对FtsZ表达似乎无影响，随黑暗培养时间延长，FtsZ蛋白表达逐渐降低，叶绿体转化成为数目众多（增加2-3倍）体积小的淡黄色或白色质体。该实验结果显示，光对植物FtsZ基因表达很可能无直接影响，FtsZ基因表达强弱是决定质体（叶绿体）分裂和细胞中质体（叶绿体）数目多少的主要原因之一。

绊根草重金属抗性相关基因的克隆及其功能分析及可耐受偏二甲肼的芦苇变异株系的筛选

本研究利用酵母功能互补方法和RACE的方法从具有较强抗逆能力的绊根草中克隆了9个与重金属抗性相关的克隆，并对部分基因的表达调控及功能进行了初步研究。同时还利用细胞工程技术筛选到了具有较强的耐受火箭推进齐-偏二甲肼(UDMH)的芦苇的变异株系，为以后用人工湿地系统处理受偏二甲肼污染的废水奠定了基础。 本研究通过酵母功能互补法克隆到了五个基因，分别为CdSRP、CdTETH、 CdASP、CdMT2和CdTER1。CdSRP可能是一种衰老相关基因;CdTETH编码的产物可能是组成TRAPP复合体的一个亚基;CdASP是一个功能未知的基因;CdMT2是一个编码Type Ⅱ型金属硫蛋白基因;CdTER1可能是编码一个TERl-like家族蛋白成员的基因。用这五个基因分别转化因Acr基因缺失而对As敏感的酵母菌株FD236-6A，所获得的转化子对As的抗性均有提高，其中以CdMT2、CdTER1和CdASP的作用最为明显。这些基因的表达调控方式以及与其它重金属抗性的关系正在研究中。 本研究还利用RACE的方法克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶基因，CdGSTFl;两个植物络合素合酶基因，CdPCSI和CdPCSⅡ，和一个TypeⅠ型金属硫蛋白基因CdMT1。CdGSTF1属于phi类GST基因，Northern-blotting分析表明，CdGSTF1在绊根草根部的表达受Cd2+的诱导，暗示其可能具有解除氧自由基或氢过氧化物的毒性的作用。CdPCSI和CdPCSⅡ的同源性较高，表明绊根草含有两个以上的PCs合酶的基因。参照前人的方法对CdPCSI和CdPCSII的氨基酸序列进行分析，发现它们含有六个非常相近的Cd2+结合位点，这两个基因的功能及其调控方式有何差异尚需进一步的研究。cdMT1与用酵母功能互补法克隆到的CdMT2属于不同类型的MT基因，对它们之间很可能存在的功能、组织特异性等方面的差异性进行了讨论。 四氧化二氮／偏二甲肼是常用的航天器双组元液体推进剂。偏二甲肼易挥发，有致癌、致畸、致突变的毒性。在推进剂贮存、运输、转注、火箭发动机试车、火箭发射、管道及设备冲洗中产生的含有偏二甲肼的废水能够对卫星发射基地的地下水源和空气造成污染。因此迫切需要培育能够净化偏二甲肼污水的植物。 本研究利用生长在卫星发射基地的野生芦苇的种子诱导愈伤组织，进而通过逐步提高偏二甲肼筛选压力的方式从中筛选出具有较强抗性的愈伤组织，然后诱导其分化。目前已经得到能够在含有1.63 mmol/L和3.26 mmol/L偏二甲肼的分化培养基中生长良好的芦苇再生苗，并已成功转移至温室中。抗性分化苗对污水的处理效果和耐受偏二甲肼的机理正在研究中。

羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究

羊草（Leymus chinensis (Trin.) Tzvel），隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过细胞、分子生物学以及生物技术手段改良羊草、快速评价和创造新的种质;如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1. 建立了羊草离体培养再生体系，并研究了影响愈伤组织诱导和植株再生的因素，影响植株再生的主要因素为激素配比和基因型。将3～5mm的幼穗接种到含有2,4-D 0～5.0mg/L的N6基本培养基上，随着2,4-D浓度的变化，愈伤组织诱导率不同，最高诱导率为93.21%（基因型C6）、最低为33.35%（吉生1号）;愈伤组织在N6(大)＋B5(微)＋KT1.0mg/L+BA1.0mg/L的培养基上可以分化出芽，并在1/2MS培养基上生根。羊草基因型W4不同幼穗诱导的愈伤组织在继代培养过程中其生长、褐化死亡等方面存在着差异;在分化培养过程中，不同幼穗的愈伤组织最高分化率为9.24%，最低分化率为5.26%。 2. 对来自同一基因型不同幼穗的愈伤组织中差异表达的基因进行了研究。采用DDRT-PCR技术对其差异表达的基因进行了分离，通过银染技术显示差异片段。将得到的差异片段进行回收、克隆测序，得到两个差异片段序列，经过序列分析表明，其中一个片段是与水稻翻译延伸因子eEF-1基因高度同源;另一差异片段与水稻谷胱甘肽转移酶GST基因高度同源。 3. 建立了羊草遗传转化方法。在获得羊草离体培养再生体系的基础上，采用基因枪法对羊草两个基因型进行转抗除草剂基因（PAT）的研究。对分别来自基因型W4和C3的愈伤组织各1430和1850块进行转化。在附加1.0mg/L PPT的培养基上进行一系列的筛选培养，共获得了23株再生苗，经过生根筛选培养，得到5株抗性苗，3株来自基因型W4，2株来自基因型C3。对5株植株进行PCR和Southern 检测，得到2株阳性苗，均来自基因型W4，对阳性植株经过无性繁殖得到的无性系进行PCR检测及Basta耐受性鉴定，外源基因可以在其无性系稳定遗传并表达，无性系除对Basta具有抗性外，其表型特征与对照无明显区别。

水稻中一个编码富含脯氨酸蛋白基因家族的表达和功能研究

OsPRP1是水稻中特有的，编码一类富含脯氨酸蛋白（proline-rich protein, PRP）的基因家族，该家族有4个成员。在GenBank中，仅找到了一个结构相对接近的玉米PRP蛋白，但是对它的研究仅限于序列上的某些描述，而且在序列上，仍然与这4个OsPRP1蛋白有明显的差别。OsPRP1蛋白明显有别于前人（1999）所描述的4类PRP蛋白。它们是植物中一类新的小分子量的PRP蛋白，仅有一个保守结构域而属于DUF1210蛋白超家族的成员。 四个OsPRP1基因在基因组中紧密串联排列，而且编码区高度保守，基因结构也高度一致，证明它们来源于同一个祖先基因，是通过基因复制的方式产生的。PAML分析也证明它们在进化时间上的相互距离并不远。而在进化过程中由于执行生理功能上的某种重要性，在编码区表现出很的保守性，因而很难在RNA水平和蛋白水平上研究四个OsPRP1基因的表达差异。但是它们在表达调节区（如启动子区）显示出明显的差异。在克隆启动子的基础上，用GUS报告基因的策略，没有检测到它们在拟南芥中的表达活性，说明它们具有一定的种属特异性。而在水稻中，这四个基因的表达显示出了明显的时序和空间差异，既表现出在组织器官及其发育阶段上的特异性和变化，又在一定程度上表现出交叉，出现了功能上的分化和重叠。根据启动子区上的顺式元件，检测了这些基因对6种植物生长调节物质和3种非生物胁迫因子的应答反应，证明它们的表达调节也表现出显著的差异和分化。因此，四个基因的进化出现了功能退化、亚功能化和产生新功能等多种命运，比理论模型预期的要复杂得多，可能在执行生理功能和对环境反应上具有各自的生物学意义。 植物细胞壁是多种碳水化合物和蛋白质相互交织在一起的亲水性网络。在保护和支撑原生质、细胞通信、细胞分化、细胞对生物的和非生物胁迫的抗性等方面发挥着重要作用。目前已知的大多数植物PRP蛋白被描述成细胞壁结构性蛋白。OsPRP1基因家族编码的蛋白质都有一个N-端信号肽，暗示它们可能是一类分泌蛋白。我们用OsPRP1.1::GFP融合蛋白进行了亚细胞定位，证明了OsPRP1蛋白的确也是细胞壁相关蛋白。用原核表达体系表达了GST-融合蛋白，制备抗体，通过免疫印迹证明这些蛋白不溶于温和的提取缓冲溶液中，但可以被高盐和强碱溶液溶解，且分子量增加了三倍。证明在体内可能出现修饰、与细胞壁其它组分相交联的现象。 在这四个基因中，只有OsPRP1.2能够在水稻根中特异表达。根的原位杂交实验证明，OsPRP1在分化成熟程度低的细胞中大量表达，而在分化成熟程度高的细胞中几乎不表达。GUS染色的结果同样发现，基因在维管柱特别是中柱鞘附近的薄壁细胞的表达比别的细胞要强得多，而且在根的生长方向上表现出与发育相关的表达特征。说明OsPRP1基因可能参与了这些细胞的分化、发育过程。而基因表达的组织器官特异性的差异和对不同刺激因素的不同反应意味着它们可能参与了多种生理过程。为此构建了一个RNAi的表达载体，转化水稻，Southern杂交实验得到9个单位点插入的T2代独立株系，其中有6个株系与野生型对照相比，主根的早期伸长受到显著抑制，主根的一级侧根地数量减少，根尖分生区的细胞在轴向上的伸长受到了抑制。结合表达定位和原位杂交的结果，我们对它们在植物生长发育中的功能进行了深入探讨。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE得到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

台湾杉群体遗传结构的研究

本文以采自云南、贵州和台湾三个地区的九个台湾杉群体为材料，应用同工酶分析技术对其群体遗传结构进行了测定和分析，结果发现台湾杉的遗传多样性的几个指标P,A He(P=44.4%,A=1.5,He=0.141)均比一般针叶树种的平均值(P=67.7%,A=2.29,He=0.207)为低，推此较低的遗传多样性主要与台湾杉的进化历史有关，台湾杉的基因分化系数Gst(Gst=0.109)为0.109，符合其风媒异花授粉的特点。利用所获得的有关遗传多样性和群体遗传结构方面的数据不仅能对台湾杉属的分类提供新的佐证，更为实现对其更好的保护和利用提供了不可缺少的本底资料。

水稻幼苗脱黄化过程以及灌浆期茎的蛋白质组学研究

水稻既是我国三大粮食作物之一，又是基因组学研究的模式材料，在生产实践和科学研究中都占有极其重要的地位。基因组学研究取得的巨大成就以前所未有的深度和广度推动了生命科学各个研究领域的飞速发展。水稻基因组的破译是水稻科学研究的重要里程碑，同时也宣告了功能基因组学时代的到来。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的动态表达及其相互关系的新兴学科，是功能基因组学研究的重要组成部分和战略制高点。 本论文采用高分辨率的蛋白质双向电泳分离技术和高通量的蛋白质质谱分析技术以及生物信息学等手段，开展水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻幼苗脱黄化过程的比较蛋白质组学研究，探讨茎生长发育规律和水稻应答光信号相关蛋白质及其网络调控机制，是学科前沿与实际应用的有机结合，在科研和生产实践中都具有重要的意义。 首先，分别构建了灌浆期水稻顶端茎段和水稻黄化幼苗的蛋白质组表达谱。并对其中185个目的蛋白点进行了MALDI-TOF/MS分析和数据库检索鉴定。共有149个蛋白质得到了鉴定，蛋白质鉴定的成功率为80.5％。这些被鉴定的蛋白质分属118个基因的表达产物，根据它们功能可以分为13种不同的类别，其中绝大多数为能量产生和代谢以及抗性相关的蛋白质。 在水稻灌浆期顶端茎段表达的蛋白质中，与能量和物质代谢相关的蛋白质例如ATPase、磷酸丙糖异构酶，6－磷酸葡萄糖异构酶等占有很高比例，说明茎段组织中具有很强的代谢活动。与生长发育相关的蛋白质包括beta-tubulins、无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase）、液泡质子ATP酶（vacuolar proton-ATPase）以及UDP葡萄糖焦磷酸酶等的大量累积，显示出顶端茎段细胞分裂和生长迅速;同时，贮存多糖和结构多糖也在旺盛合成。G蛋白、GDP释放抑制因子等信号传导蛋白以及苯丙氨酸氨解酶、谷胱苷肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）、抗坏血酸过氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗性相关蛋白质在该时期丰度表达，表明在灌浆期水稻顶端茎段能够迅速感受并传递外界信号，从而使得其在遭受胁迫时能够立刻启动抗逆防御系统，最大限度地降低不利环境对种子发育的影响。 在黑暗中萌发和生长的水稻黄化幼苗随着光照时间（0~24小时）的延长，能通过双向电泳后检测到的蛋白质逐渐变少，24小时后趋于稳定，相当于正常光照条件下生长的水稻幼苗蛋白质组表达谱。进一步分析表明，在黄化苗中，分解代谢及能量产生相关的蛋白如丙糖磷酸异构酶、琥珀酰辅酶A连接酶、异戊酰辅酶A脱氢酶与ATPase等的表达量比较丰富;另外，还可能启动了脂肪酸的α氧化分解途径，以供黑暗中生长所需的物质和能量。当黄化幼苗光照后，与光合作用及物质合成相关的一些蛋白质表达量增加，而那些分解代谢相关酶类则有所下降。同时，鸟核苷酸结合蛋白β亚基类似蛋白、20S proteasome以及Bowman Birk trypsin inhibitor等信号传递及抗性相关蛋白随着光照时间的延长而减少，说明黑暗胁迫条件下水稻幼苗启动了相关的抗逆途径。叶绿素合成途径中的蛋白酶胆色素原脱氨基酶和金属鳌合酶在脱黄化过程中表达量有所下降，可能是因为叶绿素合成产物具有反馈抑制作用。 本研究首次利用蛋白质组学方法来解析水稻灌浆期茎蛋白质组表达模式和水稻黄化幼苗响应光因子的蛋白质组变化情况，鉴定了一些有价值的蛋白质，并得到了它们的表达特点和相关数据，为更好地理解水稻顶端茎秆的生长特点和功效、水稻应答黑暗胁迫和光形态建成以及光合作用机理等提供了分子证据。

天山不同海拔高度下长鳞红景天种群遗传多样性分析

长鳞红景天（Rhodiola gelida）属景天科红景天属，多年生草本。主要分布在我国新疆中部天山。在天山一号冰川观测试验站附近的高寒草甸上，从海拔3850m~4010m均有长鳞红景天分布。长鳞红景天是一种重要的药用植物，但目前尚未见到有关其遗传多样性方面的研究报道。本文利用相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子标记技术，对新疆天山不同海拔高度3个长鳞红景天种群的遗传多样性，种群内及种群间的遗传变异进行研究，为有效保护和合理利用长鳞红景天物种资源提供理论依据。主要结果如下： （1）基于CTAB法，建立了适合长鳞红景天的DNA提取方法，获得的DNA经琼脂糖电泳和紫外分析仪检测，浓度和质量均较高。该法有利于去除长鳞红景天植物材料中多糖、多酚类等物质，获得的高质量基因组DNA能够满足后续的PCR实验要求。 （2）采用正交实验对影响长鳞红景天SRAP-PCR反应的4个主要因素（Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度）进行优化试验，选出这4个因素的最佳水平组合，建立了长鳞红景天SRAP-PCR最佳反应体系。同时，根据最佳体系筛选出扩增稳定、多态性丰富的SRAP引物。通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度，得到了适合长鳞红景天SRAP-PCR反应的最佳扩增程序。 （3）对20对SRAP引物的扩增结果进行统计分析显示：长鳞红景天物种水平的多态位点百分率(P)为96.00 %，Shannon信息指数(I)为0.4484、基因多样性指数(H)为0.2922，表现出较高的遗传多样性水平；在海拔梯度上，长鳞红景天各种群间的遗传多样性水平有一定差异，但没有呈现规律性的变化；AMOVA分子变异分析显示，在总遗传变异中24.76 % 的变异存在于种群间，75.24 % 的变异存在于种群内，种群间的基因分化系数(Gst)为0.1749，表明3个长鳞红景天种群的变异主要存在于种群内，但种群间也出现了一定程度的遗传分化；长鳞红景天3个种群间的基因流为2.3595，遗传距离平均值为0.0981（变化范围：0.0768 ～0.1196），遗传距离较近，说明海拔高度对长鳞红景天的地理隔离较小；相关性分析表明长鳞红景天种群的遗传多样性与各生态因子的相关性均不显著。

Biogeochemical study of poly aromatic hydrocarbons (PAHs) and its physiological affection response in mudskipper (Boleophthalmus dussumieri) at coast of Khuzestan

Study on the biomarkers types to assess health status of marine ecosystems in environmental biomonitoring has an important value. Accordingly, accumulation of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) in sediment, water and tissues (liver and gill) of mudskipper(i.e. Boleophthalmus dussumieri) and some physiological responses like lysosomal membrane change performed on haemocytes, stability of red blood cell membrane and the Glutathione-S Transferase (GST) activity in the liver were measured in mudskipper. Samples were obtained from five sites along north western coast of the Persian Gulf (Khuzestan coast). Red blood cell membrane changes after different concentration of PAHs at different time was also studied to evaluate impact of PAHs compound on cell membrane. PAHs concentration was measured by HPLC method. The activity of GST enzyme was analysed by spectrophotometric method. Lysosomal membrane change was measured by NRR time method and stability of red blood cell membrane was evaluated by EOF test. Total PAH concentrations in the coastal sea water, the sediments, the liver and the gill tissues ranged between 0.80-18.34 μg/l, 113.50-3384.34 ng g-1 (dry weight), 3.99-46.64 ng g-1 dw and 3.11-17.76 ng g-1 dw, respectively. Highest PAHs pollution was found at Jafari while the lowest was detected at Bahrakan sampling sites. The lowest enzymatic activity was identified at Bahrakan (7.19 ± 1.541 nmol/mg protein/min), while the highest was recorded at Jafari (46.96 ± 7.877 nmol/mg protein/min). Comparative analysis of GST activity in the liver of mudskippers showed significant difference (p < 0.05) between the locations of Jafari and Bahrakan, and with other sites. Moreover, no significant difference was detected between the locations of Arvand, Zangi and Samayeli (p < 0.05). The mean RT was below 90 minutes in all sampling sites. Values of mean RT of the dye ranged from 34 (for the blood samples of mudskipper collected from Jafari site) to 78 minutes (for the blood samples of mudskipper collected from Bahrakan site). Spatial evaluation revealed the longest RT in fish from Bahrakan as compared with those from other sites. Preliminary results showed a significant difference (p < 0.05) among sampling sites except between Arvand and Zangi (p > 0.05). Osmotic fragility curves indicated that erythrocytes collected from mudskippers at Jafari were the most 009 fragile followed by Zangi> Arvand> Samayeli> and Bahrakan. The mean erythrocyte fragility was significantly higher at Jafari site (p < 0.05) when compared to other sites. Significant differences were found between the various sites (p < 0.05).The result indicated no significant differences between the control and treatments of mudskipper RBC exposed to field concentrations of PAHs (P>0.05). The results further indicated significant differences (P<0.05) between the control and treatments of mudskipper RBC exposed to acute. Potency Divisor concentrations. It is clear from the present result that chronic. Potency Divisor concentrations protect red cells against osmotic hemolysis. This study, however, showed that PAH concentrations in this region are not higher than the available standards. The findings showed that Lysosomal membrane destabilization, liver GST activities and fragility of red cell membrane are highly sensitive in the mudskipper, B. dussumieri. Thus, mudskipper perceived to be good sentinel organisms for PAH pollution monitoring. Sediment PAH concentrations were strongly correlated with biomarkers, indicating that PAH type pollutants were biologically available to fish. One of the possible risk assessment implications of this study is that biomarkers can be applied not only to characterize biological effects of pollution exposures, but also to determine the bioavailability of pollution in aquatic systems. The results also indicated that PAHs compound possess anti haemolytic property.

不同藏獒群体血液蛋白遗传变异与聚类分析

为了分析不同群体藏獒血液蛋白基因座的遗传变异及藏獒与其他犬种的亲缘关系,试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,以青海藏狮犬和青海土种犬为对照,对2个藏獒群体的9个血液蛋白基因座的遗传变异进行了检测。结果表明:河曲藏獒群体内遗传变异较青海藏獒丰富,而两个藏獒群体间的遗传分化程度很低(GST=0.0187);青海藏獒与青海藏狮犬、青海土种犬的遗传关系近于河曲藏獒,并且4个青藏高原犬群在聚类图上形成一个独立的分支,与其他犬种之间遗传关系较远。

藏獒群体遗传结构及遗传分化研究

采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对河曲藏獒和青海藏獒2个群体86只犬的9个结构基因座(Tf、Po、Es-1、Es-2、Sα2、Hb、Alb、Pr、Amy)的遗传变异情况进行了检测,探讨了2个藏獒群体的遗传结构和遗传分化。结果表明,河曲藏獒群体内遗传变异较青海藏獒丰富,而2个藏獒群体间的遗传分化程度很低(GST=0.018 7);较大的基因流(Nm=14.543 7)是2个藏獒不同地理群体间遗传分化水平低的主要原因。

小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体的制备及细胞内定位的初步研究

目的:制备小鼠双尾C蛋白Bicc1的多克隆抗体并确定其在细胞内定位.方法:根据生物信息学分析结果, PCR扩增小鼠Bicc1编码61E-199A的cDNA片段.将该片段克隆到GST融合蛋白表达载体上, 在IPTG诱导下产生Bicc1-N抗原.纯化目的蛋白并制备兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体.Western blot鉴定抗体特异性, 并以间接免疫荧光法初步分析该蛋白在细胞内定位.结果:成功构建Bicc1-N片段原核表达载体, 在大肠杆菌中实现可溶性表达, 制备小鼠Bicc1蛋白的多克隆抗体, 并证实该蛋白主要表达于细胞质内.结论:成功制备了高效价并特异的兔抗Bicc1多克隆抗体, 为进一步研究Bicc1基因产物的生物功能奠定了基础.

鱼类谷胱甘肽转移酶基因cDNA克隆及其序列分析

采用RT-PCR方法,从鲢、鲤、鲫3种鱼类肝脏总RNA中克隆出了谷胱甘肽转移酶Pi型(GST Pi)cDNA序列,推导了其编码的氨基酸序列。3种鱼类GST Pi的ORF全长627bp,编码208个氨基酸。翻译起始密码均为ATG,终止密码子均为TGA。鱼类与哺乳动物、两栖类爪蟾以及节肢动物丝虫之间GST Pi氨基酸序列相似度平均值分别为50%、33%、15%左右。5种鱼类之间的氨基酸序列相似度较大,其中鲤科鱼类之间平均为85%左右。我们以GST Pi为分子标记,用最大简约数法(MP)构建了13个物种的系统进