Caractérisation de la résistance à la bacitracine et évaluation in vitro de bactériophages envers les Clostridium perfringens aviaires

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Environnements présentant un risque nouveau de contamination des travailleurs par des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline

L'exposition aux bactéries résistantes aux antibiotiques, en particulier à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM (1)) sur le lieu de travail, a été montrée comme étant un facteur de risque pour la santé des opérateurs, la fréquence des contacts avec cette bactérie augmentant la probabilité d'en devenir porteur. En plus du fait que les SARM augmentent d'un facteur 4 le risque d'infection chez le porteur, le choix du traitement antibiotique en cas d'infection est fortement limité. C'est pourquoi il est important d'identifier les environnements de travail et les conditions qui favorisent la transmission de cette bactérie de l'animal à l'Homme. La résistance à la méthicilline est conférée au S. aureus par un élément génétique mobile, appelé « staphylococcal cassette chromosome » mec (SCCmec), qui contient le gène de résistance à la méthicilline, mecA. SCCmec a cinq formes (I, II, III, IV and V) qui ont été acquises et intégrées dans le génome de S. aureus lors d'événements indépendants de transfert horizontal. Certaines de ces lignées spécifiquement associées au bétail traité aux antibiotiques (tel que le complexe clonal 398, CC398 (2)), peuvent également coloniser le nez humain. Ainsi, la colonisation nasale ou contamination a été constatée chez 23 à 86 % des agriculteurs et vétérinaires ayant un contact direct avec des porcs, ainsi que chez un à cinq pour cent des personnes ayant une exposition indirecte (par exemple les membres de la famille d'agriculteurs, les visiteurs de la ferme). La pathogénicité du SARM CC398 pour l'Homme a été documentée dans une série de rapports décrivant des cas d'endocardite, d'otomastoïdite et de pneumonie. En outre, le SARM CC398 a été introduit dans des structures de santé (hôpitaux, cliniques, etc.) situées principalement dans les zones d'élevage à forte densité. Si les porcs sont des vecteurs bien connus de transmission de CC398 à l'Homme, d'autres animaux peuvent l'être également, tels que les dindes en Allemagne, comme illustré par le premier article cité dans cette note. Par ailleurs, la propagation de ces souches résistantes aux antibiotiques est inquiétante. Le deuxième article de cette note révèle l'apparition de souches de CC398 dans le lait de vache au Royaume-Uni pays où, jusqu'alors, la surveillance n'en avait pas détecté.

Taf14 : un cofacteur de transcription impliqué dans l'activation de la transcription de Imp2 : un gène nécessaire pour la résistance à la bléomycine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Taf14 : un cofacteur de transcription impliqué dans l'activation de la transcription de Imp2 : un gène nécessaire pour la résistance à la bléomycine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Etude des effets du monoxyde d'azote (NO) sur le métabolisme des acides gras libres à partir d'un modèle de souris invalidée pour le gène de la NO synthase endothéliale

RESUME GENERAL Au cours de ces dernières années, le monoxyde d'azote (NO) produit par une famille d'enzymes, les NO synthases (NOS), est apparu comme un effecteur central dans la régulation du système cardiovasculaire et du métabolisme énergétique. Chez l'homme, un défaut de production du NO est associé à des maladies cardiovasculaires et métaboliques comme la résistance à l'insuline ou le diabète de type 2. Ces pathologies se retrouvent chez les souris invalidées pour la NO synthase endothéliale (eN0S-/-) qui présentent non seulement une hypertension mais également une résistance à l'insuline et une dyslipidémie (augmentation des triglycérides et des acides gras libres). Ces anomalies sont étroitement associées et impliquées dans le développement du diabète de type 2. Dans cette étude, nous avons essayé de déterminer à partir du modèle de souris eN0S-/-, l'influence de la eNOS et de son produit, le NO, sur la régulation du métabolisme lipidique intracellulaire. Ainsi, nous avons montré que cette enzyme et le NO régulent directement l'activité β-oxydative des mitochondries isolées du muscle squelettique, du muscle cardiaque et du tissu adipeux blanc. Par ailleurs, dans le muscle de ces souris, le contenu des mitochondries et l'expression des gènes impliqués dans leur biogénèse sont diminués, ce qui suggère que la eNOS et/ou le NO contrôlent également la synthèse de ces organelles. Les mitochondries, via la β-oxydation, sont impliquées dans la production d'énergie à partir des acides gras libres. Dans notre modèle animal, la diminution de la β-oxydation dans le muscle, s'accompagne d'une accumulation des triglycérides intramyocellulaires. Cette accumulation prédispose fortement au développement de la résistance à l'insuline. Les anomalies du métabolisme β-oxydatif favorisent donc probablement l'apparition de la dyslipidémie et le développement de la résistance à l'insuline observées chez les souris eN0S-/-. Cette hypothèse est soutenue par différentes études effectuées chez l'homme et l'animal qui suggèrent qu'une dysfonction mitochondriale peut être à l'origine de la résistance à l'insuline. Ces données récentes et les résultats de ce travail apportent un regard nouveau sur le rôle du NO dans le développement des maladies métaboliques que sont la résistance à l'insuline, le diabète de type 2 et l'obésité. Elles placent aux centres de ces mécanismes une organelle, la mitochondrie, située au carrefour des métabolismes glucidiques et lipidiques. SUMMARY Over the last years, nitric oxide (NO), synthesized by a family of enzymes, the NO synthases, has become a central regulator of the cardiovascular system and energy metabolism. In humans, defective NO production is found in cardiovascular and metabolic diseases such as insulin resistance or type 2 diabetes mellitus. These alterations are also found in knockout mice for the endothelial nitric oxide synthase (eN0S-/-), which are not only hypertensive but also display insulin resistance and dyslipidemia (with increased triglyceride and free fatty acid levels). These pathologic features are tightly linked and involved in the pathogenesis of type 2 DM. In this study, using eN0S-/- mice, we determined the role played by this enzyme and its product, NO, on intracellular lipid metabolism. We show that eNOS and NO directly regulate β-oxidation in mitochondria isolated from skeletal and cardiac muscle as well as white adipose tissue. Furthermore, in the skeletal muscle of these mice, the mitochondrial content and the expression of genes involved in mitochondrial biogenesis are decreased, suggesting that eNOS and/or NO also regulate the synthesis of this intracellular organelle. Mitochondria, through β-oxidation, play a role in energy production from free fatty acids. In our animal model, decreased β-oxidation in skeletal muscle is associated with accumulation of intramyocellular lipids. This increased lipid content plays an important role in the pathogenesis of insulin resistance. Defective β-oxidation, therefore, probably favours the development of insulin resistance and dyslipidemia as seen in these animals. This hypothesis is strengthened by studies in humans and animals indicating that mitochondrial dysfunction is associated with insulin resistance. These recent data and the results of this work provide evidence for a role of NO in the development of metabolic diseases such as insulin resistance or type diabetes mellitus. They put as a central player, an organelle, the mitochondria, which lies at the crossway of carbohydrate and lipid metabolism. RESUME DIDACTIQUE Le maintien des fonctions vitales et l'accomplissement d'une activité physique nécessitent, chez l'homme, un apport quotidien d'énergie. Cette énergie est présente, dans l'alimentation, principalement sous forme de graisses (lipides) ou de sucres. La production d'énergie s'effectue en majorité dans le muscle au niveau d'une organelle particulière, la mitochondrie. La régulation du métabolisme énergétique fait intervenir de nombreux facteurs de régulation dont l'un des plus connu est l'insuline. De nombreuses maladies comme le diabète de type 2, l'obésité ou le syndrome métabolique découlent de la dérégulation du métabolisme énergétique. Un mécanisme particulier, la résistance à l'insuline, qui se caractérise par un défaut d'action de l'insuline au niveau de ses tissus cibles (foie, muscle...) est souvent impliqué dans le développement de ces pathologies. L'étude de ces anomalies métaboliques nécessite l'utilisation de modèles, notamment animaux, qui ont la particularité de reproduire partiellement un état pathologique caractéristique de certaines maladies humaines. Dans ce travail, nous avons utilisé un modèle de souris dont la particularité est de ne pas exprimer une enzyme, la monoxyde d'azote (NO) synthase endothéliale (eNOS), responsable de la synthèse d'un gaz, le NO. Ces souris présentent une hypertension artérielle, des anomalies du métabolisme des lipides et une résistance à l'insuline. Or, de récents travaux effectués chez l'homme montrent que des individus insulino-résistants ou diabétiques de type 2 ont une diminution de la production de NO. Lors de nos investigations, nous avons démontré que la quantité et la capacité des mitochondries à utiliser les lipides comme substrat énergétique est diminuée dans les muscles des souris eN0S-/-. Par ailleurs, ces deux anomalies sont associées dans ce tissu à une accumulation des lipides. De façon très intéressante, ce phénomène est décrit dans de nombreuses études effectuées chez l'homme et l'animal comme favorisant le développement de la résistance à l'insuline. Les résultats de ce travail suggèrent donc que la eNOS et/ou le NO joue un rôle important dans l'activité et la synthèse des mitochondries. Le NO pourrait donc constituer une cible thérapeutique dans le traitement des maladies métaboliques.

L'implication des cellules de type cellules souches cancéreuses dans la résistance aux drogues du neuroblastome

Le neuroblastome (NB), tumeur spécifique de l'enfant, se situe au second rang en terme de¦fréquence des tumeurs solides dans la population pédiatrique (1). Il dérive des cellules¦primitives de la crête neurale, une population de cellules embryonnaires dotées d'une¦capacité de différentiation en une panoplie de tissus très variés, dont le système nerveux¦sympathique (2). Cette origine explique la très grande hétérogénéité du NB, tant du point de¦vue biologique que clinique (3). Malgré un traitement intensif et multimodal (chirurgie,¦chimiothérapie à haute dose, greffe de moelle osseuse et immunothérapie), seuls 30 % des¦patients de haut risque (stade IV) survivent sans rechute. La forte résistance du¦neuroblastome de haut grade aux diverses thérapies est une des causes probable du¦pronostic sombre de cette tumeur. Les thérapies actuelles étant insuffisamment efficaces, il¦est primordial de comprendre les mécanismes impliqués dans le processus de résistance¦afin d'élaborer de nouveaux traitements, mieux ciblés, capables de contrer toute résistance¦(4).¦Il a été démontré que certains cancers, tels que les tumeurs du poumon, du sein, de la¦prostate ou du colon, possédaient des cellules souches cancéreuses (CSCs) (5). Ces¦dernières, définies comme étant une petite sous-population de cellules malignes, jouent un¦rôle prépondérant dans l'initiation et la progression tumorale. Elles partagent certaines¦propriétés avec les cellules souches physiologiques, telles que la capacité d'autorenouvellement,¦un potentiel de prolifération indéfini, une dépendance à un¦microenvironnement spécifique, une faculté de pluripotence et une résistance accrue aux¦drogues (6). Ce modèle de CSCs a également été étudié pour le NB (7), permettant ainsi¦d'avancer l'hypothèse selon laquelle cette population de CSCs serait responsable de la¦résistance aux chimiothérapies des cellules tumorales du NB.¦Afin de tenter d'éclaircir le caractère résistant aux drogues des CSCs du NB, nous avons¦sélectionné des sous-populations cellulaires résistantes, en traitant par divers agents¦cytotoxiques (cisplatine, doxorubicine, rapamycine et vincristine) cinq lignées différentes de¦neuroblastes. Dans le but d'établir un potentiel enrichissement en CSCs au sein de ces¦sous-populations par rapport aux populations contrôles non traitées, nous avons testé leurs¦fonctions d'auto-renouvellement et de clonogénicité. Ces propriétés ont été respectivement¦mises en évidence par la capacité des cellules à former des sphères de plusieurs¦générations dans des conditions de culture inhibant l'adhésion cellulaire et par la mesure de¦la croissance cellulaire en milieu semi-solide (soft agar assay). Une analyse d'expression¦génique effectuée préalablement par microarray (Human Genome U133Plus 2.0 Affymetrix¦GeneChip oligonucleotide) dans le laboratoire avait révélé une liste de gènes surexprimés¦dans les CSCs, dont fait partie mdr1 (8). Ce gène code la protéine de transport Pgp (Pglycoprotein),¦impliquée dans le mécanisme de résistance (9,10). Une étude par cytométrie¦en flux de l'expression de MDR1 dans nos diverses populations a également été réalisée¦afin de mettre en évidence une potentielle surexpression de ce gène au sein des cellules¦résistantes aux chimiothérapies.

Identification des réseaux transcriptionnnels de résistance aux antifongiques chez Candida albicans

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif.

Étude du polymorphisme du gène majeur d’histocompatibilité de classe IIb (MHIIb) chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis)

Les molécules classiques du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) sont des glycoprotéines de surface spécialisées dans la présentation de peptides, principalement dérivés de pathogènes extracellulaires, aux récepteurs des lymphocytes T CD4+ afin d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sont encodées, avec celles du CMH de classe I, par les gènes les plus polymorphiques identifiés jusqu’à maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversité allélique à chacun d’eux. De plus, le polymorphisme des gènes du CMHII n’est pas limité qu’aux séquences codantes. Il est également observé dans les promoteurs où on a démontré ses effets sur le niveau d’expression des gènes. La variation de la régulation d’un gène est considérée comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observées chez tous les organismes. Des séquences d’ADN répétées impliquées dans cette régulation ont été identifiées dans les régions non-codantes des génomes. D’un autre côté, la sélection par les pathogènes permettrait l’évolution et le maintien du polymorphisme des gènes du CMH chez les vertébrés. À ce sujet, plusieurs études ont montré l’implication de différents allèles du CMH dans la résistance ou la susceptibilité aux maladies. Cette étude avait pour objectifs de caractériser le polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie conférée par des allèles et/ou génotypes particuliers lors d’une infection, ainsi que sur la variation du niveau d’expression du gène dans différentes conditions. Dans une première partie, nous avons identifié un total de 6 allèles du gène MHIIb, désignés Safo-DAB*0101 à Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarité avec les séquences codantes provenant de poissons téléostéens et de l’humain. L’analyse des séquences du domaine b1 a permis de détecter l’effet d’une pression sélective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette région de la molécule. Quatre de ces allèles ont été testés lors d’une expérience d’infection avec le pathogène Aeromonas salmonicida afin d’évaluer l’effet qu’ils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouvé que l’allèle DAB*0101 était significativement associé à la résistance à la furonculose. En plus d’avoir été identifié chez les individus homozygotes pour cet allèle, l’effet a également été remarqué au niveau de la survie les poissons de génotype DAB*0101/*0201. À l’opposé, les facteurs de risque élevé obtenus pour les génotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggèrent plutôt une association à la susceptibilité. Étant donné la faible fréquence à laquelle l’allèle DAB*0101 a été retrouvé dans la population, le modèle de la sélection dépendante de la fréquence pourrait expliquer l’avantage conféré par ce dernier et souligne l’importance de ce mécanisme pour le maintien du polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine. Dans une seconde partie, nous avons rapporté la présence d’un minisatellite polymorphique formé d’un motif de 32 nucléotides dans le second intron du gène MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de répétitions du motif a été associé à chaque allèle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 répétitions pour les allèles DAB*0101 à DAB*0601 respectivement). L’expression relative de quatre allèles a été évaluée dans des poissons hétérozygotes aux températures de 6 ºC et 18 ºC. Les résultats indiquent que les allèles possédant un long minisatellite montrent une réduction de l’expression du gène d’un facteur 1,67 à 2,56 par rapport aux allèles qui en contiennent un court. De même, des allèles qui incluent des minisatellites de tailles similaires n’affichent pas de différence significative au niveau de l’abondance du transcrit aux deux températures. De plus, l’effet répressif associé aux longs minisatellites est amplifié à la température de 18 ºC dans des poissons de trois génotypes différents. Nous avons finalement observé une augmentation significative par un facteur 2,08 de l’expression totale du gène MHIIb à la température de 6 ºC. Ces résultats appuient l’implication des séquences d’ADN répétées dans la régulation de l’activité transcriptionnelle d’un gène et suggèrent qu’un minisatellite sensible aux différences de températures pourrait être soumis aux forces sélectives et jouer un rôle important dans l’expression de gènes et l’évolution des organismes poïkilothermes.

Rôle du gène Polycomb BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Étude de la résistance des sous-types non-B du VIH-1 aux antirétroviraux au Mali

Nous avons effectué ce travail afin d’évaluer l’impact d’une utilisation accrue des antirétroviraux (ARV) sur l’émergence de la résistance dans le cadre d’une cohorte de sujets infectés par le VIH-1, enrôlés au Mali pour recevoir la thérapie antirétrovirale. La première partie de ce travail a évalué la résistance primaire auprès de 101 sujets naïfs aux ARV. Cette étude a démontré que la majorité des sujets (71,3%) étaient infectés par le sous-type CRF02_AG. La prévalence de la résistance primaire était de 9,9%. Ce chiffre dépasse largement la moyenne de 5,5% observée dans les pays en développement et le seuil des 5% fixé par l’OMS dans le cadre de la surveillance de la résistance. Les mutations associées aux analogues de la thymidine ou « Thymidine-associated Mutations » (TAMs): M41L, D67N, L210W, T215A/Y, K219E liées à la résistance aux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) ainsi que les mutations K103N, V108I, V179E et Y181C impliquées dans la résistance aux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) étaient majoritairement observées. Ces mutations sont compatibles avec les régimes de traitement de première ligne utilisés au Mali, composés de stavudine/lamivudine/nevirapine. Nous n’avons pas trouvé de mutations majeures aux inhibiteurs de protéase (IP), probablement du fait que cette classe d’ARV est rarement utilisée au Mali. Cependant plusieurs polymorphismes au niveau du gène de la protéase, particulièrement L10I et L10V ont été observés à une fréquence très élevée (18,80%). Compte tenu de ces premiers résultats, une suite logique de ce travail était de savoir comment des souches de sous-type CRF02_AG évolueraient sous la pression de sélection des ARV. Nous avons abordé ces questions dans une étude de cohorte de 132 sujets infectés majoritairement avec le sous-type CRF02_AG débutant une thérapie de première ligne. Nos résultats suggèrent que la présence de mutation de résistance primaire pourrait avoir un effet sur l’efficacité du traitement. Par exemple, la présence d’une seule mutation INNTI avant traitement comme K103N ou V179E était suffisante pour mener à l’échec au traitement (charge virale supérieure à 400 copies/ml). Par ailleurs, nous avons effectué des expériences in vitro pour mieux évaluer l’impact du polymorphisme L10I/V chez le sous-type CRF02_AG. Il faut savoir que le rôle de ce polymorphisme reste incertain chez le sous-type CRF02_AG, car aucune étude in vitro n’avait été réalisée auparavant. Nos résultats indiquent chez le sous-type sauvage CRF02_AGwt_10L une légère augmentation de la concentration inhibitrice 50% (IC50) pour le darunavir, le lopinavir et le nelfinavir comparativement au sous-type de référence B HXB2_10L avec respectivement un « Fold Change » (FC) de 1,2, 1,3 et 1,5. Cette augmentation est plus importante pour le lopinavir avec un FC (1,3) très proche de son seuil biologique (1,6). Comparativement au type sauvage CRF02_AGwt_10L, nos deux mutants CRF02_AGL10I et CRF02_AGL10V ont démontré une légère augmentation d’IC50 pour l’indinavir (avec respectivement un FC de 1,3 et 1,2) et une diminution pour le lopinavir (avec respectivement un FC de 0,78 et 0,75). Toutes ces observations suggèrent que la mutation en position 10 pourrait avoir un impact chez le sous-type CRF02_AG. Toutefois, la signification clinique de ces observations doit être déterminée. En conclusion, nos résultats supportent d’une part la nécessité de renforcer la surveillance de la résistance aux ARV et d’autre part, il fournit des informations nécessaires à l’amélioration des stratégies thérapeutiques afin de prévenir les échecs aux traitements chez les sous-types non B, particulièrement le CRF02_AG.

Étude de la résistance aux antibiotiques des entérocoques d'origine animale du Québec

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence.

Paroles de femmes : positionnement et stratégies de résistance

Nées des travaux des féministes américaines, les gender studies, faut-il le rappeler, se sont constituées aux Etats Unis dans les années quatre-vingts à partir des questionnements sur les rapports hommes / femmes au sein de la société. Depuis les années soixante-dix, la French Theory avait déjà joué un rôle très important dans le débat théorique américain avec les philosophes Gilles Deleuze, Jacques Derrida, Michel Foucault, Jean-François Lyotard… Remettant sans cesse en question le pouvoir, l’institution et la manière de penser, ils se sont distingués par la force de leur posture critique et par leur engagement. Aussi faut-il rappeler l’importance des travaux et des réflexions de femmes intellectuelles françaises, comme Hélène Cixous, Julia Kristeva, Luce Irigaray et tant d’autres pour les études du genre.

Le règne animal distribué d'après son organisation, pour servir de base à l'histoire naturelle des animaux et d'introduction à l'anatomie comparée.

t.4 (1829)