980 resultados para Festphasensynthese, Diamino-D-Galactose-Scaffolds, RNA-Liganden
Resumo:
Die Aufklrung der Schlsselrolle der RNA in zahlreichen biologischen Prozessen, die sich aus ihren selektiven Wechselwirkungen mit anderen RNA-Moleklen, Proteinen, Peptiden bzw. Antibiotika ergibt, ist fr die Wirkstoffforschung von groer Bedeutung. Die Aminoglycoside und Antibiotika, die durch eine Hemmung der Proteinbiosynthese schon seit lngerem bekannt sind, dienen als Leitstrukuren fr die Synthese von weiteren Wirkstoffen. Die meisten Aminoglycosid-Antibiotika beinhalten Aminozucker, die mit dem rn2-Desoxystreptamin-Gerst verbunden sind. Die stereochemische Vielfalt der Substitutionsstellen fr Amino- und Hydroxylgruppen in diesem Gerst und deren beschrnkte konformative Flexibilitt bieten vielseitige Mglichkeiten, um potenzielle RNA-Liganden so zu gestalten, dass es zu einer spezifischen Erkennung von RNA-Strukturen kommen kann. Ein wichtiger Vertreter dieser Antibiotika, Neomycin B, von dessen Struktur die Entwicklung des Diaminogalactose-Templates abgeleitet wurde, wurde in dieser Arbeit als Leitstruktur gewhlt. Die Synthese von Diaminogalactose-Scaffolds wurde zunchst in Lsung durchgefhrt. Anschlieend wurden die Bausteine 2 und 4 an einen polymeren Trger gebunden.rnNach Prfung der orthogonalen Stabilitt der Schutzgruppen wurde mit den Scaffolds 2 und 4 eine Bibliothek von 65 Verbindungen hergestellt. Mit 42 dieser Verbindungen wurden anschlieend Zellassays im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) durchgefhrt, um ihre Cytotoxizitt zu prfen. Fr einzelne Verbindungen konnten die optimalen Konzentrationen bestimmt werden, bei denen zuknftige Tests fr die Tat/TAR Wechselwirkung ohne strende cytotoxische Effekte durchgefhrt werden knnen.rn
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Aminoglydosid-Antibiotika wie Neomycin B oder Cyclopeptid-Antibiotike wie Viaomycin sind dafr bekannt, da sie selektiv an RNA binden knnen. Diese Interaktionen beruhen sowohl auf elektrostatischen Wechselwirkungen als auch auf H-Brcken-Bindungen. Des weiteren ist die definierte rumliche Anordnung von Donor- und Akzeptor-Resten in den Strukturen der RNA-Liganden wichtig fr die Affinitt. Eine Mglichkeit natrliche RNA-Liganden zu imitieren ist der Einsatz polyfunktioneller Template wie zum Beispiel das 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold. Mit Hilfe dieser Scaffolds knnen dann verschiedene positv geladene Reste und Donatoren sowie Akzeptoren fr H-Brcken-Bindungen oder auch Interkalatoren rumlich definiert prsentiert werden. Fr die unabhngige Funktionalisierung einer jeden Position ist ein Satz orthogonal stabiler Schutzgruppen ntig, wobei eine Hydroxylguppe durch einen Anker ersetzt wird, der eine Anbindung des Scaffolds an einen polymeren Trger ermglicht. Das neu entwickelte 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold ist das erste Monosaccharid-Templat, das in allen fnf Positionen mit orthogonal stabilen Schutzgruppen blockiert ist. Alle Positionen knne in beliebiger Reihenfolge selektiv deblockiert und anschlieend derivatisiert werden. Das Scaffold kann mit Aminosuren, Guanidinen oder Interkalatoren umgesetzt werden, um so natrlich vorkommende RNA-bindende Aminoglycoside oder Peptide zu imitieren. Aufbauend auf diesem Monosaccharid-Templat wurde eine Bibliothek von ber 100 potentiellen RNA-Liganden synthetisiert, die im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) in Zellassays auf ihre Fhigkeit zur Hemmung der Tat/TAR-Wechselwirkung untersucht wurden, wobei bis jetzt 9 Verbindungen mit einer hemmenden Wirkung im micromolaren Bereich gefunden wurden.
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The synthesis of seleno-galactopyranosides in a short and efficient manner is described, starting from the parent carbohydrate D-galactose. The approach described allows the synthesis of small libraries of compounds with a number of structural variations at the group attached to selenium. Compounds with aryl, propargyl, allyl, acyl, and alkyl substituents are described. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
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Two ortho-iodoallyloxybenzoates, methyl 4-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-6-O-(2-iodobenzoyl)- alpha-D-glucopyranoside (3) and methyl 4-O-allyl-2,3-di-O-benzyl-6-O-(2-iodobenzoyl)- alpha-D-galactopyranoside (4) were synthesized in seven conventional steps from methyl alpha-D-glucopyranoside and methyl alpha-D-galactopyranoside, respectively. Bu3SnH-mediated aryl radical cyclization of 3 provided exclusively the hydrogenolysis product 12. The reaction of 4 gave the reduced uncyclized product 13 and only traces of 4A, resulting from 11-endo aryl radical cyclization. In previous papers we described that in similar Bu3SnH-mediated radical reaction of ortho-iodoallyloxybenzamides, analogs of 3 and 4, we obtained macrolactams resulting from 11-endo cyclization. An hypothesis to explain the differences is presented. It was assumed that in the aryl radical formed from iodobenzamides there is a suitable conformation to cyclization, which is stabilized by an intramolecular hydrogen bond.
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Starting from methyl 6-O-allyl-4-azido-2,3-di-O-benzyl-4-deoxy-α-D-galactopyranoside, four new derivatives containing 2-iodobenzamido and 3-(iodoacetamido)benzamido groups were synthesized. These four compounds were submitted to tri-n-butyltin hydride mediated radical cyclization reactions, resulting in two macrolactams from 11- and 15-endo aryl radical cyclization. The corresponding four hydrogenolysis products were also obtained. The structures of the new compounds were elucidated by H and 13C NMR spectroscopy, DEPT, COSY, HMQC and HMBC experiments.
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Under de senaste ren har intresset fr utnyttjandet av frnybara resurser kraftigt kat. I samband med detta utgr kolhydrater en viktig del av den tillgngliga frnybara biomassan och den har drefter blivit freml fr ett stort intresse inom hllbar kemi. Sockeralkoholer r en srskilt viktig grupp av molekyler som vanligtvis erhlls ur kolhydrater och som har mngsidiga tillmpningar som t.ex. lgkalorihaltiga stningsmedel. Forskningen i doktorsarbetet omfattar hydreringen av naturligt frekommande sockerarter L-arabinos, D-galaktos, D-maltos och L-ramnos till respektive sockeralkoholer. Dessa sockeralkoholer kan anvndas bl.a. som hlsosamma stningsmedel p samma stt som xylitol. Grunden fr detta arbete bestr av hydreringsexperiment som utfrdes p en dispergerad ruteniumkatalysator i syfte att studera bildningskinetiken av de motsvarande sockeralkoholerna. Reaktionerna genomfrdes vid temperaturer mellan 90 och 130 C och vtetryck mellan 40 och 60 bar. Under dessa betingelser var det mjligt att stadkomma sockeromvandlingar upp till 100 %. Reaktionshastigheterna modellerades matematiskt. Konkurrerande kinetiska modeller som baserades p Langmuir-Hinshelwood-konceptet freslogs fr att beskriva reaktionerna. Parametrar i hastighetsekvationerna bestmdes drefter genom icke-linjr regression. Dessa modeller kunde vl frutsga hydreringsreaktionernas frlopp och de kan fljaktligen anvndas fr design av industriella anlggningar. Ytterligare hydreringsexperiment med sockerblandningar genomfrdes fr att frdjupa kunskaper i kinetik och reaktionsmekanismer av sockerhydreringen. Studierna genomfrdes med syntetiska sockerblandningar av L-arabinos och D-galaktos (de viktigaste komponenterna i hemicellulosan arabinogalaktan). Fullstndig omsttning uppnddes med utmrkta selektiviteter som verskred 95 % och dessutom inverkade varken temperatur eller vtetryck p reaktionens frlopp p ngot ovntat stt. Antagandet av konkurrerande adsorption fr en samtidig reduktion av bda sockermolekylerna gav en kinetisk modell som noggrant beskrev de experimentella resultaten. Idn om att utforska potentiella stt att pskynda bildningen av sockeralkoholer ledde till utfringen av hydreringsexperiment med L-arabinos och D-galaktos i nrvaro av ultraljud. Det visade sig att ultraljudets inverkan var oberoende av sockerhalten och vtetrycket och att bestrlningen gynnade hydreringen av D-galaktos trots att den inte frhindrade Ru/C-katalysatorns deaktivering verhuvudtaget. En kinetisk modell som beaktade deaktiveringen utvecklades. Kontinuerlig hydrering av L-arabinos genomfrdes med tre olika Ru-katalysatorer p tre olika brare: tyg av aktivt kol, kolnanorr p svampliknande metalliska strukturer samt krossade partiklar av en kommersiell Ru/C-katalysator. Det visade sig att det var mjligt att omvandla L-arabinos till arabitol med hga selektiviteter med hjlp av Ru/koltyg-katalysatorn. Dessa experiment demonstrerade att hydreringen av de valda sockerarterna r en helt genomfrbar rutt till framstllning av fin- och specialkemikalier, som kan frverkligas i strre skala.
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RSUM Le but d'un traitement antimicrobien est d'radiquer une infection bactrienne. Cependant, il est souvent difficile d'en valuer rapidement l'efficacit en utilisant les techniques standard. L'estimation de la viabilit bactrienne par marqueurs molculaires permettrait d'acclrer le processus. Ce travail tudie donc la possibilit d'utiliser le RNA ribosomal (rRNA) cet effet. Des cultures de Streptococcus gordonii sensibles (parent Wt) et tolrants (mutant Tol 1) l'action bactricide de la pnicilline ont t exposes diffrents antibiotiques. La survie bactrienne au cours du temps a t dtermine en comparant deux mthodes. La mthode de rfrence par compte viable a t compare une mthode molculaire consistant amplifier par PCR quantitative en temps rel une partie du gnome bactrien. La cible choisie devait reflter la viabilit cellulaire et par consquent tre synthtise de manire constitutive lors de la vie de la bactrie et tre dtruite rapidement lors de la mort cellulaire. Le choix s'est port sur un fragment du gne 16S-rRNA. Ce travail a permis de valider ce choix en corrlant ce marqueur molculaire la viabilit bactrienne au cours d'un traitement antibiotique bactricide. De manire attendue, les S. gordonii sensibles la pnicilline ont perdu ≥ 4 log10 CFU/ml aprs 48 heures de traitement par pnicilline alors que le mutant tolrant Tol1 en a perdu ≥ 1 log10 CFU/ml. De manire intressant, la quantit de marqueur a augment proportionnellement au compte viable durant la phase de croissance bactrienne. Aprs administration du traitement antibiotique, l'volution du marqueur dpendait de la capacit de la bactrie survivre l'action de l'antibiotique. Stable lors du traitement des souches tolrantes, la quantit de marqueur dtecte diminuait de manire proportionnelle au compte viable lors du traitement des souches sensibles. Cette corrlation s'est confirme lors de l'utilisation d'autres antibiotiques bactricides. En conclusion, l'amplification par PCR du RNA ribosomal 16S permet d'valuer rapidement la viabilit bactrienne au cours d'un traitement antibiotique en vitant le recours la mise en culture dont les rsultats ne sont obtenus qu'aprs plus de 24 heures. Cette mthode offre donc au clinicien une valuation rapide de l'efficacit du traitement, particulirement dans les situations, comme le choc septique, o l'initiation sans dlai d'un traitement efficace est une des conditions essentielles du succs thrapeutique. ABSTRACT Assessing bacterial viability by molecular markers might help accelerate the measurement of antibiotic-induced killing. This study investigated whether ribosomal RNA (rRNA) could be suitable for this purpose. Cultures of penicillin-susceptible and penicillin-tolerant (Tol1 mutant) Streptococcus gordonii were exposed to mechanistically different penicillin and levofloxacin. Bacterial survival was assessed by viable counts, and compared to quantitative real-time PCR amplification of either the 16S-rRNA genes (rDNA) or the 16S rRNA, following reverse transcription. Penicillin-susceptible S. gordonii lost ≥ 4 log10 CFU/ml of viability over 48 h of penicillin treatment. In comparison, the Toll mutant lost ≤ 1 log10 CFU/ml. Amplification of a 427-base fragment of 16S rDNA yielded amplicons that increased proportionally to viable counts during bacterial growth, but did not decrease during drug-induced killing. In contrast, the same 427-base fragment amplified from 16S rDNA paralleled both bacterial growth and drug-induced killing. It also differentiated between penicillin-induced killing of the parent and the Toll mutant (≥4 log10 CFU/ml and ≤1 lo10 CFU/ml, respectively), and detected killing by mechanistically unrelated levofloxacin. Since large fragments of polynucleotides might be degraded faster than smaller fragments the experiments were repeated by amplifying a 119-base region internal to the origina1 427-base fragment. The amount of 119-base amplicons increased proportionally to viability during growth, but remained stable during drug treatment. Thus, 16S rRNA was a marker of antibiotic-induced killing, but the size of the amplified fragment was critical to differentiate between live and dead bacteria.
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We report herein the synthesis of some beta-D-galactopyranosylamine and beta-lactosylamine amides and sulfonamides. The interactions of these compounds with lectins from the seeds of Erythrina cristagalli (LEC) and Ricinus communis (RCA120) were evaluated in a hemagglutination inhibitory activity assay. D-Galactose and lactose were used as reference compounds. The beta-lactosylamine amides and sulfonamides were nearly as active as lactose in inhibiting LEC mediated hemagglutination and were less active against RCA120 agglutinin. The beta-D-galactopyranosylamine amides and sulfonamides were, with one exception, considerably less active than D-galactose in the assay with both lectins.
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The synthesis of two new D-galactose-based dimers having a 1,4-butanediamine spacer is reported aiming at the evaluation of their interaction with the Erythrina cristagalli lectin. The title compounds were prepared in four and five steps from 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranoside bromide, in 20 % and 15 % overall yield, respectively, using the Doebner modification of the Koenavenagel reaction as the key sep. The lectin-carbohydrate interaction could be evaluated for only one dimer, due to solubility problems. A twofold enhancement of affinity was observed, compared to the corresponding monovalent ligand.
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ber die Sekundrstruktur von LI-Cadherin ist bislang wenig bekannt. Es gibt keine Rntgenanalysen und keine NMR-spektroskopische Untersuchungen. Man kann nur aufgrund der Sequenzhomologien zu den bereits untersuchten klassischen Cadherinen vermuten, da im LI-Cadherin hnliche Verhltnisse in der entscheidenden Wechselwirkungsdomne vorliegen. In Analogie zum E-Cadherin wurde angenommen, da es im LI-Cadherin eine homophile Erkennungsregion gibt, die in einer typischen beta-Turn-Struktur mit anschlieenden Faltblattbereichen vorliegen sollte. Um den Einflu verschiedener Saccharid-Antigene auf die Turn-Bildung zu untersuchen, wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit verschiedene Saccharid-Antigen-Bausteine synthetisiert, mit denen dann im zweiten Teil der Arbeit durch sequentielle Festphasensynthese entsprechende Glycopeptidstrukturen aus dieser Region des LI-Cadherins aufgebaut wurden. Zur Synthese smtlicher Antigen-Bausteine ging man von D-Galactose aus, die ber das Galactal und eine Azidonitratisierung in vier Stufen zum Azidobromid umgesetzt wurde. In einer Koenigs-Knorr-Glycosylierung wurde dieses dann auf die Seitenkette eines geschtzten Serin-Derivats bertragen. Reduktion und Schutzgruppenmanipulationen lieferten den TN Antigen-Baustein. Ein TN-Antigen-Derivat war Ausgangspunkt fr die Synthesen der weiteren Glycosyl-Serin-Bausteine. So lie sich mittels der Helferich-Glycosylierung der T Antigen-Baustein herstellen, und der STN-Antigen-Baustein wurde durch eine Sialylierungsreaktion und weitere Schutzgruppenmanipulationen erhalten. Da die Route ber das T-Antigen-Derivat den Hauptsyntheseweg fr die weiteren komplexeren Antigene bildete, wurden verschiedene Schutzgruppenmuster getestet. Darauf aufbauend lieen sich durch verschiede Glycosylierungsreaktionen und Schutzgruppenmanipulationen der komplexe (2->6)-ST-Antigen-Baustein, (2->3)-Sialyl-T- und Glycophorin-Antigen-Baustein synthetisieren. Im nchsten Abschnitt der Doktorarbeit wurden die synthetisierten Saccharid-Antigen-Serin-Konjugate in Festphasen-Glycopeptidsynthesen eingesetzt. Zunchst wurde ein mit dem TN Antigen glycosyliertes Tricosapeptid hergestellt. Mittels NMR-spektroskopischen Untersuchungen und folgenden Energieminimierungsberechnungen konnte eine dreidimensionale Struktur ermittelt werden. Die Peptidsequenz des Turn-bildenden Bereichs wurde fr die folgenden Synthesen gewhlt. Die Abfolge der einzelnen Reaktionsschritte fr die Festphasensynthesen mit den verschiedenen Saccharid-Antigen-Bausteinen war hnlich. Insgesamt verlief die Festphasen-Glycopeptidsynthese in starker Abhngigkeit vom sterischen Anspruch der Saccharid-Bausteine. Smtliche so synthetisierten Glycopeptide wurden NMR spektroskopisch charakterisiert und mittels NOE-Experimenten hinsichtlich ihrer Konformation untersucht. Durch diese Bestimmung der rumlichen Protonen-Protonen-Kontakte konnte mittels Rechnungen zur Energieminimierung, basierend auf MM2 Kraftfeldern, eine dreidimensionale Struktur fr die Glycopeptide postuliert werden. Smtliche synthetisierten Glycopeptide weisen eine schleifenartige Konformation auf. Der Einflu der Saccharid-Antigene ist unterschiedlich, und lt sich in drei Gruppen einteilen.
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Restriction of proteins to discrete subcellular regions is a common mechanism to establish cellular asymmetries and depends on a coordinated program of mRNA localization and translation control. Many processes from the budding of a yeast to the establishment of metazoan embryonic axes and the migration of human neurons, depend on this type of cell polarization. How factors controlling transport and translation assemble to regulate at the same time the movement and translation of transported mRNAs, and whether these mechanisms are conserved across kingdoms is not yet entirely understood. In this review we will focus on some of the best characterized examples of mRNA transport machineries, the "yeast locasome" as an example of RNA transport and translation control in unicellular eukaryotes, and on the Drosophila Bic-D/Egl/Dyn RNA localization machinery as an example of RNA transport in higher eukaryotes. This focus is motivated by the relatively advanced knowledge about the proteins that connect the localizing mRNAs to the transport motors and the many well studied proteins involved in translational control of specific transcripts that are moved by these machineries. We will also discuss whether the core of these RNA transport machineries and factors regulating mRNA localization and translation are conserved across eukaryotes.
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The eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF4A) is a member of the DEA(D/H)-box RNA helicase family, a diverse group of proteins that couples an ATPase activity to RNA binding and unwinding. Previous work has provided the structure of the amino-terminal, ATP-binding domain of eIF4A. Extending those results, we have solved the structure of the carboxyl-terminal domain of eIF4A with data to 1.75 resolution; it has a parallel - topology that superimposes, with minor variations, on the structures and conserved motifs of the equivalent domain in other, distantly related helicases. Using data to 2.8 resolution and molecular replacement with the refined model of the carboxyl-terminal domain, we have completed the structure of full-length eIF4A; it is a dumbbell structure consisting of two compact domains connected by an extended linker. By using the structures of other helicases as a template, compact structures can be modeled for eIF4A that suggest (i) helicase motif IV binds RNA; (ii) Arg-298, which is conserved in the DEA(D/H)-box RNA helicase family but is absent from many other helicases, also binds RNA; and (iii) motifs V and VI link the carboxyl-terminal domain to the amino-terminal domain through interactions with ATP and the DEA(D/H) motif, providing a mechanism for coupling ATP binding and hydrolysis with conformational changes that modulate RNA binding.
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Harmful algal blooms (HABs) are becoming more frequent as climate changes, with tropical species moving northward. Monitoring programs detecting the presence of toxic algae before they bloom are of paramount importance to protect aquatic ecosystems, aquaculture, human health and local economies. Rapid and reliable species identification methods using molecular barcodes coupled to biosensor detection tools have received increasing attention over the past decade as an alternative to the impractical standard microscopic counting-based techniques. This work reports on a PCR amplification-free electrochemical genosensor for the enhanced selective and sensitive detection of RNA from multiple Mediterranean toxic algal species. For a sandwich hybridization (SHA), we designed longer capture and signal probes for more specific target discrimination against a single base-pair mismatch from closely related species and for reproducible signals. We optimized experimental conditions, viz., minimal probe concentration in the SHA on a screen-printed gold electrode and selected the best electrochemical mediator. Probes from 13 Mediterranean dinoflagellate species were tested under optimized conditions and the format further tested for quantification of RNA from environmental samples. We not only enhanced the selectivity and sensitivity of the state-of-the-art toxic algal genosensors but also increased the repertoire of toxic algal biosensors in the Mediterranean, towards an integral and automatic monitoring system.
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Harmful algal blooms (HABs) are becoming more frequent as climate changes, with tropical species moving northward. Monitoring programs detecting the presence of toxic algae before they bloom are of paramount importance to protect aquatic ecosystems, aquaculture, human health and local economies. Rapid and reliable species identification methods using molecular barcodes coupled to biosensor detection tools have received increasing attention over the past decade as an alternative to the impractical standard microscopic counting-based techniques. This work reports on a PCR amplification-free electrochemical genosensor for the enhanced selective and sensitive detection of RNA from multiple Mediterranean toxic algal species. For a sandwich hybridization (SHA), we designed longer capture and signal probes for more specific target discrimination against a single base-pair mismatch from closely related species and for reproducible signals. We optimized experimental conditions, viz., minimal probe concentration in the SHA on a screen-printed gold electrode and selected the best electrochemical mediator. Probes from 13 Mediterranean dinoflagellate species were tested under optimized conditions and the format further tested for quantification of RNA from environmental samples. We not only enhanced the selectivity and sensitivity of the state-of-the-art toxic algal genosensors but also increased the repertoire of toxic algal biosensors in the Mediterranean, towards an integral and automatic monitoring system.
