Síntesis y caracterización de amidas quirales derivadas de la (S)-fenilalanina, evaluación de su actividad antibacteriana in vitro.

Tesis (Maestría en Ciencias con Orientación en Farmacia) UANL, 2011.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Efeito da fenilalanina e da alanina sobre as atividades dos complexos da cadeia respiratória de córtex cerebral de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de fenilalanina (Phe) e seus metabólitos nos tecidos dos pacientes afetados. O dano neurológico é a marca da PKU e a Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. A alanina (Ala) é nutricionalmente um aminoácido não essencial. Ela é o principal aminoácido gliconeogênico porque pode originar piruvato e glicose, tendo sido, por este motivo, usada como um suplemento dietético em combinação com o hormônio de crescimento no tratamento de crianças subnutridas afetadas por algumas doenças metabólicas herdadas, para induzir o anabolismo. O principal objetivo do presente trabalho foi medir as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (CCR) e succinato desidrogenase (SDH) no córtex cerebral de ratos Wistar sujeitos à hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida e à administração crônica de Ala, desde o 6± até o 21± dia de vida pós-natal. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e Ala nas atividades da SDH e CCR em córtex cerebral de ratos de 22 dias de idade. Os resultados mostraram uma redução nas atividades da SDH e complexos I + III no córtex cerebral de ratos sujeitos à HPA e também no córtex cerebral de ratos sujeitos à administração de Ala. Também verificamos que ambos: Phe e Ala inibiram in vitro a atividade dos complexos I + III por competição com NADH. Considerando a importância da SDH e CCR para a sustentação do suprimento energético para o cérebro, nossos resultados sugerem que o déficit energético possa contribuir para a neurotoxicidade da Phe em PKU. Em relação à Ala, ficou evidenciado que mais investigações serão necessárias antes de considerar a suplementação com Ala como uma terapia adjuvante válida para crianças com estas doenças.

Responsividade à tetrahidrobiopterina em pacientes com deficiência de fenilalanina hidroxilase

OBJETIVO: Identificar indivíduos responsivos à tetrahibrobiopterina (BH₄) em uma amostra de pacientes brasileiros com hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina-hidroxilase (HPA-PAH). MÉTODOS: Estudo intervencional, amostragem por conveniência. Para serem incluídos no estudo, os pacientes deveriam: possuir diagnóstico bioquímico de HPA-PAH; ter idade ≥ 7 anos; estar em tratamento dietético; e apresentar níveis de fenilalanina (Phe) ≥ 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. Os níveis de Phe foram determinados por meio de espectrometria de massas in tandem no dia anterior (dia 1) e nos pontos de hora 0, 4 e 8 h (dia 2) e 24 h (dia 3) após ingestão de BH₄. Os critérios utilizados para definir responsividade ao BH₄ foram: critério 1-redução ≥ 30% de Phe após 8 h da administração de BH₄; e critério 2-redução ≥ 30% de Phe após 24 h da administração. RESULTADOS: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo (mediana de idade = 14 anos, sexo masculino = 12). Cinco pacientes foram responsivos ao BH₄, sendo três (forma clássica: um; forma leve: dois) de acordo com ambos os critérios, e dois (forma clássica: um; forma não definida: um) de acordo com o critério 2. Os níveis de Phe plasmáticos do dia 1 não demonstraram variação nos pontos de hora (p = 0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora dos dias 1 e 2, encontramos uma variação significativa (p = 0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo confirmou o caráter multifatorial da responsividade ao BH₄. CONCLUSÃO: Os nossos achados estão de acordo com a literatura e indicam que um número relevante de pacientes brasileiros com HPA-PAH é responsivo à BH₄.

Study of oxidation and non-enzymatic glycosylation posttranslational modifications using a proteomic approach

A glicosilação não-enzimática e o stress oxidativo representam dois processos importantes visto desempenharem um papel importante no que respeita às complicações de vários processos patofisiológicos. No presente, a associação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação de proteínas é reconhecida como sendo um dos principais responsáveis pela acumulação de proteínas não-funcionais que, por sua vez, promove uma contínua sensibilização para um aumento do stress oxidativo ao nível celular. Embora esteja disponível bastante informação no que respeita aos dois processos e suas consequências ao nível estrutural e funcional, permanecem questões por esclarecer acerca do que se desenvolve ao nível molecular. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação, proteínas modelo (albumina, insulina e histonas H2B e H1) foram submetidas a sistemas in vitro de glicosilação não-enzimática e oxidação em condições controladas e durante um período de tempo específico. A identificação dos locais de glicosilação e oxidação foi realizada através de uma abordagem proteómica, na qual após digestão enzimática se procedeu à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF). Esta abordagem permitiu a obtenção de elevadas taxas de cobertura das sequências proteicas, permitindo a identificação dos locais preferenciais de glicosilação e oxidação nas diferentes proteínas estudadas. Como esperado, os resíduos de lisina foram os preferencialmente glicosilados. No que respeita à oxidação, além das modificações envolvendo hidroxilações e adições de oxigénio, foram identificadas deamidações, carbamilações e conversões oxidativas específicas de vários aminoácidos. No geral, os resíduos mais afectados pela oxidação foram os resíduos de cisteína, metionina, triptofano, tirosina, prolina, lisina e fenilalanina. Ao longo do período de tempo estudado, os resultados indicaram que a oxidação teve início em zonas expostas da proteína e/ou localizadas na vizinhança de resíduos de cisteína e metionina, ao invés de exibir um comportamente aleatório, ocorrendo de uma forma nãolinear por sua vez dependente da estabilidade conformacional da proteína. O estudo ao longo do tempo mostrou igualmente que, no caso das proteínas préglicosiladas, a oxidação das mesmas ocorreu de forma mais rápida e acentuada, sugerindo que as alterações estruturais induzidas pela glicosilação promovem um estado pro-oxidativo. No caso das proteínas pré-glicosiladas e oxidadas, foi identificado um maior número de modificações oxidativas assim como de resíduos modificados na vizinhança de resíduos glicosilados. Com esta abordagem é realizada uma importante contribuição na investigação das consequências do dano ‘glico-oxidativo’ em proteínas ao nível molecular através da combinação da espectrometria de massa e da bioinformática.

Chemical communication in the Mozambique tilapia: a role for amino acids

The Mozambique tilapia (Oreochromis mossambicus) is a maternal mouthbrooding cichlid from the southern Africa. The olfactory sensitivity of the species to 20 amino acids was assessed using the electro-olfactogram (EOG). We estimated whether the olfactory potency of the polar fraction of male urine can be explained by the presence of identified amino acids. In addition, filtrate and amino acid mixture of the urine of Nile tilapia were used to estimate their olfactory potency for O.mossambicus. Finally, concentrations of the main amino acids were measured in the urine of males of different social status and the correlations between amino acid concentration and hierarchical status were explored. L-cysteine, L-glutamine and L-threonine were the most potent stimuli at M while L-proline and L-aspartate were the least potent. Four groups of amino acids were identified according to their thresholds of detection and three groups – according to the similarity of their ɣ-factors. The estimated threshold of detection for O.mossambicus mixture was higher than that for the filtrate. On the contrary, the threshold of detection for the mixture of Nile tilapia was lower than that for the filtrate The concentration of L-arginine in the urine was positively correlated with fish dominance index. Both L-arginine and L-glutamic acid concentrations had much greater variability in dominant males (DI˃0.5) than in subordinate males (DI˂0.5). The urinary concentrations of L-phenylalanine had similar variability in dominant and subordinate groups. The Mozambique tilapia has olfactory sensitivity to all twenty amino acids tested. The fish showed more acute sensitivity to conspecific urine filtrate than to the heterospecific. Olfactory potency of O.mossambicus filtrate can be largely but not fully explained by the presence of L-arginine, L-glutamic acid and L-phenylalanine. Larginine and L-glutamic acid may indicate the dominance status of the fish and, possibly, individual identity.

Boronic acids as partners in multicomponent reactions

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Analysis of RNA-seq data from the interaction of Coffea spp. - Colletotrichum kahawae

Tese de mestrado em Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014

Aproximacions a la síntesi estereoselectiva de noves heteroarilglicines

L'objectiu principal de la present tesi doctoral ha consistit fonamentalment en la síntesi de noves heteroarilglicines òpticament pures. Amb aquesta idea s'han desenvolupat dues estratègies diferents: síntesi estereoselectiva utilitzant auxiliars quirals i síntesi estereocontrolada utilitzant aldehids quirals derivats d' L-serina com a "building-blocks". Així doncs, per a la primera estratègia s'han dissenyat i sintetitzat els dos nous auxiliars quirals del tipus imidazolidin-2-ona 111 i 135 utilitzant L-fenilalanina i L-serina respectivament com a materials de partida òpticament purs. Davant els problemes detectats en la síntesi d'a-aminoàdics mitjançant síntesi asimètric, s'ha canviat d'estratègia i s'ha utilitzat una síntesi estereocontrolada utilitzant aldehids quirals obtinguts a partir d'L-serina.

Pèptids biarílics a partir de 4-iodofenilalanina o 3-iodotirosina per borilació i reacció de Suzuki-Miyaura en fase sòlida. Avaluació de l'activitat antimicrobiana

En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació de pèptids biarílics en fase sòlida. En primer lloc, es varen borilar residus de fenilalanina o tirosina presents a la seqüència peptídica a través d’una reacció de Miyaura. A continuació, es varen arilar els boronats resultants a través d’una reacció de Suzuki-Miyaura sota irradiació de microones, utilitzant diversos halurs d’aril i haloaminoàcids. La metodologia trobada es va estendre a la preparació de pèptids biarílics cíclics. Aquesta aproximació presenta l’avantatge d’evitar la síntesi en dissolució i la purificació del boronoaminoàcid. A més, permet la preparació d’una àmplia diversitat de pèptids biarílics a partir d’un únic boronopèptid. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront dels bacteris Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, i Pseudomonas syringae, que són responsables de malalties greus en plantes d’interès econòmic com pereres i pomeres, i que varen resultar ser molt poc tòxics enfront cèl•lules eucariotes.

Síntesi, caracterització química i estudi de l'activitat biològica de nous complexos de Pt(II) amb lligands de tipus diaminocarboxílic i els respectius ésters i derivats peptídics

El cisplatí, PtCl2(NH3)2, ha estat una de les drogues més utilitzades en la quimioteràpia del càncer des del descobriment de la seva activitat. Però degut a la seva alta toxicitat i greus efectes secundaris, s'han sintetitzat nous compostos amb la finalitat de reduir aquests inconvenients. En aquest sentit, el treball desenvolupat en aquesta tesi doctoral ha estat la síntesi i caracterització de tretze complexos de Pt(II) amb la finalitat d'estudiar llur activitat antitumoral. Aquests complexos presenten unes característiques estructurals comunes: geometria cis, dos lligands làbils de tipus clorur i un lligand diaminoquelatant derivat dels àcids d,l-2,3-diaminopropiònic (Hdap) i d,l-2,4-diaminobutíric (Hdab). S'han dissenyat unes estratègies sintètiques a partir de les quals els lligands han estat funcionalitzats amb diferents grups de tipus éster, aminoàcid i peptídic: Etdap·2HCl, Etdab·2HCl, [(dap-Metala)·2CF3COOH], [(dab-Metala)·2CF3COOH], [(dap-phe)·2CF3COOH], [(dab-phe)·2CF3COOH], [(dap-Mettrp)·2CF3COOH], [(dab-Mettrp)·2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)·2CF3COOH], essent Metala= éster metílic de L-alanina, phe= L-fenilalanina, Mettrp= éster metílic del L-triptofà. Aquests lligands diaminoquelatants s'han utilitzat per sintetitzar els corresponents complexos de Pt(II): PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2). A través de diferents tècniques i assaigs biològics (dicroisme circular, electroforesi en gel d'agarosa, microscopia de forces atòmiques, citometria de flux, assaigs de proliferació cel·lular) s'ha pogut demostrar l'activitat antitumoral d'aquests compostos. A través de la tècnica de dicroisme circular (DC) s'ha pogut demostrar que els lligands lliures no interaccionen covalentment amb el DNA de Calf Thymus i no modifiquen l'estructura secundària de la doble hèlix. En canvi, els respectius complexos han demostrat tenir capacitat per interaccionar amb el DNA i modificar la seva estructura secundària. Els complexos PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) i PtCl2(dab-phe) mostren un comportament similar al cisplatí, generant adductes cis-bifuncionals que distorcionen la doble hèlix de forma no desnaturalitzant amb obertura de la doble cadena. Els complexos PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) quan interaccionen amb el DNA generen un canvi en la conformació del DNA de la forma B a la forma C, produint-se un augment de la curvatura de l'hèlix per rotació de les bases nitrogenades. En aquests estudis s'ha comprovat que l'estructura del complex influeix en l'efecte generat sobre l'estructura secundària de l'àcid nucleic. En primer lloc, existeix una diferència en el comportament en funció del tamany del lligand diaminoquelatant, de manera que els complexos amb el lligand (dab) provoquen un efecte més remarcable. També s'observa aquest canvi de comportament al passar dels complexos que tenen el grup funcional esterificat als que el tenen protonat. D'aquesta manera, s'observa un major efecte sobre l'estructura secundària del DNA en aquells complexos que tenen el lligand diaminoquelatant de tres metilens (dab) i amb el grup carboxilat terminal protonat. Per tal de modelitzar la interacció d'aquests complexos amb el DNA, s'ha estudiat la interacció d'aquests compostos de Pt(II) amb 5'-GMP a través de RMN-1H, observant la variació dels senyals corresponents al H8 de 5'-GMP. Així s'ha pogut demostrar que aquests compostos interaccionen amb la 5'-GMP a través d'un enllaç covalent Pt-N7, de la mateixa manera a com interacciona el cisplatí. A través d'electroforesi en gel d'agarosa i microscopia de forces atòmiques (AFM) s'ha pogut determinar l'efecte que generen els lligands lliures i els respectius complexos de Pt(II) sobre l'estructura terciària del plasmidi pBR322. Els lligands provoquen un augment de l'agregació de les molècules de DNA i un lleuger augment de la compactació de l'estructura terciària. Aquests resultats s'atribueixen a la capacitat d'aquests compostos a interaccionar per pont d'hidrogen amb el DNA. Els corresponents complexos de Pt(II) provoquen un augment de l'agregació i una important compactació, degut per una banda a la capacitat de l'àtom de Pt a interaccionar covalentment amb el DNA, i per altra banda, a la capacitat del lligand a interaccionar per pont d'hidrogen amb l'àcid nucleic. Finalment s'ha estudiat l'activitat citotòxica d'aquests complexos de Pt(II) en diferents línies cel·lulars: A431 (línia de carcinoma epidermoide), HeLa (línia de carcinoma de coll d'úter) i HL-60 (línia promielocítica de leucèmia). Els complexos moderadament solubles en aigua, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), han demostrat ser actius. L'activitat depèn de la concentració de complex, del temps d'incubació i de la línia cel·lular. Per temps d'incubació alts i concentracions de complex elevades s'observa la màxima activitat. Els complexos de l'alanina, PtCl2(dap-ala) i PtCl2(dab-ala), són els que mostren més activitat, mentre que els compostos de la fenilalanina són els menys actius, degut probablement a la voluminositat del lligand, la qual pot impedir o dificultar el transport del compost a través de la membrana cel·lular. L'activitat citotòxica dels complexos insolubles en aigua, PtCl2(Etdap) i PtCl2(Etdab), queda bloquejada per l'elevada concentració de DMSO (12%) necessària per solubilitzar els compostos. Aquests resultats permeten deduir que la presència d'un 12% de DMSO anul·la l'activitat d'aquests complexos, ja que el DMSO pot coordinar-se amb el Pt ocupant les posicions làbils del complex i evitant que es pugui coordinar amb el DNA. Els assaigs de proliferació cel·lular del complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) i del pèptid lliure ASTTTNYT-NH2 han demostrat que ambdós compostos són actius. Tot i això, l'activitat del complex és superior a la del pèptid lliure, ja que el Pt pot interaccionar covalentment amb el DNA i augmentar l'efecte citotòxic. Per tant, el complex presenta un lligand portador biològicament actiu que pot transportar el metall a través de la membrana cel·lular i facilitar així la seva interacció amb el DNA. A través de la tècnica de citometria de flux s'ha comprovat que en tots els casos la mort cel·lular produïda pels complexos ha estat per apoptosi. Per últim, s'ha sintetitzat i caracteritzat un complex trinuclear de Pt(II), {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2}, essent Me2Bpy= 4,4'-dimetil-2,2'-dipiridil. La resolució de la seva estructura per difracció de Raig-X ha permès determinar l'existència d'una interacció intramolecular Pt-Pt de 3.474 Å.

Mechanism of action of cyclic antimicrobial peptides

This PhD thesis is the result of the combination of experimental and computational techniques with the aim of understanding the mechanism of action of de novo cyclic decapeptides with high antimicrobial activity. By experimental techniques the influence of the replacement of the phenylalanine for tryptophan residue in their antimicrobial activity was tested and the stability in human serum was also analyzed, in order to evaluate their potential therapeutic application as antitumor agents. On the other hand, the interaction amongst the peptide BPC194 c(KKLKKFKKLQ), the best candidate from the whole library of cyclic peptides, and a model anionic membrane was simulated. The results showed a structure-function relationship derived from the stable conformation of the peptides involved in the membrane permeabilization. As a result, a rational design was performed being BPC490 the peptide with best antimicrobial activity compared with the best active peptide from the original library.

Avaliação epidemiológica da triagem neonatal para fenilcetonúria no Rio Grande do Sul - 1986-2003 : um estudo de coorte

A fenilcetonúria clássica (PKU), que afeta 1: 10.000 nascimentos em populações caucasianas, é um erro inato do metabolismo determinado pela deficiência da enzima hepática fenilalaninahidroxilase (PAH), com o conseqüente bloqueio na conversão de fenilalanina (Phe) em Tirosina (Tyr) e aumento da concentração plasmática de Phe. A PKU foi descrita há 70 anos pelo médico norueguês Asbjörn Folling. Desde então muitas foram as descobertas a seu respeito, como a caracterização e mapeamento do seu gene, a identificação de mutações, a determinação da estrutura da enzima, características clínicas e bioquímicas dos afetados, correlações genótipo-fenótipo, a identificação do risco teratogênico quando da condição materna, o estabelecimento da triagem neonatal e ainda o seu tratamento. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a PKU causa retardo mental, microcefalia, espasmos infantis, odor de rato na urina e hipopigmentação de pele, cabelos e olhos, além de outros sinais e sintomas. Com o objetivo de identificar a população submetida à triagem neonatal no Rio Grande do Sul (Brasil), a incidência de Fenilcetonúria e de outras hiperfenilalaninemias e correlacionar época do diagnóstico, início do tratamento e desfecho clínico, elaborou-se este estudo delineado como uma coorte ambispectiva que avaliou 54 pacientes fenilcetonúricos entre 6 meses a 16 anos de idade. Foram realizadas entrevistas telefônicas com os responsáveis indagando-se alguns dados demográficos e outros relativos à patologia. Crianças de 6 meses a 7 anos foram avaliadas com relação aos marcos do DNPM. Acima dessa idade, foram investigados sobre escolaridade e presença de sintomas neurológicos. Após análise estatística e estratificação da amostra por ano de nascimento, não se observou uma tendência histórica do diagnóstico ter se tornado mais precoce ou de o controle laboratorial ter se tornado melhor com o passar dos anos. Foi encontrada associação entre o controle de Phe e a cognição, mas não a entre a idade do diagnóstico e a evolução clínica.

Efeito de aminoácidos acumulados na felilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose sobre a atividade da piruvatoquinase em córtex cerebral de ratos

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.