Mécanismes de transcription par l'ARN polymérase II : étude structure-fonction du site catalytique et rôles des facteurs de transcription TFIIA, TFIIE et TFIIF

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mécanismes de transcription par l'ARN polymérase II : étude structure-fonction du site catalytique et rôles des facteurs de transcription TFIIA, TFIIE et TFIIF

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription.

Analyse des complexes protéiques interagissant avec la machinerie de l'ARN polymérase II dans les cellules humaines

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La machinerie transcriptionnelle basale : étude de son organisation moléculaire au promoteur génique et de ses interactions avec les régulateurs XAB1 et DDX5

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude fonctionnelle des domaines structuraux des sous-unités catalytiques de l'ARN polymérase II humaine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La machinerie transcriptionnelle basale : étude de son organisation moléculaire au promoteur génique et de ses interactions avec les régulateurs XAB1 et DDX5

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude fonctionnelle des domaines structuraux des sous-unités catalytiques de l'ARN polymérase II humaine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

Taux d‘inscription, de rétention et de décrochage dans le programme de gestion du tourisme

Abstract : This paper examines the factors motivating students to enrol in the Tourism Management program at Champlain College, St-Lambert and why a large number of students abandon the program before obtaining their DEC. There is a great deal of literature on student attrition, however there is little consensus on why students withdraw from college programs and the results cannot be easily generalized to this particular set of students at this time. Understanding the factors that influenced the students to choose Tourism Management at Champlain, St-Lambert and why they then leave before completing the six semesters will help with student success and with the marketing of the program. The theoretical framework guiding the study is metacognition, a branch of cognitive psychology that deals with the awareness and understanding of one’s thinking processes. Through a survey, students were asked to rank the general and specific factors that influenced their choice of Tourism Management as a program of study. Exit interviews were carried out with students who abandoned the program within the first year of study to determine the reasons for dropping out. Students who persisted in the program wrote journals describing their first year experience in order to identify any differences in metacognitive abilities with those who abandoned the program. The academic records of all students were also analyzed. The major factors influencing students to choose the Tourism Management program were interest in travel and job opportunities available after graduating. The results from the exit interviews and journals also showed that interest in travel was the primary reason for enrolment. The knowledge that students had of Cegep and the Tourism Management program before enroling however was negligible, particularly among the group that abandoned the program within the first year of study. The analyses of the academic records of the 2007 incoming students showed that the students with the lower high school grades were more likely to abandon the Tourism Management program than those with higher grades. The same is true for first semester and second semester Cegep grades. The major reason why the students abandoned the program during the 2007/2008 academic year was a lack of interest or a dislike of the program, followed by financial difficulties. It is not clear however what the lack of interest can be attributed to and this may be an avenue for future research. As opposed to the students who persisted in the program, those who abandoned their studies had unrealistic expectations of the academic requirements, were unprepared for the workload, had more difficulty analyzing their own performance and had not set concrete goals for themselves. The study shows several problem areas within the program. Of main concern is the lack of knowledge that students have of Cegep life and the Tourism Management program in general and the lack of preparation for Cegep level courses. The scheduling of courses and teaching methods within the program are other areas that need to be addressed. The paper concludes with a set of recommendations to possibly help remedy some of the problems.||Résumé : Ce travail s’intéresse aux facteurs qui motivent les étudiants à s’inscrire au programme de tourisme offert au Collège Champlain de St-Lambert. Il cherche à établir les raisons qui font en sorte qu’un si grand nombre d’étudiants abandonnent le programme avant d’obtenir leur DEC. Plusieurs recherches ont été effectuées sur l’abandon scolaire, mais il n’y a pas de consensus quant aux raisons pour lesquelles les étudiants se retirent du programme collégial. Actuellement, il est difficile d’établir des liens entre les résultats de ces recherches et ce groupe d’étudiants. La compréhension des facteurs qui influencent les étudiants à choisir le tourisme au Collège Champlain et les raisons qui font en sorte qu’ils quittent avant d’avoir complété leur formation, nous permettront d’améliorer le taux de rétention des étudiants dans ce programme. De plus, cela favorisera le marketing du programme. Le cadre théorique de cette recherche est la métacognition, une composante importante de la psychologie cognitive qui examine la connaissance et le contrôle qu’une personne a sur sa façon de penser. La métacognition est une variable qui différencie les étudiants qui réussissent de ceux qui abandonnent (Tardif 1997). La méthodologie de cette recherche comprend : un sondage, des entrevues, des comptes-rendus sous forme de journal et une analyse des résultats scolaires. Le sondage fut complété par tous les étudiants qui ont commencé le programme en tourisme en août 2007. Ce sondage avait pour but d’établir les facteurs qui ont motivé les étudiants à choisir cette discipline. Ceux-ci étaient divisés en deux volets soient : les facteurs généraux et les facteurs spécifiques. Les facteurs généraux comprennent l’intérêt pour les voyages et les informations obtenues auprès des orienteurs, des enseignants, de la publicité faite par les cégeps, des parents et des amis. Les facteurs spécifiques incluent les différents cours offerts tels que la géographie, l’informatique, l’administration, le programme de voyages, le stage en milieu de travail, la réputation du programme et de ses professeurs. Les entrevues ont été effectuées auprès de sept étudiants qui ont abandonné le programme entre décembre 2007 et juin 2008. Le but de ces entrevues était de déterminer les raisons de ces abandons. Les étudiants qui ont poursuivi leur formation en tourisme ont rédigé un journal dans lequel ils décrivaient leur expérience tout au long de leur première année d’études. Dans ce journal, ils devaient répondre à sept questions qui avaient pour but de déterminer les différences entre leurs habiletés métacognitives et celles de ceux qui se sont retirés du programme. L’analyse des dossiers des étudiants tenait compte des résultats scolaires du secondaire ainsi que des résultats académiques de la première année de cégep. Les principaux facteurs qui ont motivé les étudiants à choisir le programme gestion du tourisme étaient l’intérêt pour les voyages et les opportunités d’emploi après l’obtention de leur DEC. La connaissance que les étudiants ont du cégep et du programme de gestion du tourisme avant de s’inscrire était toutefois négligeable, particulièrement parmi le groupe qui a abandonné le programme durant la première année d’études. L’analyse des résultats académiques des étudiants a démontré que les candidats ayant des notes inférieures à l’école secondaire sont plus susceptibles d’abandonner le programme de gestion du tourisme que ceux ayant des notes supérieures. L’analyse arrive aux mêmes conclusions en ce qui concerne les candidats qui ont obtenu de faibles résultats académiques lors de la première et de la deuxième session du cégep. Les raisons principales qui ont fait en sorte que les étudiants ont abandonné le programme durant l’année académique 2007-2008 étaient le manque d’intérêt pour le programme et les difficultés financières. Par ailleurs, nous ne pouvons établir de façon générale les causes de ce manque d’intérêt. Cela pourrait faire l’objet d’une recherche ultérieure. Par opposition aux étudiants qui ont poursuivi le programme, ceux qui ont abandonné leurs études avaient des attentes irréalistes en ce qui a trait aux exigences académiques, ils n’étaient pas préparés pour la charge de travail, ils avaient plus de difficultés à analyser leur propre performance et ils ne s’étaient pas fixé d’objectifs concrets. L’étude a identifié plusieurs secteurs problématiques à l’intérieur du programme. L’une des problématiques principales est le manque de connaissance que les étudiants ont de la vie au cégep et du programme de tourisme en général sans compter le manque de préparation pour des cours de niveau cégep. L’horaire des cours et les méthodes d’enseignement à l’intérieur du programme sont d’autres éléments qui méritent d’être revus. Les limites de cette recherche comprennent le nombre restreint d’étudiants qui ont accepté d’être interviewés et l’effet d’intervieweur. Étant donné que l’intervieweur était le professeur des étudiants et malgré le fait que ceux-ci n’étudient plus en gestion du tourisme, ils peuvent se sentir obligés de répondre à l’intervieweur de façon subjective. Les recherches futures pourront inclure un plus grand nombre d’entrevues menées par des intervieweurs expérimentés n’ayant eu au préalable aucun contact avec les étudiants et ce dans le but de favoriser une plus grande objectivité. Un autre domaine de recherche pourrait être l’analyse du fait que des étudiants très intéressés par les voyages finissent par se désintéresser complètement du programme. Enfin et possiblement l’un des facteurs qui nous semble des plus importants est le besoin pour les étudiants du secondaire d’en connaître plus sur la vie au cégep et sur le programme de gestion du tourisme. Le document se termine par un ensemble de recommandations pour le Collège, le programme et les professeurs pour éventuellement aider à remédier aux problèmes identifiés.

Les facteurs de transcription du groupe PEA3: Régulateurs transcriptionnels dans le processus de cancérisation

Erm, Er81, and Pea3 are the three members of the PEA3 group which belong to the Ets transcription factors family. These proteins regulate transcription of multiple target genes, such as those encoding several matrix metalloproteinases (MMP), which are enzymes degrading the extracellular matrix during cancer metastasis. In fact, PEA3-group genes are often overexpressed in different types of human cancers that also over-express these MMP and display a disseminating phenotype. In experimental models, regulation of PEA3 group member expression has been shown to influence the metastatic process, thus suggesting that these factors play a key role in metastasis. © John Libbey Eurotext.

Régulation de l’expression du gène Six6 par les facteurs de transcription Lhx2 et Pax6 dans le contexte des cellules souches rétiniennes

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives.

Développement d’outils pour l’analyse de données de ChIP-seq et l’identification des facteurs de transcription

La méthode ChIP-seq est une technologie combinant la technique de chromatine immunoprecipitation avec le séquençage haut-débit et permettant l’analyse in vivo des facteurs de transcription à grande échelle. Le traitement des grandes quantités de données ainsi générées nécessite des moyens informatiques performants et de nombreux outils ont vu le jour récemment. Reste cependant que cette multiplication des logiciels réalisant chacun une étape de l’analyse engendre des problèmes de compatibilité et complique les analyses. Il existe ainsi un besoin important pour une suite de logiciels performante et flexible permettant l’identification des motifs. Nous proposons ici un ensemble complet d’analyse de données ChIP-seq disponible librement dans R et composé de trois modules PICS, rGADEM et MotIV. A travers l’analyse de quatre jeux de données des facteurs de transcription CTCF, STAT1, FOXA1 et ER nous avons démontré l’efficacité de notre ensemble d’analyse et mis en avant les fonctionnalités novatrices de celui-ci, notamment concernant le traitement des résultats par MotIV conduisant à la découverte de motifs non détectés par les autres algorithmes.

Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

Modélisation de réseaux d'interactions des microARN et analyse et validation expérimentale de leurs boucles minimales avec des facteurs de transcription

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui répriment la traduction de leurs gènes cibles par hybridation à leur ARN messager (ARNm). L'identification de cibles biologiquement actives de miARN est cruciale afin de mieux comprendre leurs rôles. Ce problème est cependant difficile parce que leurs sites ne sont définis que par sept nucléotides. Dans cette thèse je montre qu'il est possible de modéliser certains aspects des miARN afin d'identifier leurs cibles biologiquement actives à travers deux modélisations d'un aspect des miARN. La première modélisation s'intéresse aux aspects de la régulation des miARN par l'identification de boucles de régulation entre des miARN et des facteurs de transcription (FT). Cette modélisation a permis, notamment, d'identifier plus de 700 boucles de régulation miARN/FT, conservées entre l'humain et la souris. Les résultats de cette modélisation ont permis, en particulier, d'identifier deux boucles d'auto-régulation entre LMO2 et les miARN miR-223 et miR-363. Des expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs hématopoïétiques ont ensuite permis d'assigner à ces deux miARN un rôle dans la détermination du destin cellulaire hématopoïétique. La deuxième modélisation s'intéresse directement aux interactions des miARN avec les ARNm afin de déterminer les cibles des miARN. Ces travaux ont permis la mise au point d'une méthode simple de prédiction de cibles de miARN dont les performances sont meilleures que les outils courant. Cette modélisation a aussi permis de mettre en lumière certaines conséquences insoupçonnées de l'effet des miARN, telle que la spécificité des cibles de miARN au contexte cellulaire et l'effet de saturation de certains ARNm par les miARN. Cette méthode peut également être utilisée pour identifier des ARNm dont la surexpression fait augmenter un autre ARNm par l'entremise de miARN partagés et dont les effets sur les ARNm non ciblés seraient minimaux.