Etude de l'activation et de l'inactivation pH-dépendantes des canaux ASICs (Acide-Sensing Ion Channels)

RESUME: Etude de l'activation et de l'inactivation pH-dépendantes des canaux ASICs (Acid-Sensing Ion Channels) Benoîte BARGETON, Département de Pharmacologie et de Toxicologie, Université de Lausanne, rue du Bugnon 27, CH-1005 Lausanne, Suisse Les canaux sodiques ASICs (Acid-Sensing Ion Channels) participent à la signalisation neuronale dans les systèmes nerveux périphérique et central. Ces canaux non voltage dépendants sont impliqués dans l'apprentissage, l'expression de la peur, la neurodégénération consécutive à une attaque cérébrale et la douleur. Les bases moléculaires sous-tendant leur activité ne sont pas encore totalement comprises. Ces canaux sont activés par une acidification du milieu extracellulaire et régulés, entre autres, par des ions tels que le Ca2+, le Zn2+ et le CI". La cristallisation de ASIC inactivé a été publiée. Le canal est un trimére de sous-unités identiques ou homologues. Chaque sous-unité a été décrite en analogie à un avant bras, un poignet et une main constituée d'un pouce, d'un doigt, d'une articulation, une boule β et une paume. Nous avons appliqué une approche bioinformatique systématique pour identifier les pH senseurs putatifs de ASICIa. Le rôle des pH senseurs putatifs a été testé par mutagénèse dirigée et des modifications chimiques combinées à une analyse fonctionnelle afin de comprendre comment les variations de ρ H ouvrent ces canaux. Les pH senseurs sont des acides aspartiques et glutamiques éparpillés sur la boucle extracellulaire suggérant que les changements de pH contrôlent l'activation et l'inactivation de ASIC en (dé)protonant ces résidus en divers endroits de la protéine. Par exemple lors de l'activation, la protonation des résidus à l'interface entre le pouce, la boule β et le doigt d'une même sous-unité induit un mouvement du pouce vers la bouie β et le doigt. De même lors de l'inactivation du canal les paumes des trois sous-unités formant une cavité se rapprochent. D'après notre approche bioinformatique, aucune histidine n'est impliquée dans la détection des variations de pH extracellulaire c'est-à-dire qu'aucune histidine ne serait un pH-senseur. Deux histidines de ASIC2a lient le Zn2+ et modifient l'affinité apparente du canal pour les protons. Une seule des deux est conservée parmi tous les ASICs, hASICIa H163. Elle forme un réseau de liaison hydrogène avec ses voisins conservés. L'étude détaillée de ce domaine, Pinterzone, montre son importance dans l'expression fonctionnelle des canaux. La perturbation de ce réseau par l'introduction d'un résidu hydrophobe (cystéine) par mutagénèse dirigée diminue l'expression du canal à la membrane plasmique. La modification des cystéines introduites par des réactifs spécifiques aux groupements sulfhydryle inhibe les canaux mutés en diminuant leur probabilité d'ouverture. Ces travaux décrivent les effets de l'acidification du milieu extracellulaire sur les canaux ASICs. ABSTRACT: Study of pH-dependent activation and inactivation of ASIC channels Benoîte BARGETON, Department of Pharmacology and Toxicology, University of Lausanne, Rue du Bugnon 27, CH-1G05 Lausanne, Switzerland The ASIC (Acid-Sensing Ion Channels) sodium channels are involved in neuronal signaling in the central and peripheral nervous system. These non-voltage-gated channels are involved in learning, the expression of fear, neurodegeneration after ischemia and pain sensation. The molecular bases underlying their activity are not yet fully understood. ASICs are activated by extracellular acidification and regulated, eg by ions such as Ca2+, the Zn2+ and CI". The crystallization of inactivated ASIC has been published. The channel is a trimer of identical or homologous subunits. Each subunit has been described in analogy to a forearm, wrist and hand consisting of a thumb, a finger, a knuckle, a β-ball and a palm. We applied a systematic computational approach to identify putative pH sensor(s) of ASICIa. The role of putative pH sensors has been tested by site-directed mutagenesis and chemical modification combined with functional analysis in order to understand how changes in pH open these channels. The pH sensors are aspartic and glutamic acids distributed throughout the extracellular loop, suggesting that changes in pH control activation and inactivation of ASIC by protonation / deprotonation of many residues in different parts of the protein. During activation the protonation of various residues at the interface between the finger, the thumb and the β-ball induces the movement of the thumb toward the finger and the β-ball. During inactivation of the channel the palms of the three subunits forming a cavity approach each other. No histidine has been shown to be involved in extracellular pH changes detection, i.e. no histidine is a pH- sensor. Two histidines of ASIC2 bind Zn2+ and alter the apparent affinity of channel for protons. Only one of the two His is conserved among all ASICs, hASICIa H163. This residue is part of a network of hydrogen bonding with its conserved neighbors. The detailed study of this area, the interzone, shows its importance in the functional expression of ASICs. Disturbance of this network by the introduction of hydrophobic residues decreases the cell surface channel expression. Chemical modification of the introduced cysteines by thiol reactive compounds inhibits the mutated channels by a reduction of their open probability. These studies describe the effects of extracellular acidification on ASICs. RESUME GRAND PUBLIC: Etude de l'activation et de l'inactivation pH-dépendantes des canaux ASICs (Acid-Sensing Ion Channels) Benoîte BARGETON, Département de Pharmacologie et de Toxicologie, Université de Lausanne, rue du Bugnon 27, CH-1005 Lausanne, Suisse La transmission synaptique est un processus chimique entre deux neurones impliquant des neurotransmetteurs et leurs récepteurs. Un dysfonctionnement de certains types de synapses est à l'origine de beaucoup de troubles nerveux, tels que certaine forme d'épilepsie et de l'attention. Les récepteurs des neurotransmetteurs sont de très bonnes cibles thérapeutiques dans de nombreuses neuropathologies. Les canaux ASICs sont impliqués dans la neurodégénération consécutive à une attaque cérébrale et les bloquer pourraient permettre aux patients d'avoir moins de séquelles. Les canaux ASICs sont des détecteurs de l'acidité qui apparaît lors de situations pathologiques comme l'ischémie et l'inflammation. Ces canaux sont également impliqués dans des douleurs. Cibler spécifiquement ces canaux permettrait d'avoir de nouveaux outils thérapeutiques car à l'heure actuelle l'inhibiteur de choix, l'amiloride, bloque beaucoup d'autres canaux empêchant son utilisation pour bloquer les ASICs. C'est pourquoi il faut connaître et comprendre les bases moléculaires du fonctionnement de ces récepteurs. Les ASICs formés de trois sous-unités détectent les variations de l'acidité puis s'ouvrent transitoirement pour laisser entrer des ions chargés positivement dans la cellule ce qui active la signalisation neuronale. Afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité des ASICs nous avons déterminé les sites de liaison des protons (pH-senseurs), ligands naturels des ASICs et décrit une zone importante pour l'expression fonctionnelle de ces canaux. Grâce à une validation systématique de résultats obtenus en collaboration avec l'Institut Suisse de Bioinformatique, nous avons décrit les pH-senseurs de ASICIa. Ces résultats, combinés à ceux d'autres groupes de recherche, nous ont permis de mieux comprendre comment les ASICs sont ouverts par une acidification du milieu extracellulaire. Une seconde étude souligne le rôle structural crucial d'une région conservée parmi tous les canaux ASICs : y toucher c'est diminuer l'activité de la protéine. Ce domaine permet l'harmonisation des changements dus à l'acidification du milieu extracellulaire au sein d'une même sous-unité c'est-à-dire qu'elle participe à l'induction de l'inactivation due à l'activation du canal Cette étude décrit donc quelle région de la protéine atteindre pour la bloquer efficacement en faisant une cible thérapeutique de choix.

ACID-SENSING ION CHANNELS: functional and molecular characterization in putative nociceptors, and modulation by nerve injury and serine protease

Résumé Les canaux ioniques ASICs (acid-sensing ion channels) appartiennent à la famille des canaux ENaC/Degenerin. Pour l'instant, quatre gènes (1 à 4) ont été clonés dont certains présentent des variants d'épissage. Leur activation par une acidification rapide du milieu extracellulaire génère un courant entrant transitoire essentiellement sodique accompagné pour certains types d'ASICs d'une phase soutenue. Les ASICs sont exprimés dans le système nerveux, central (SNC) et périphérique (SNP). On leur attribue un rôle dans l'apprentissage, la mémoire et l'ischémie cérébrale au niveau central ainsi que dans la nociception (douleur aiguë et inflammatoire) et la méchanotransduction au niveau périphérique. Toutefois, les données sont parfois contradictoires. Certaines études suggèrent qu'ils sont des senseurs primordiaux impliqués dans la détection de l'acidification et la douleur. D'autres études suggèrent plutôt qu'ils ont un rôle modulateur inhibiteur dans la douleur. De plus, le fait que leur activation génère majoritairement un courant transitoire alors que les fibres nerveuses impliquées dans la douleur répondent à un stimulus nocif avec une adaptation lente suggère que leurs propriétés doivent être modulés par des molécules endogènes. Dans une première partie de ma thèse, nous avons abordé la question de l'expression fonctionnelle des ASICs dans les neurones sensoriels primaires afférents du rat adulte pour clarifier le rôle des ASICs dans les neurones sensoriels. Nous avons caractérisé leurs propriétés biophysiques et pharmacologiques par la technique du patch-clamp en configuration « whole-cell ». Nous avons pu démontrer que près de 60% des neurones sensoriels de petit diamètre expriment des courants ASICs. Nous avons mis en évidence trois types de courant ASIC dans ces neurones. Les types 1 et 3 ont des propriétés compatibles avec un rôle de senseur du pH alors que le type 2 est majoritairement activé par des pH inférieurs à pH6. Le type 1 est médié par des homomers de la sous-unité ASIC1 a qui sont perméables aux Ca2+. Nous avons étudié leur co-expression avec des marqueurs des nocicepteurs ainsi que la possibilité d'induire une activité neuronale suite à une acidification qui soit dépendante des ASICs. Le but était d'associer un type de courant ASIC avec une fonction potentielle dans les neurones sensoriels. Une majorité des neurones exprimant les courants ASIC co-expriment des marqueurs des nocicepteurs. Toutefois, une plus grande proportion des neurones exprimant le type 1 n'est pas associée à la nociception par rapport aux types 2 et 3. Nous avons montré qu'il est possible d'induire des potentiels d'actions suite à une acidification. La probabilité d'induction est proportionnelle à la densité des courants ASIC et à l'acidité de la stimulation. Puis, nous avons utilisé cette classification comme un outil pour appréhender les potentielles modulations fonctionnelles des ASICs dans un model de neuropathie (spared nerve injury). Cette approche fut complétée par des expériences de «quantitative RT-PCR ». En situation de neuropathie, les courants ASIC sont dramatiquement changés au niveau de leur expression fonctionnelle et transcriptionnelle dans les neurones lésés ainsi que non-lésés. Dans une deuxième partie de ma thèse, suite au test de différentes substances sécrétées lors de l'inflammation et l'ischémie sur les propriétés des ASICs, nous avons caractérisé en détail la modulation des propriétés des courants ASICs notamment ASIC1 par les sérines protéases dans des systèmes d'expression recombinants ainsi que dans des neurones d'hippocampe. Nous avons montré que l'exposition aux sérine-protéases décale la dépendance au pH de l'activation ainsi que la « steady-state inactivation »des ASICs -1a et -1b vers des valeurs plus acidiques. Ainsi, l'exposition aux serine protéases conduit à une diminution du courant quand l'acidification a lieu à partir d'un pH7.4 et conduit à une augmentation du courant quand l'acidification alleu à partir d'un pH7. Nous avons aussi montré que cette régulation a lieu des les neurones d'hippocampe. Nos résultats dans les neurones sensoriels suggèrent que certains courants ASICs sont impliqués dans la transduction de l'acidification et de la douleur ainsi que dans une des phases du processus conduisant à la neuropathie. Une partie des courants de type 1 perméables au Ca 2+ peuvent être impliqués dans la neurosécrétion. La modulation par les sérines protéases pourrait expliquer qu'en situation d'acidose les canaux ASICs soient toujours activables. Résumé grand publique Les neurones sont les principales cellules du système nerveux. Le système nerveux est formé par le système nerveux central - principalement le cerveau, le cervelet et la moelle épinière - et le système nerveux périphérique -principalement les nerfs et les neurones sensoriels. Grâce à leur nombreux "bras" (les neurites), les neurones sont connectés entre eux, formant un véritable réseau de communication qui s'étend dans tout le corps. L'information se propage sous forme d'un phénomène électrique, l'influx nerveux (ou potentiels d'actions). A la base des phénomènes électriques dans les neurones il y a ce que l'on appelle les canaux ioniques. Un canal ionique est une sorte de tunnel qui traverse l'enveloppe qui entoure les cellules (la membrane) et par lequel passent les ions. La plupart de ces canaux sont normalement fermés et nécessitent d'être activés pour s'ouvrire et générer un influx nerveux. Les canaux ASICs sont activés par l'acidification et sont exprimés dans tout le système nerveux. Cette acidification a lieu notamment lors d'une attaque cérébrale (ischémie cérébrale) ou lors de l'inflammation. Les expériences sur les animaux ont montré que les canaux ASICs avaient entre autre un rôle dans la mort des neurones lors d'une attaque cérébrale et dans la douleur inflammatoire. Lors de ma thèse je me suis intéressé au rôle des ASICs dans la douleur et à l'influence des substances produites pendant l'inflammation sur leur activation par l'acidification. J'ai ainsi pu montrer chez le rat que la majorité des neurones sensoriels impliqués dans la douleur ont des canaux ASICs et que l'activation de ces canaux induit des potentiels d'action. Nous avons opéré des rats pour qu'ils présentent les symptômes d'une maladie chronique appelée neuropathie. La neuropathie se caractérise par une plus grande sensibilité à la douleur. Les rats neuropathiques présentent des changements de leurs canaux ASICs suggérant que ces canaux ont une peut-être un rôle dans la genèse ou les symptômes de cette maladie. J'ai aussi montré in vitro qu'un type d'enryme produit lors de l'inflammation et l'ischémie change les propriétés des ASICs. Ces résultats confirment un rôle des ASICs dans la douleur suggérant notamment un rôle jusque là encore non étudié dans la douleur neuropathique. De plus, ces résultats mettent en évidence une régulation des ASICs qui pourrait être importante si elle se confirmait in vivo de part les différents rôles des ASICs. Abstract Acid-sensing ion channels (ASICs) are members of the ENaC/Degenerin superfamily of ion channels. Their activation by a rapid extracellular acidification generates a transient and for some ASIC types also a sustained current mainly mediated by Na+. ASICs are expressed in the central (CNS) and in the peripheral (PNS) nervous system. In the CNS, ASICs have a putative role in learning, memory and in neuronal death after cerebral ischemia. In the PNS, ASICs have a putative role in nociception (acute and inflammatory pain) and in mechanotransduction. However, studies on ASIC function are somewhat controversial. Some studies suggest a crucial role of ASICs in transduction of acidification and in pain whereas other studies suggest rather a modulatory inhibitory role of ASICs in pain. Moreover, the basic property of ASICs, that they are activated only transiently is irreconcilable with the well-known property of nociception that the firing of nociceptive fibers demonstrated very little adaptation. Endogenous molecules may exist that can modulate ASIC properties. In a first part of my thesis, we addressed the question of the functional expression of ASICs in adult rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. Our goal was to elucidate ASIC roles in DRG neurons. We characterized biophysical and pharmacological properties of ASIC currents using the patch-clamp technique in the whole-cell configuration. We observed that around 60% of small-diameter sensory neurons express ASICs currents. We described in these neurons three ASIC current types. Types 1 and 3 have properties compatible with a role of pH-sensor whereas type 2 is mainly activated by pH lower than pH6. Type 1 is mediated by ASIC1a homomultimers which are permeable to Ca 2+. We studied ASIC co-expression with nociceptor markers. The goal was to associate an ASIC current type with a potential function in sensory neurons. Most neurons expressing ASIC currents co-expressed nociceptor markers. However, a higher proportion of the neurons expressing type 1 was not associated with nociception compared to type 2 and -3. We completed this approach with current-clamp measurements of acidification-induced action potentials (APs). We showed that activation of ASICs in small-diameter neurons can induce APs. The probability of AP induction is positively correlated with the ASIC current density and the acidity of stimulation. Then, we used this classification as a tool to characterize the potential functional modulation of ASICs in the spared nerve injury model of neuropathy. This approach was completed by quantitative RT-PCR experiments. ASICs current expression was dramatically changed at the functional and transcriptional level in injured and non-injured small-diameter DRG neurons. In a second part of my thesis, following an initial screening of the effect of various substances secreted during inflammation and ischemia on ASIC current properties, we characterized in detail the modulation of ASICs, in particular of ASIC1 by serine proteases in a recombinant expression system as well as in hippocampal neurons. We showed that protease exposure shifts the pH dependence of ASIC1 activation and steady-state inactivation to more acidic pH. As a consequence, protease exposure leads to a decrease in the current response if ASIC1 is activated by a pH drop from pH 7.4. If, however, acidification occurs from a basal pH of 7, protease-exposed ASIC1a shows higher activity than untreated ASIC1a. We provided evidence that this bi-directional regulation of ASIC1a function also occurs in hippocampal neurons. Our results in DRG neurons suggest that some ASIC currents are involved in the transduction of peripheral acidification and pain. Furthermore, ASICs may participate to the processes leading to neuropathy. Some Ca 2+-permeable type 1 currents may be involved in neurosecretion. ASIC modulation by serine proteases may be physiologically relevant, allowing ASIC activation under sustained slightly acidic conditions.

Molecular basis of native inward rectifier currents : role of Kir2 subunits

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Molecular basis of native inward rectifier currents : role of Kir2 subunits

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Analyse fonctionnelle de deux nouvelles mutations récessives de l’AQP2 impliquées dans le diabète insipide néphrogénique par expression dans les ovocytes de Xenopus laevis

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives.

Analyse fonctionnelle et moléculaire d'un nouveau gène (VIT32) impliqué dans le mécanisme d'action de la vasopressine

Résumé Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale (tube distal et tube collecteur) du néphron ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition ionique et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent le maintien de la pression sanguine. Dans la cellule principale du tube collecteur cortical (CCD), le taux de réabsorption de sodium dépend essentiellement de l'activité du canal épithélial à sodium (ENaC) à la membrane apicale et de la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K±ATPase) à la membrane basolatérale. L'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales de CCD, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape précoce dite « non-génomique » et une étape tardive dite « génotnique ». Durant l'étape précoce, la vasopressine régule l'expression de gènes, dont certains peuvent être impliqués dans le transport de sodium, comme ENaC et la Na+ -K+ATP ase. Le but de mon travail a été d'étudier l'implication d'une protéine appelée VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) dans le transport de sodium. L'expression de VIP32 est augmentée par la vasopressine dans les cellules principales de CCD. Dans l'ovocyte de Xenopus laevis utilisé comme système d'expression hétérologue, nous avons montré que l'expression de VIP32 provoque la maturation méiotique de l'ovocyte par l'activation de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et du facteur de promotion méiotique (MPF). La co-expression d'ENaC et de VIP32 diminue l'activité d'ENaC de façon sélective, par l'activation de la voie des MAPK, sans affecter l'expression du canal à la surface membranaire. Nous avons également montré que la régulation de l'activité d'ENaC par la voie des MAPK est dépendante du mécanisme de régulation d'ENaC lié à un motif du canal appelé PY. Ce motif est impliqué dans le contrôle de la probabilité d'ouverture ainsi que l'expression à la surface membranaire d'ENaC. Dans les cellules principales, VIP32 par l'activation de la voie des MAPK peut être impliqué dans la régulation négative du transport transépithélial qui a lieu après plusieurs heures de traitement à la vasopressine. Le tube collecteur de reins normaux présente un taux basal significatif d'activité de la voie MAPK MEK1/2-ERK1/2. Dans la lignée mpkCCDc14 de cellules principales de CCD de souris, que nous avons utilisé pour cette partie du travail, nous avons montré la présence d'un taux basal d'activité d'ERK1/2 (pERK1/2). L'aldostérone et la vasopressine, connus pour stimuler le courant sodique transépithélial dans le CCD, ne changeaient pas le taux basal de pERK1/2. Le transport de sodium transépithélial basal, ou stimulé par l'aldostérone ou la vasopressine est diminué par l'effet de PD98059, un inhibiteur de MEK1/2 qui diminue parallèlement le taux de pERK1/2. Nous avons également montré dans des cellules non stimulées, ou stimulées par de l'aldostérone ou de la vasopressine, que l'activité de la Na+-K+ ATPase, mais pas celle d'ENaC est inhibée par des traitements avec différents inhibiteurs de MEK1/2. Par un marquage de la Na±-K+ATPase à la surface membranaire nous avons montré que la voie d'ERK1/2 contrôle l'activité intrinsèque de la Na+-K+ ATPase, plutôt que son expression à la surface membranaire. Ces données ont montré que l'activité de la Na+-K+ATPase et le transport transépithélial de sodium sont contrôlés par l'activité basal et constitutive de la voie d'ERK1/2. Summary The regulation of sodium reabsorption in the distal nephron (distal tubule and cortical collecting duct) in the kidney plays an essential role in the control of extracellular fluids composition and volume, and thereby blood pressure. In the principal cell of the collecting duct (CCD), the level of sodium reabsorption mainlly depends on the activity of both epithlial sodium channel (ENaC) and sodium-potassium-adenosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). The activity of these two transporters is regulated by hormones especially aldosterone, vasopressin and insuline.In the principal cell of the CCD, vasopressin regulates sodium transport via a short-term effect and a late genomic effect. During the genomic effect vasopressin activates a complex network of vasopressin-dependent genes involved in the regulation of sodium transport as ENaC and Na+-K+ATPase. We were interested in the role of a recently identified vasopressin induced protein (VIP32) and its implication in the regulation of sodium transport in principal cell of the CCD. The Xenopus oocyte expression system revealed two functions : expressed alone VIP32 rapidly induces oocyte meiotic maturation through the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the meiotic promoting factor and when co-expressed with ENaC, V1P32 selectively dowrn-egulates channel activity, but not channel cell surface expression. We have shown that the ENaC downregulation mediated by the activation of the MAPK pathway is related to the PY motif of ENaC. This motif is implicated in ENaC cell surface expression and open probability regulation. In the kidney principal cell, VIP32 through the activation of MAPK pathway may be involved in the downregulation of transepithelial sodium transport observed within a few hours after vasopressin treatment. The collecting duct of normal kidney exhibits significant activity of the MEK1/2-ERK1/2 MAPK pathway. Using in vitro cultured mpkCCDc14 principal cells we have shown a significant basal level of ERK1/2 activity (pERK1/2). Aldosterone and vasopressin, known to upregulate sodium reabsorption in CCDs, did not change ERK1/2 activity. Basal and aldosterone- or vasopressin-stimulated sodium transport were downregulated by the MEK1/2 inhibitor PD98059 in parallel with a decrease in pERK1/2 in vitro. The activity of Na+-K+ATPase but not that of ENaC was inhibited by MEK1/2 inhibitors in both, unstimulated and aldosterone- or vasopressin-stimulated CCDs in vitro. Cell surface labelling showed that intrinsic activity rather than cell surface expression of Na+-K+ATPase was controlled by pERK1/2. Our data demonstrate that basal constitutive activity of ERK1/2 pathway controls Na+-K+ATPase activity and transepithelial sodium transport in the principal cell. Résumé tout public Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale du néphron (l'unité fonctionnelle du rein) ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent de maintenir une pression sanguine effective. Dans les cellules principales du tube collecteur, une région spécifique du néphron distal, le transport de sodium dépend essentiellement de l'activité de deux transporteurs de sodium : le canal épithélial à sodium (ENaC) et la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). Afin de répondre aux besoins de l'organisme, l'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales du tube collecteur, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape rapide et une étape lente dite « génomique ». Durant l'étape lente, la vasopressine régule l'expression de gènes pouvant être impliqués dans le transport de sodium, dont notamment ceux d'ENaC et de la Na+-K+ATPase. Parmi les gènes dont l'expression est augmentée par la vasopressine, celui de VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) fait l'objet de cette étude. Le but de mon travail a été d'étudier, dans un système d'expression hétérologue (l'ovocyte de Xenopus leavis), l'implication de VIP32 dans le transport de sodium. Nous avons montré que VIP32 est capable d'activer un mécanisme moléculaire en cascade appelé MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et est aussi capable de diminuer l'activité d'ENaC. Parallèlement, dans une lignée de cellules principales de tube collecteur les mpkCCDc14, nous avons montré que le taux basal d'activité de la cascade MAPK est capable de réguler l'activité de la Na+-K+ATPase, tandis qu'il n'influence pas l'activité d'ENaC.

L'expression des E-cadherines et des calretinines dans les tumeurs sérieuses borderline de l'ovaire : un facteur pronostique ?

Résumé: Les tumeurs séreuses dites "borderline" de l'ovaire sont rares. Si leur pronostic est bon chez la très grande majorité des patientes (90-96%), leur traitement reste controversé, surtout chez la femme jeune. Ces tumeurs peuvent récidiver surtout sous la forme d'implants péritonéaux résultant de la colonisation du péritoine par des cellules tumorales qui, ayant perdu leur capacité d'adhésion, se détacherait de la tumeur primaire et essaimeraient dans l'espace péritonéal. C'est la présence ou non de ces implants qui détermine l'évolution à moyen ou à long terme. Le but de cette étude est d'évaluer la valeur pronostique de l'expression, par les cellules tumorales, d'une molécule d'adhésion, la E-cadhérine et des calrétinines, protéines susceptible de stimuler le cycle cellulaire et donc d'être un marqueur d'agressivité. En d'autre termes, il s'agirait de pouvoir distinguer entre les tumeurs à bon et celles à mauvais pronostic, et cela afin d'optimaliser le traitement. A cet effet, nous avons analysé une série de 57 patientes ayant présenté ce type de tumeurs. Lors du diagnostic 12 des 23 patientes dont la tumeur avait une composante exophytique présentaient des implants péritonéaux, ceux-ci ayant un caractère invasif chez 2 patientes. Quatre patientes ont présenté une récidive, toutes sauf 1 provenaient de tumeur exophytique, et une en est décédée. Aucun implant fut retrouvé chez les 34 femmes porteuses d'une tumeur exclusivement endophytique. Sur 57 tumeurs, 20 ne présentaient pas de marquage par les E-cadhérines, 4 implants non-invasifs étaient marqués sur 10, et les implants invasifs étaient tous les 2 marqués. Ceci pourrait s'expliquer par une surexpression d'une protéine non fonctionnelle. L'immunomarquage par les calrétinines était présent chez 40 tumeurs, chez 5 implants non-invasifs sur 10, et fortement chez les 2 implants invasifs. Cette protéine pourrait peut-être permettre de distinguer les implants invasifs au pronostic plus sombre

Langage et cerveau : vingt ans d'imagerie fonctionnelle [Language and the brain: 20 years of functional imagery]

La masse considérable de travaux publiés dans le domaine de la neuroimagerie fonctionnelle concernant les fonctions ou modalités du langage (compréhension et expression de la parole, lecture) ou les différents processus linguistiques qui les sous-tendent (sémantique, phonologie, syntaxe) permet de dégager de grandes tendances en termes de substrats anatomiques. Si les « fondamentaux » issus des origines aphasiologiques du domaine n'ont pas été bouleversés, certaines spécificités non explorées par l'approche lésionnelle sont identifiables. Les méta-analyses, en regroupant les résultats de la littérature, nous procurent aujourd'hui une vision globale des substrats cérébraux du langage. Cependant la variabilité inter-individuelle reste importante en raison de multiples facteurs dont certains sont mal identifiés ; cartographier exhaustivement les fonctions du langage à l'échelle individuelle reste une gageure. La quête des images du langage est sans doute aussi inachevable que celle de l'étude du langage lui-même.

Analyses critiques de ľ expression génétique

La question du filtrage de ľinformation génétique dans la cellule est fondamentale. Comment la cellule sélectionne-t-elle, avant de les transformer en RNA puis en protéines, certaines parties bien déterminées de son information génétique? Il ne sera probablement pas possible de donner une explication cohérente du développement embryonnaire, de la différentiation cellulaire et du maintien de ľétat différencie tant que nous n'aurons pas repondu de manière satis-faisante à cette question. Dans un premier chapitre, quelques notions de base concernant ľexpression génétique sont préséntées. Le dogme de flux de ľinformation génétique dans la cellule, DNARNA protéine est valable à la fois pour les procaryotes et les eucaryotes malgré des différences significatives au niveau de la structure et de la régulation des gènes. Contrairement aux génes procaryotes, la plu-part des gènes eucaryotes sont morcelés. Le DNA codant pour une protéine est interrompu par des régions non-codantes dont les transcrits sont éliminés par excision pendant la maturation du RNA messager ultérieurement traduit en protéine. Une grande variété de mécanismes interviennent dans la régulation de ľactivité de ces gènes. Le pouvoir et les limites des méthodes modernes de ľanalyse structurale et fonctionnelle des génes sont discutés dans la deuxième partie de ľarticle. Ľhybridation moléculaire reposant sur la complémentarité des bases azotées des acides nucléiques joue un rôle déterminant dans ľétude de la complexity des génomes et de leur expression. Récemment, ľapplication de la technologie du DNA recombinant et des techniques annexes a permis ľisolement ainsi que la caractérisation de plusieurs génes eucaryotes. La question de ľexpression différentielle de ces génes est actuellement intensément étudiée dans plusieurs systèmes de transcription ayant chacun ses points forts et ses faiblesses. En guise de conclusion, quelques implications de ľessor prodigieux que connaît la génétique moléculaire sont discutées.

Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand Factor and Fli-1 in normal human tissues

Résumé du travail de thèse Introduction : Les différentes cellules endothéliales du lit vasculaire ont de nombreuses similitudes fonctionnelles et morphologiques. Cependant, elles présentent également une importante hétérogénéité structurelle et fonctionnelle qui peut avoir des implications notamment dans l'angiogenèse et le développement des maladies cardio-vasculaires. Peu d'études ont été publiées au sujet de l'expression et de la distribution des marqueurs endothéliaux dans les tissus humain normaux. Objectif : Nous avons étudié l'expression immunohistochimique des marqueurs endothéliaux CD31, CD34, vWF et Fli-1 dans les vaisseaux périphériques du rein, du poumon, de la rate, du foie, du cour et des gros vaisseaux ; incluant l'aorte, la veine cave inférieure, l'artère rénale ainsi que les artères et veines pulmonaires et fémorales. Matériel et méthodes : Les échantillons tissulaires ont été obtenus à partir de matériel d'autopsie et de biopsies. Le matériel a été fixé en formaline et inclus en paraffine. Les coupes de paraffine ont été colorées immunohistochimiquement avec CD31, CD34 et vWF. Les biopsies ont également été colorées immunohistochimiquement avec Fli-1, D2-40 et Lyve-1. Résultats : L'expression immunohistochimique de ces marqueurs est hétérogène dans les différents organes étudiés. Dans le rein, l'endothélium fenêtré des glomérules exprime fortement CD31 et CD34. Par contre, il n'exprime pas ou alors de manière faible et focale vWF. Dans le poumon, les capillaires alvéolaires expriment fortement CD31 et CD34 mais sont habituellement négatifs pour le vWF. L'expression de vWF augmente graduellement avec le calibre vasculaire dans le poumon. Les sinusoïdes de la rate expriment CD31 de manière diffuse mais ils n'expriment pas CD34. Les sinusoïdes du foie expriment CD31 de part et d'autre des lobules. Par contre, CD34 est exprimé seulement dans la région périportale. L'expression de Fli-1 dans les cellules endothéliales est ubiquitaire et ne varie pas suivant le type de vaisseau ou d'organe. Fli-1 est également exprimé dans d'autres types de cellules, essentiellement des lymphocytes. D2-40 est exprimé seulement dans l'endothélium des vaisseaux lymphatiques. L'expression de Lyve-1 dans ce matériel de routine était inconstante et non reproductible. Conclusion : Ces résultats indiquent que l'expression des marqueurs endothéliaux CD31, CD34 et vWF est hétérogène dans le lit vasculaire et qu'elle varie entre différents vaisseaux et différents compartiments anatomiques du même organe. D2-40 ne marque que les cellules endothéliales lymphatiques.

Optimisation d'une approche pour l'analyse de l'expression de gènes au niveau unicellulaire chez des sous-populations spécialisées de lymphocytes T CD4+ humaines

Chez les patients cancéreux, les cellules malignes sont souvent reconnues et détruites par les cellules T cytotoxiques du patient. C'est pourquoi, depuis plusieurs années, des recherches visent à produire des vaccins sensibilisant les cellules de l'immunité adaptative, afin de prévenir certains cancers. Bien que les vaccins ciblant les cellules T CD8+ (cytotoxiques) ont une efficacité in-vitro élevée, un vaccin pouvant cibler les cellules T CD8+ et CD4+ aurait une plus grande efficacité (1-3). En effet, les cellules T helper (CD4+) favorisent la production et la maintenance des cellules T CD8+ mémoires à longue durée de vie. Il existe un grand nombre de sous-types de cellules T CD4+ et leur action envers les cellules cancéreuses est différente. Par exemple, les lymphocytes Treg ont une activité pro-tumorale importante (4) et les lymphocytes Th1 ont une activité anti-tumorale (5). Cependant, le taux naturel des différents sous-types de cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux est variable. De plus, une certaine flexibilité des différents sous-types de cellules T CD4+ a été récemment démontrée (6). Celle-ci pourrait être ciblée par des protocoles de vaccination avec des antigènes tumoraux administrés conjointement à des adjuvants définis. Pour cela, il faut approfondir les connaissances sur le rôle des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes dans l'immunité anti-tumorale et connaître précisément la proportion des sous-types de cellules T CD4+ activées avant et après la vaccination. L'analyse des cellules T, par la cytométrie de flux, est très souvent limité par le besoin d'un nombre très élevé de cellules pour l'analyse de l'expression protéique. Or dans l'analyse des cellules T CD4+ spécifiques aux antigènes tumoraux cette technique n'est souvent pas applicable, car ces cellules sont présentes en très faible quantité dans le sang et dans les tissus tumoraux. C'est pourquoi, une approche basée sur l'analyse de la cellule T individuelle a été mise en place afin d'étudier l'expression du profil génétique des cellules T CD8+ et CD4+. (7,8) Méthode : Ce nouveau protocole (« single cell ») a été élaboré à partir d'une modification du protocole PCR-RT, qui permet la détection spécifique de l'ADN complémentaire (ADNc) après la transcription globale de l'ARN messager (ARNm) exprimé par une cellule T individuelle. Dans ce travail, nous optimisons cette nouvelle technique d'analyse pour les cellules T CD4+, en sélectionnant les meilleures amorces. Tout d'abord, des clones à profils fonctionnels connus sont générés par cytométrie de flux à partir de cellules T CD4+ d'un donneur sain. Pour cette étape d'optimisation des amorces, la spécificité des cellules T CD4+ n'est pas prise en considération. Il est, donc, possible d'étudier et de trier ces clones par cytométrie de flux. Ensuite, grâce au protocole « single cell », nous testons par PCR les amorces des différents facteurs spécifiques de chaque sous-type des T CD4+ sur des aliquotes issus d'une cellule provenant des clones générés. Nous sélectionnons les amorces dont la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives positives et négatives des tests sont les meilleures. (9) Conclusion : Durant ce travail nous avons généré de l'ADNc de cellules T individuelles et sélectionné douze paires d'amorces pour l'identification des sous-types de cellules T CD4+ par la technique d'analyse PCR « single cell ». Les facteurs spécifiques aux cellules Th2 : IL-4, IL-5, IL-13, CRTh2, GATA3 ; les facteurs spécifiques aux cellules Th1 : TNFα, IL-2 ; les facteurs spécifiques aux cellules Treg : FOXP3, IL-2RA ; les facteurs spécifiques aux cellules Th17 : RORC, CCR6 et un facteur spécifique aux cellules naïves : CCR7. Ces amorces peuvent être utilisées dans le futur en combinaison avec des cellules antigènes-spécifiques triées par marquage des multimères pMHCII. Cette méthode permettra de comprendre le rôle ainsi que l'amplitude et la diversité fonctionnelle de la réponse de la cellule T CD4+ antigène-spécifique dans les cancers et dans d'autres maladies. Cela afin d'affiner les recherches en immunothérapie oncologique. (8)

Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de Cif1p, une protéine orpheline impliquée dans le phénomène épigénétique de viabilité de la levure S. pombe en absence de la chaperone calnexine.

Le repliement des protéines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protéines dont la calnexine, une chaperone du réticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons démontré que la calnexine est essentielle à la viabilité de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre d’études structure-fonction portant sur cette protéine, nous avons découvert un phénomène permettant la viabilité des cellules en absence de la calnexine. Cet état, nommé Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dépourvu du domaine central hautement conservé (Δhcd_Cnx1p). La caractérisation de l’état Cin a révélé plusieurs caractéristiques particulières telle la dominance, sa transmission de façon non-Mendélienne à la progéniture méïotique et sa transmission par des extraits protéiques dépourvus d’acides nucléiques. Toutes ces propriétés suggèrent donc que l’état Cin est médié via un élément de type prion. Le gène cif1+, pour calnexin independence factor, a été isolé lors de criblages visant à identifier des gènes impliqués dans l’état Cin. Il encode pour une protéine orpheline dont la surexpression induit de façon stable un état de viabilité en l’absence de la calnexine. Cet état diffère génétiquement et phénotypiquement de l’état Cin induit par le mutant Δhcd_Cnx1p préalablement caractérisé, ce qui suggère deux voies parallèles de signalisation du phénomène Cin. Une caractérisation exhaustive de Cif1p a permis de démontrer qu’il ne s’agissait pas du prion responsable de l’état Cin, malgré que cette protéine possède certaines propriétés typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protéine nucléolaire dont la bonne localisation est essentielle à sa capacité à induire l’état Cin. Ceci suggère une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction exécutée dans le nucléole. Lors d’études visant à élucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a été établi qu’elle interagissait avec certaines protéines de la grosse sous-unité du ribosome telle la protéine L3. Cependant, Cif1p ne co-sédimente pas avec des sous-unités ribosomales assemblées, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une délétion génomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturbé lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rôle dans la biosynthèse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rôle spécifique à cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de l’entrée des cellules en phase stationnaire. De plus, des études effectuées récemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rôle important dans la signalisation de l’apoptose, et ce particulièrement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nucléolaire dans la biosynthèse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la médiation de l’apoptose semble se dessiner. D’autres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rôle de son clivage et les autres composantes impliquées dans le phénomène Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire inédite.

Analyse fonctionnelle de la polycystine-1 et de son domaine intracellulaire dans le développement de la polykystose rénale autosomique dominante

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est la maladie génétique rénale la plus commune touchant 1/500 personnes. Elle se caractérise principalement par la formation de kystes rénaux dans tous les segments du néphron, entraînant l’insuffisance rénale, et par des manifestations extrarénales kystiques (foie, pancréas, rate) et non-kystiques (anomalies cardiaques, vasculaires et cérébrales). Deux gènes, PKD1 et PKD2, sont responsables de 85 et 15% des cas respectivement. Ces gènes encodent les polycystine-1 (PC-1) et -2 (PC-2) qui forment un complexe à la membrane plasmique et ciliaire des cellules épithéliales rénales. PC-1 est une protéine transmembranaire de 4302 acides aminés possédant un court domaine intracellulaire incluant un motif coiled-coil impliqué dans l’interaction entre PC-1 et PC-2 in-vitro. L’importance du coiled-coil est démontrée par des mutations affectant spécifiquement ce motif chez des patients PKRAD. Le mécanisme pathogénétique responsable de la PKRAD est indéterminé. Chez la souris, la PKRAD se développe suite à l’ablation (Pkd1-/-) ou lors de la surexpression (SBPkd1TAG) de Pkd1, ce qui suggère un effet de dosage. Des anomalies ciliaires sont aussi souvent associées à PKRAD. Mon objectif était de déterminer in-vivo le mécanisme pathogénétique de la polycystine-1 dans le développement des symptômes PKRAD rénaux et extrarénaux et plus spécifiquement, le rôle du motif coiled-coil dans le mécanisme de kystogenèse. Pour ce faire, nous avons généré deux constructions, Pkd1 sauvage (Pkd1TAG) et Pkd1 tronquée de son motif coiled-coil (Pkd1ΔCoiled-coil), par recombinaison homologue à partir du BAC-Pkd1 sauvage comprenant la séquence murine entière de Pkd1. Trois lignées de souris Pkd1TAG générées par microinjection démontrent un niveau d’expression de Pkd1 qui corrèle avec le nombre de copie du transgène (2, 5 et 15 copies). Les souris Pkd1TAG reproduisent la PKRAD en développant des kystes rénaux dans toutes les parties du néphron et des cils primaires plus longs que les contrôles non transgéniques. Les analyses physiologiques supportent que les souris Pkd1TAG développent une insuffisance rénale et démontrent une augmentation du volume urinaire de même qu’une diminution de l’osmolalité, de la créatinine et des protéines urinaires. De plus, les souris Pkd1TAG développent des kystes hépatiques, des anomalies cardiaques associées à des dépôts de calcium et des anévrismes cérébraux. La sévérité du phénotype augmente avec l’expression de Pkd1 appuyant l’hypothèse d’un mécanisme de dosage. Nous avons aussi déterminé que l’expression du transgène Pkd1TAG complémente le phénotype létal-embryonnaire des souris Pkd1-/-. D’autre part, nous avons générés 4 lignées de souris Pkd1ΔCoiled-coil (2 et 15 copies du transgène) dont le nombre de copies corrèle avec le niveau d’expression du transgène. Ces souris Pkd1ΔCoiled-coil, contrairement aux Pkd1TAG de même âge, ne développent pas de kystes et possèdent des cils primaires de longueur normale. Afin d’évaluer le rôle du motif coiled-coil en absence de polycystine-1 endogène, nous avons croisé les souris Pkd1ΔCoiled-coil avec les souris Pkd1-/-. Contrairement aux souris Pkd1-/- qui meurent in-utéro, les souris Pkd1ΔCoiled-coil; Pkd1-/- survivent ~10 à 14 jours après la naissance. Elles démontrent des kystes rénaux et pancréatiques sévères, un retard de croissance et des anomalies pulmonaires. Tous les segments du néphron sont affectés. Mon projet démontre que la surexpression de Pkd1 est un mécanisme pathogénique de la PKRAD tant au niveau rénal qu’extrarénal. De plus, il démontre que le motif coiled-coil est un élément déterminant dans la kystogenèse/PKRAD in-vivo.

Caractérisation fonctionnelle du gène AP1S1 mutant associé au syndrome de MEDNIK

Dans les cellules eucaryotes, le trafic intracellulaire de nombreuses protéines est assuré par des vésicules de transport tapissées de clathrine. Les complexes adaptateurs de clathrine (AP) sont responsables de l’assemblage de ces vésicules et de la sélection des protéines qui seront transportées. Nous avons étudié cinq familles atteintes du syndrome neurocutané MEDNIK qui est caractérisé par un retard mental, une entéropathie, une surdité, une neuropathie périphérique, de l’icthyose et de la kératodermie. Tous les cas connus de cette maladie à transmission autosomique récessive sont originaires de la région de Kamouraska, dans la province de Québec. Par séquençage direct des gènes candidats, nous avons identifié une mutation impliquant le site accepteur de l’épissage de l’intron 2 du gène codant pour la sous-unité σ1 du complexe AP1 (AP1S1). Cette mutation fondatrice a été retrouvée chez tous les individus atteints du syndrome MEDNIK et altère l’épissage normal du gène, menant à un codon stop prématuré. Afin de valider l’effet pathogène de la mutation, nous avons bloqué la traduction de cette protéine chez le poisson zébré en injectant une séquence d’oligonucléotides antisenses spécifique à AP1S1. À 48 heures après la fertilisation, les larves knock down pour AP1S1 montrent une réduction de la pigmentation, une désorganisation de la structure de l’épiderme et une perturbation du développement moteur. Alors que la surexpression de l’AP1S1 humain dans ce modèle a permis la récupération du phénotype normal, l’expression de l’AP1S1 mutant fut sans effet sur les phénotypes moteurs et cutanés des larves knock down. Les résultats obtenus montrent que la mutation du AP1S1 responsable du syndrome de MEDNIK est associée à une perte de fonction et que la sous-unité σ1 du complexe AP1 joue un rôle crucial dans l’organisation de l’épiderme et le développement de la moelle épinière.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.