In vitro culture at low temperature and ex vitro acclimatization of Vriesea inflata an ornamental bromeliad

(In vitro culture at low temperature and ex vitro acclimatization of Vriesea inflata an ornamental bromeliad). In vitro culture by seeds is a technique for preservation of threatened species because it may provide a large number of plants with genetic diversity. The bromeliad Vriesea inflata (Wawra) Wawra, an ornamental bromeliad, is extensively and illegally collected from the nature and must be preserved. It is possible to form plant threatened collections in vitro by reducing the temperature of culture, while occupying little space, with the consequent reduction of maintenance costs. This work evaluated the influence of temperature on in vitro growth and morphology of plants of V. inflata, with the aim of establishing a slow growth-rate and analyzing the ex vitro acclimatization. Seeds were germinated in vitro in Murashige and Skoog (MS) medium, with macronutrients reduced to 50% (MS/2). After three months the plants were transferred to flasks of new same medium and kept in two germination chambers with the temperature adjusted to 15 °C and to 28 °C. After 24 months the plants were subject to biometric, photosynthetic pigments content and anatomical analyses. Results showed that plants maintained at 15 °C were smaller than those at 28 °C. Nevertheless, there were no alterations in pigments content, anatomy. In both treatments there was a survival rate of 100%. This work showed that plants of this species can be kept in vitro at 15 °C with the aim of forming a slow-growth collection, thereby seeking its preservation, and can be transferred to growth at ex vitro condition to achieved 100% survival rate.

Harmonisation of short-term in vitro culture for the expansion of antigen-specific CD8(+) T cells with detection by ELISPOT and HLA-multimer staining.

Ex vivo ELISPOT and multimer staining are well-established tests for the assessment of antigen-specific T cells. Many laboratories are now using a period of in vitro stimulation (IVS) to enhance detection. Here, we report the findings of a multi-centre panel organised by the Association for Cancer Immunotherapy Immunoguiding Program to investigate the impact of IVS protocols on the detection of antigen-specific T cells of varying ex vivo frequency. Five centres performed ELISPOT and multimer staining on centrally prepared PBMCs from 3 donors, both ex vivo and following IVS. A harmonised IVS protocol was designed based on the best-performing protocol(s), which was then evaluated in a second phase on 2 donors by 6 centres. All centres were able to reliably detect antigen-specific T cells of high/intermediate frequency both ex vivo (Phase I) and post-IVS (Phase I and II). The highest frequencies of antigen-specific T cells ex vivo were mirrored in the frequencies following IVS and in the detection rates. However, antigen-specific T cells of a low/undetectable frequency ex vivo were not reproducibly detected post-IVS. Harmonisation of the IVS protocol reduced the inter-laboratory variation observed for ELISPOT and multimer analyses by approximately 20 %. We further demonstrate that results from ELISPOT and multimer staining correlated after (P < 0.0001 and R (2) = 0.5113), but not before IVS. In summary, IVS was shown to be a reproducible method that benefitted from method harmonisation.

Pineapple (Ananas comosus) cv. pérola ex vitro growth and mycorrhizal colonization affected by in vitro sucrose concentration

The aim of this study was to evaluate the effect of sucrose concentration in the culture medium on growth and on the establishment of mycorrhizas during the acclimatization of pineapple cv. Pérola. The plantlets were micropropagated in MS culture medium with 0, 10, 20 and 30 g L-1 of sucrose and then they were acclimatized during 12 weeks under greenhouse conditions, in a sandy soil - compost mixture, uninoculated or inoculated with a Rhizophagus clarus isolate. Plantlets from the culture medium with 20 g and 30 g of sucrose L-1 showed higher shoot and root biomass than those from sugar-free medium. Mycorrhizal colonization was lower in plantlets micropropagated in sucrose-free medium, but the intensity of arbuscules did not differ among treatments. In the 12-week period of acclimatization, mycorrhizal colonization had no effect on plant biomass.

In vitro culture of Phyllanthus stipulatus (Euphorbiaceae)

An efficient micropropagation protocol was developed for the medicinal plant Phyllanthus stipulatus (Euphorbiaceae) using nodal segments for axillary shoot proliferation. Maximum multiplication rates (8-9 shoots per explant) was achieved on MS media supplemented with either 2.5-5.0 muM IBA. The best basal media for axillary shoot proliferation when 0.62 muM BA was supplemented were MS, MS/2 and AR (4-5 shoots per explant). Rooting was achieved with 100% of the microshoots on MS medium without growth regulators. Regenerated plants were successfully acclimatized and about 88% of plantlets survived under ex vitro conditions. Flowering was observed in 81% of the ex vitro grown plantlets after 12 weeks of acclimatization. High frequency callus initiation and growth was achieved when nodal segment explants were inoculated either in the vertical position, in the light on MS medium supplemented with 5.0 muM NAA or horizontally oriented, in the dark on MS supplemented with 5.0 muM NAA or 1.25-5.0 muM BA or 2iP. Root cultures were successfully established on MS medium containing 1.1 muM NAA. The optimized micropropagation, callus and root culture protocols offer the possibility to use cell/organ culture techniques for vegetative propagation and secondary metabolism studies.

Difference in competence for in vitro proliferation and ex vitro growth of genetically identical mature and juvenile clones of apomictic Malus species

The apomictic system in Malus wits Used Is a model to examine rejuvenation by generating genetically identical tissue culture lines that had two entirely different developmental origins: either embryo-derived tissues (juvenile clones) or somatic tissue from the adult/mature tree (mature clones). These two lines were then subsequently used to examine in vitro difference between mature (M) and juvenile (J) tissues in potential for shoot, root proliferation and ex vitro (glasshouse) growth. The M clones of M. hupehensis and M. toringoides in vitro had significantly fewer total shoots and shoot more than 2 cm in length per proliferating explant than the J clones and also rooted less efficiently. Ex vitro (glasshouse) juvenile clones had shorter internodes, a greater number of leaves and more dry weight compared to their mature counterparts.

Leishmania (Viannia) braziliensis growth in vitro culture relies more on folic acid availability than Leihsmania (Leishmania) amazonensis

We compared the in vitro growth of promastigotes from two Leishmania species in TC-100 and Schneider media. Leishmania (Leishmania) amazonensis replication rates were similar in both tissue culture media and reached maximum rates by 48 h. In contrast Leishmania (Viannia) braziliensis growth was significantly greater in TC-100 but maximum rates were achieved by 96 h. Folic acid appears to be the limiting factor and supplementation of Schneider media with this nutrient improved L. (V.) braziliensis replication rates and decreased the time of maximum replication to 48 h.

More productive in vitro culture of Cryptosporidium parvum for better study of the intra- and extracellular phases

The great difficulties in treating people and animals suffering from cryptosporidiosis have prompted the development of in vitro experimental models. Due to the models of in vitro culture, new extracellular stages of Cryptosporidium have been demonstrated. The development of these extracellular phases depends on the technique of in vitro culture and on the species and genotype of Cryptosporidium used. Here, we undertake the molecular characterization by polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphism of different Cryptosporidium isolates from calves, concluding that all are C. parvum of cattle genotype, although differing in the nucleotide at positions 472 and 498. Using these parasites, modified the in vitro culture technique for HCT-8 cells achieving greater multiplication of parasites. The HCT-8 cell cultures, for which the culture had not been renewed in seven days, were infected with C. parvum sporozoites in RPMI-1640 medium with 10% IFBS, CaCl2 and MgCl2 1 mM at pH 7.2. Percentages of cell parasitism were increased with respect to control cultures (71% at 48 h vs 14.5%), even after two weeks (47% vs 1.9%). Also, the percentage of extracellular stages augmented (25.3% vs 1.1% at 96 h). This new model of in vitro culture of C. parvum will enable easier study of the developmental phases of C. parvum in performing new chemotherapeutic assays.

Influence of substrates and in vitro preconditioning treatments on ex vitro acclimatization of Arachis retusa

The objective of this work was to evaluate the influence of substrate and preconditioning treatments on the acclimatization of in vitro plants of Arachis retusa. Plants were transferred to Plantmax or sand, and fertilized with Hoagland's nutrient solution. Plants maintained in sand, with or without fertilizer, showed the highest survival rates. In order to evaluate the influence of in vitro preconditioning treatments, stem segments were cultured on MS medium supplemented with different sucrose concentrations. The highest survival and developmental rates were observed in plants from two accessions cultured on MS supplemented with 1.5% and 3% sucrose. Flowering and fruit production were observed after five months.

Microenxertia ex vitro para eliminação do vírus CABMV em maracujá-azedo

O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes meios de cultura, utilizados sobre o ponto da enxertia, na microenxertia ex vitro para a eliminação do Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), em plantas de maracujá-azedo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.). Ápices caulinares, provenientes de plantas infectadas, foram microenxertados em plântulas obtidas pela germinação de sementes em substrato comercial esterilizado. Foram conduzidos experimentos com a microenxertia realizada no hipocótilo e no epicótilo, e foram utilizados cinco meios de cultura, que diferiam na concentração de fitorreguladores, aplicados no local da enxertia. O índice médio de microenxertos com folha expandida foi de 27,22 e 32,22%, quando a microenxertia foi realizada no hipocótilo e no epicótilo, respectivamente. Na microenxertia realizada no hipocótilo, não houve efeito da aplicação de meios de cultura. Na microenxertia realizada no epicótilo, o meio MS acrescido de 0,1 mg L-1 de AIB e 1 mg L-1 de BAP proporcionou 53,3% de microenxertos com folha expandida, número superior aos demais tratamentos e maior desenvolvimento das brotações. A indexação realizada pelo teste ELISA indireto, 80 a 100 dias após a microenxertia, mostrou que 93% das plantas testadas não apresentavam vírus detectável.

Microenxertia interespecífica ex vitro em maracujazeiros

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da espécie de Passiflora usada como porta-enxerto no pegamento e desenvolvimento da microenxertia interespecífica ex vitro e caracterizar anatomicamente a região em que ela é realizada. Ápices caulinares de Passiflora edulis f. flavicarpa foram enxertados em hipocótilo de porta-enxertos de P. alata, P. cincinnata, P. edulis e P. setacea. Foram avaliados o desenvolvimento da microenxertia, a ocorrência de brotações adventícias do porta-enxerto e o percentual de microenxertos com folhas expandidas. Os porta-enxertos foram submetidos à avaliação anatômica e histoquímica. O desenvolvimento dos microenxertos e o número de brotações adventícias foram maiores quando se utilizou porta-enxertos de P. edulis e menores com porta-enxertos de P. setacea e P. alata. Porta-enxertos de P. edulis, P. cincinnata, P. alata e P. setacea proporcionaram, respectivamente, 30,3, 10, 1,6 e 0% de microenxertos com folhas expandidas. As avaliações histológicas evidenciaram maior espessura da região cortical em porta-enxertos de P. edulis, enquanto em P. setacea foi observado menor número de camadas corticais, maior quantidade de fibras floemáticas e de alcaloides, características que influenciaram negativamente o resultado da microenxertia.

ENRAIZAMENTO EX VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DO PORTA-ENXERTO DE MACIEIRA M.9

A micropropagação pode ser utilizada para a produção deste porta-enxerto; no entanto, o enraizamento e a aclimatização são pontos de estrangulamento para o uso comercial desta tecnologia. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar diferentes níveis de ácido indolbutírico (AIB) no enraizamento ex vitro e aclimatização simultânea do porta-enxerto de macieira 'M.9'. As bases das miniestacas oriundas do processo de multiplicação in vitro, com 2,5 a 3 cm de altura e dois pares de folhas, foram imersas em AIB nas concentrações de 0; 500; 1000 e 1500 mg.L-1, por 10 segundos. Após, foram transferidas para bandejas de isopor com células contendo 50mL do substrato casca de arroz carbonizada + vermiculita (1:1, v/v). As bandejas foram mantidas durante 30 dias em caixas plásticas cobertas com tampas de vidro para manter o ambiente com alta umidade. Os melhores resultados para a percentagem de enraizamento (82 e 84%) foram obtidos nos tratamentos com 500 e 1000 mg.L-1 , respectivamente. O comprimento das raízes não foi afetado pelos tratamentos aplicados, apresentando média de 4,2 cm. As concentrações maiores de AIB determinaram acréscimos lineares no número de raízes emitidas. Para avaliar a aclimatização, as plantas foram transferidas para casa de vegetação, em bandejas de isopor com alvéolos maiores, contendo o substrato Plantmax® (Eucatex, São Paulo, BR) durante 45 dias. Os maiores índices de sobrevivência das mudas após o transplante para embalagens comerciais (95%) foram obtidos com 500 mg.L-1 de AIB; no entanto, as concentrações de AIB empregadas na indução à rizogênese não modificaram o número e comprimento das raízes, número de folhas e altura das plantas.

Enraizamento ex vitro e aclimatização do porta-enxerto de macieira marubakaido micropropagado

O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao enraizamento e à aclimatização do porta-enxerto de macieira Marubakaido micropropagado e submetido a diferentes substratos e condições de aclimatização antes da transferência para o viveiro. A indução ao enraizamento foi realizada ex vitro, imergindo 1,0 cm das bases das microestacas em uma solução de 1g.L-1 de AIB (ácido indolbutírico) durante 10 segundos. Os tratamentos utilizados foram de 0; 10; 15; 20 e 30 dias na sala de aclimatização, com posterior transferência para a câmara de nebulização, ali permanecendo até completar 30 dias. Como substratos, foram utilizadas as combinações de Terra Roxa Estruturada e Vermicomposto (TRE:V) e Terra Roxa Estruturada e Casca de Arroz Carbonizada (TRE:CAC), na proporção de 1:1 (v:v). Após 30 dias, foram avaliados o enraizamento, a sobrevivência e o crescimento das mudas, que foram então transferidas para casa de vegetação. Após 60 dias de cultivo na casa de vegetação, foram avaliados o número de folhas e a altura da parte aérea, e, após 90 dias, foram repetidas as avaliações efetuadas aos 30 dias. Aos 30 dias, a percentagem de enraizamento no substrato TRE:V foi de 78 % e no substrato TRE:CAC foi de 99%. Essa percentagem diminuiu para 64% no substrato TRE:V e 83% no substrato TRE:CAC aos 60 dias, e manteve-se estável aos 90 dias. O número médio de raízes foi maior em mudas que permaneceram 20 dias em sala de aclimatização e 10 dias em câmara de nebulização, com 16 raízes no tratamento que manteve 0 dia na sala de aclimatização e 30 dias na câmara de nebulização com 14 raízes. O maior crescimento médio das raízes (8,2 cm) aos 90 dias foi no substrato TRE:CAC. O substrato TRE:V possibilitou os melhores resultados médios para parte aérea. Os resultados obtidos indicam a possibilidade de enraizar este porta-enxerto ex vitro, em substrato, simultaneamente com a aclimatização em câmara de nebulização.

In vitro culture of Spondias mombin L. nodal segments

Spondias mombin L. shoot cultures were initiated from nodal explants taken from plants propagated by seeds. Explants coming from 4-6 months old plants, previously disinfected, were cultivated on WPM medium supplemented with a wide range of concentrations of BAP (0.0, 0.22, 0.44, 2.22 and 4.44 muM) and NAA (0.0, 0.27 and 2.70 muM). After four weeks, the responses obtained were axillary shoot and root formation. The first response were preferentially induced with the medium containing only BAP, regardless of the BAP concentration. The addition of NAA on medium reduced significantly axillary shoot formation and induced rhizogenesis. Roots were formed on nodal explant basis, preferentially on medium supplemented with 4.44 muM NAA. The medium supplemented with BAP reduced significantly root formation.

Enraizamento de plântulas de mirtileiro em condição ex vitro com diferentes substratos

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de enraizamento ex vitro de plântulas de mirtileiro cultivares Bluebelle, Woodard e Georgiagem em diferentes substratos. O experimento foi instalado no período de fevereiro a abril/2009, em casa de vegetação, com temperatura de ± 25ºC, na Universidade Federal de Pelotas (UFPel/FAEM), em Pelotas (RS). As plântulas (sete gemas e sete folhas + ápice caulinar), após imersas em AIB (250 mg.L-1) por 10 minutos, foram acondicionadas em bandejas plásticas fechadas, com os seguintes substratos: a) Plantmax®; b) Plantmax® + serragem curtida de pinus (totalmente decomposta); c) serragem curtida; d) Plantmax® + vermiculita expandida de granulometria média, e e) vermiculita expandida de granulometria média. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 3 x 5, sendo três cultivares e cinco substratos, com quatro repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída de 8 explantes. Após 75 dias, avaliaram-se a percentagem de enraizamento das plântulas, a formação de calo, as plântulas sobreviventes, o comprimento e o número de raízes, o comprimento da maior raiz, a altura das plântulas, o número de brotações e a biomassa fresca total. Pode-se concluir que os melhores substratos para enraizamento ex vitro de plântulas de mirtileiro são vermiculita expandida de granulometria média, serragem curtida de pinus e Plantmax® + vermiculita expandida de granulometria média. Maior potencial de enraizamento ex vitro é alcançado com as cultivares Bluebelle e Woodard.

Enraizamento ex vitro e aclimatização de plântulas micropropagadas de amoreira-preta 'Xavante'

O objetivo deste trabalho foi avaliar o enraizamento ex vitro e a aclimatização de plântulas de amoreira-preta 'Xavante'. Este trabalho foi conduzido no Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV/UDESC), em Lages (SC). Na etapa de enraizamento ex vitro, maior número de raízes foi obtido com 320 mg.L-1 de AIB. Observou-se resposta linear crescente em função das doses de AIB para comprimento médio de raízes e massa fresca total das plântulas. Na fase de aclimatização, as plântulas, após seis meses, apresentaram maior massa fresca total com a composição de substrato orgânico Tecnomax® + vermiculita de granulometria média e substrato orgânico Tecnomax®. Assim, para o enraizamento ex vitro de amoreira-preta 'Xavante', recomenda-se a imersão das plântulas em AIB com concentração de 320 mg.L-1 por 5 minutos e indica-se o uso do substrato orgânico Tecnomax® para a etapa de aclimatização.