Estudos funcionais do gene EgTIP2 que codifica uma aquaporina de eucalipto

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Genética) - IBB

Estudos funcionais da rgs-CaM, uma calmodulina envolvida na supressão de silenciamento por RNA

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Surdez em Portugal: estudos genéticos e funcionais do gene da conexina

A surdez é a deficiência sensorial mais comum na população humana, afetando o desenvolvimento social do indivíduo afetado por esta patologia. Estima-se que 50% dos casos de deficiência auditiva podem ser evitáveis. Cerca de 1/1000 recém-nascidos apresentam surdez e 1/3 da população acima dos 65 anos é também afetada. No presente estudo, foram analisadas 19 famílias diferentes. Analisou-se ainda 399 amostras aleatórias de recém-nascidos provenientes das várias regiões de Portugal. Mutações no gene GJB2, que codifica para a Cx26, são a principal causa de surdez hereditária não sindrómica, como tal, foi analisado nos dois tipos de população em estudo, tal como o gene GJB6, que codifica para a Cx30. Nas famílias analisadas foram encontradas as mutações c.35delG, p.Met34Thr e p.R127H, no gene GJB2, as quais se contam entre as mutações mais comuns na população portuguesa. Na população aleatória foram encontradas as mutações c.35delG. p.Met34Thr e K224Q, assim como o polimorfismo F83L. Foram caracterizadas funcionalmente três mutações da Cx26 – a p.Leu213X, p.Gly160Ser e p.Gly160Cys. Verificou-se que as proteínas contendo a mutação p.Leu213X foram observadas principalmente no citoplasma, o que sugere que elas são aí retidas. O défice no seu tráfego para a membrana poderá estar relacionado com o facto de esta mutação originar um codão STOP no domínio C-terminal da proteína. As proteínas que continham a mutação p.Gly160Ser e a p.Gly160Cys são transportadas até à membrana plasmática, tal como a Cx26 selvagem. No entanto, a permeabilidade dos canais intercelulares compostos por Cx26 apresentando estas mutações não foi investigada. Este estudo contribui para o aprofundamento do conhecimento sobre a surdez hereditária e o espectro de mutações no locus DFNB1. Permitiu também a primeira caracterização funcional de três mutações da Cx26. Os estudos funcionais têm em vista a possível aplicação de terapias destinadas à recuperação da função nativa da Cx26.

Sistemas bacterianos competentes em biotransformação humana para estudos mecanísticos e toxicológicos

Devido às limitações de sistemas in vitro atuais, existe uma necessidade de modelos celulares especializados em mimetizar propriamente a biotransformação humana. Além da aplicação destes novos sistemas na avaliação e estudo de toxicidade químicos, estes sistemas permitem o uso em estudos funcionais e mecanísticos de enzimas de biotransformação humanas. Nesta dissertação é abordado o desenvolvimento de modelos celulares competentes em enzimas de biotransformação humanas, aplicado na avaliação de um dos principais metabolitos do fármaco antirretroviral Nevirapina (NVP), como também num estudo mecanístico do importante fator proteico na biotransformação humana, a NADPH citocromo P450 oxido-redutase (CPR). NVP é frequentemente usado no tratamento de HIV-1 e tem sido associado a efeitos adversos como lesões hepáticas e erupções cutâneas severas. Evidências apontam ao envolvimento de citocromos P450 e subsequente sulfonação por sulfotransferases na formação de metabolitos reativos. Contudo, testes padrão in vitro não demonstraram evidências de mutagenicidade ou clastogenicidade. Neste estudo, utilizando uma estirpe de S. typhimurium, competente na expressão controlável e estável de sulfotransferase 1A1 (SULT1A1) humana, demonstrou-se mutagenicidade de 12-hidroxi-NVP dependente de SULT1A1. A enzima CPR está envolvida nas principais reações de biotransformação de xenobióticos, além de interagir com outras proteínas importantes com funções celulares importantes. O mecanismo pelo qual CPR doa eletrões aos seus parceiros redox não é completamente claro. Foi desenvolvido um sistema de E. coli para ser aplicado em estudos mecanísticos sobre a doação de eletrões de CPR. Este novo sistema co expressa CPR e hemeoxigenase I (HO-1) humanas, que depende importantemente de CPR, sendo sustentada por sete eletrões doados por cada ciclo enzimático. As condições de cultura foram otimizadas para níveis de expressão CPR/HO-1 aproximados à estequiometria verificada em humanos. Este modelo células foi aplicado no desenvolvimento de um ensaio de cinética de HO-1, focando-se em vários parâmetros para a sua otimização.

Estudos estruturais com fosfolipases A2 homólogas de veneno botrópicos em presença de íons com importância funcional

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Resistência a cobre em Xanthomonas axonopodis pv. citri. Estudos de caracterização molecular e bioquímica de genes e proteínas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudos estruturais de complexos entre fosfolipases A2 homólogas isoladas do veneno de Bothrops moojeni e inibidores da atividade miotóxica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação vestibular por videonistagmografia de portadores de deficiência crônica de zinco por síndrome do intestino curto

A presença do elemento químico zinco na via auditiva e a sua provável participação na gênese de alguns tipos de disacusia estão bem documentadas, porém não há estudos funcionais que mostrem os impacto da deficiência sistêmica de zinco no sistema vestibular, nem estudos anatômicos descritivos comprovando a existência do íon nas estruturas da via vestibular. OBJETIVO: Este estudo foi realizado com o objetivo de relacionar a alteração na homeostase do zinco com anormalidades do funcionamento da via vestibular. MATERIAL E MÉTODOS: Este é um estudo de casos, retrospectivo, clínico, onde nove indivíduos portadores de deficiência crônica de zinco, entre outros distúrbios nutricionais, consequentes à síndrome de má absorção, foram submetidos à avaliação vestibular. Os resultados deste grupo foram comparados com os resultados de um grupo considerado normal do ponto de vista nutricional (grupo controle). RESULTADOS: Todos os parâmetros da análise vestibular do grupo experimental mostraram-se alterados em comparação com o grupo controle. CONCLUSÃO: A comparação entre os grupos mostrou diferenças significativas em diversos parâmetros da análise vestibular e chamou a atenção para uma possível participação das alterações disabsortivas na origem das desordens vestibulares.

Base molecular da hemocromatose hereditária não-clássica em Portugal

A Hemocromatose Hereditária (HH) é uma doença autossómica recessiva caracterizada pela absorção excessiva de ferro a nível intestinal e sua acumulação em órgãos vitais, podendo originar cardiomiopatia, cirrose e carcinoma hepatocelular. O correspondente diagnóstico molecular é obtido pela associação com genótipos específicos no gene HFE (homozigotia para p.Cys282Tyr ou heterozigotia composta p.Cys282Tyr/p.His63Asp). Contudo, nos países do sul da Europa, cerca de um terço dos doentes com diagnóstico clínico de HH não apresenta os referidos genótipos. Para identificar a base molecular da HH não-clássica em Portugal usaram-se metodologias de pesquisa geral de variantes genéticas (SSCP e dHPLC), Next-Generation Sequencing (NGS) e sequenciação de Sanger, cobrindo seis genes relacionados com o metabolismo do ferro em 303 doentes. Identificaram-se 69 variantes diferentes e de vários tipos, por ex. missense, nonsense, de splicing, que perturbam a transcrição do gene ou a regulação da tradução do mRNA. Seguidamente, realizaram-se estudos in silico e in vitro para esclarecer o significado etiológico de algumas das novas variantes. Concluiu-se que a base molecular desta patologia é bastante heterogénea e que a NGS é uma ferramenta adequada para efetuar a análise simultânea dos vários genes num grande número de amostras. Contudo, o estabelecimento da relevância clínica de algumas variantes requer a realização de estudos funcionais.

Vascularização do útero: estudo morfológico e experimental

RESUMO Os trabalhos de investigação, conducentes à elaboração do presente estudo morfofuncional, subordinado ao tema da "VASCULARIZAÇÃO ARTERIAL DO ÚTERO",fundamenta-se em conceitos da anatomia descritiva clássica, complementados por técnicas de estudo mais modernas, permitindo-nos observações originais. O principal objectivo é de definir um padrão descritivo da vascularização uterina e de estabelecer uma correlação anatomo-fisiológica e anatomo-clínica na descrição da angiomorfologia uterina, actualizando as descrições clássicas da artéria com dados de observação originais, segundo as técnicas de estudo angiomorfológicas correntemente empregues no Departamento de Anatomia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa. Correlacionam-se as observações com os mais recentes dados publicados, no âmbito da imuno-histoquímica e da moderna bioquímica endocrinológica, uma vez que os conceitos modernos de fisiologia uterina e ginecológica praticamente dominam a vasta literatura científica mundial. Como objectivos particulares, ou linhas orientadoras da tese, escolhemos: - A definição de parâmetros descritivos do padrão genérico da vascularização uterina, actualizando a nomenclatura descritiva de acordo com a moderna Nomina Anatomica mundialmente debatida, desde o XIV Congresso Internacional da Federação Internacional das Associações de Anatomistas, sob a presidência do Prof. Doutor J.A. Esperança Pina (1994) e publicada em 1999-2001. - A comparação do caso humano com o do animal de experiência, por observação meticulosa do maior número de casos possíveis, realizando um estudo comparativo que nos permita extrapolar dados de experimentação animal para o caso humano; - O estabelecimento de uma correlação anatomo-fisiológica, por análise do comportamento da vascularização uterina, ao longo da vida, desde o nascimento até à menopausa, e perante as influências hormonais a que se encontra exposta. A tese constrói-se em torno de três núcleos fundamentais: 1. Um capítulo introdutório, de contextualização teórica, por enquadramento histórico dos estudos dos órgãos genitais femininos e da evolução das técnicas de diagnóstico e terapêutica do útero, focando as primeiras referências à técnica da histerotomia (Cesariana) (com a lenda persa do nascimento do herói Rostam, ou do nascimento do deus Asclepius), as primeiras representações da vascularização uterina (por LEONARDO e iii VESÁLIO), ou as primeiras descrições anatómicas do útero, da autoria de Portugueses (RODRIGO DE CASTRO, 1516 e AMATO LUSITANO, 1551). Prossegue a contextualização teórica com breve referência à recente evolução das técnicas de diagnóstico e terapêutica dos fibromiomas uterinos, mencionando de modo particular a evolução das técnicas de embolização arterial uterina, por nos parecer corresponder a um campo de aplicação imediata dos estudos da vascularização do útero. Termina este capítulo com breve referência aos trabalhos do Prof. Doutor J. MARTINS PISCO que tem actualmente, no nosso País uma das mais extensas listas de trabalhos efectuados com sucesso a nível mundial, no campo da embolização arterial de fibromiomas uterinos. 2. O segundo núcleo fundamental, intitulado "Angiomorfologia uterina" corresponde a extensa revisão bibliográfica dos estudos descritivos da vascularização uterina, desde logo ilustrando a resenha teórica com algumas imagens fotográficas de úteros humanos, seleccionadas da nossa colecção. A descrição da vascularização uterina, fundamentada em 1500 citações bibliográficas, organiza-se, de acordo com o paralelismo entre a estratificação histológica e angiológica do órgão, e a hierarquia funcional, regulada pelas cíclicas variações hormonais. Descreve-se a camada serosa e correspondente vascularização; a camada muscular e vascularização do miométrio; e, por fim, a camada mucosa e os vasos endometriais. Verifica-se, perante os dados colhidos da literatura mundial, o interesse do aprofundamento dos estudos morfológicos da microvascularização endometrial e da adaptação das descrições aos resultados dos modernos estudos funcionais obtidos por técnicas da imuno-histoquímica. 3. Fundamentados nos dados colhidos das revisões bibliográficas, elaborámos um projecto de investigação original, visando o estabelecimento da relação morfo-funcional resultante do aprofundamento dos estudos descritivos da angiomorfologia e da microvascularização do útero. O capítulo de trabalho experimental organiza-se em três principais passos: – No capítulo de Materiais e métodos, procede-se à escolha, por um lado do animal de experiência mais adequado para os estudos da vascularização uterina (por estudo comparativo ao longo da escala animal) e, por outro lado, à escolha de três das técnicas disponíveis no Laboratório de Anatomia Experimental e aplicáveis à investigação angiomorfológica do útero; iv - No capítulo de Resultados, procedemos à exposição das nossas observações de 25 úteros humanos e de 154 úteros de animais de experiência, segundo as três técnicas seleccionadas (dissecção, Injecção-corrosão-fluorescência, Injecção-diafanização e injecção-corrosão paraobservação de moldes vasculares em microscopia electrónica de varrimento), organizando aselecção da vasta iconografia coleccionada em três novos subcapítulos: o útero humano, oútero do animal de experiência e um estudo comparativo, essencial para validar osresultados do trabalho experimental. - O capítulo de trabalho experimental, inteiramente efectuado por estudos na artéria uterina do rato Wistar, abrange primeiramente a tentativa de definição macroscópica de territórios de vascularização, seguido das observações microscópicas conducentes à definição dos parâmetros angiomorfológicos característicos de cada uma das etapas da grande variabilidade a que se sujeita a vascularização uterina, ao longo da vida, incluindo a infância, a gravidez, a paridade e o envelhecimento, e consoante as fases do ciclo hormonal ovárico. Aperfeiçoámos essa tarefa com a elaboração de três experiências distintas, para análise dos efeitos microvasculares uterinos da administração exógena de preparados comerciais hormonais, por observação em microscopia electrónica de varrimento. De acordo com as leituras da literatura clássica sobre a metodologia do trabalho científico, completamos os trabalhos por um capítulo de síntese e critica dos resultados, sequencialmente organizado consoante cada um dos passos experimentais atrás referidos. SUMMARY The aim of the present thesis is the description of the uterine arterial network, complementing the classical concepts of descriptive Anatomy with modern techniques of anatomical research, thus achieving original final results and observations. One of the main objectives of the research is to establish physiological and clinical correlations in the description of the uterine angiomorphology, with the techniques currently available for angiomorphological research in the Department of Anatomy of Faculty of Medical Sciences of the New University of Lisbon. As guidelines to our research, we established the following specific objectives: - defining the descriptive parameters of the standard pattern of the uterine vasculature, according to the modern Nomina Anatomica, as underlined in the latest Federative Congresses of the International Federation of the Associations of Anatomists, one of which took place in Lisbon, in 1994, under the presidency of Professor J.A. Esperança Pina, the supervisor of the present works; - comparing the human uterus with the uterus of the experimental animal, to extrapolate the experimental observations in animals to the particular case of the human uterus; - establishing a correlation between the physiology and the anatomical observations of the uterine vasculature throughout life, from childhood to menopause and in relation to the hormonal influences to which the uterus is exposed. The thesis is built around three main chapters: 1) The introduction chapter defines the historical framework of the studies of the female genital anatomy and the historical evolution of the clinical management of common uterine diseases, focusing on the first historical references to the Caesarean section (such as the Persian legend of the birth of the hero ROSTAM, or that of the birth of ASCLEPIUS, the Greek god of Medicine); the first depictions of the uterine vasculature (by LEONARDO and VESALIUS) or the first anatomical descriptions of the uterus, by Portuguese authors (RODRIGO DE CASTRO, 1517, or AMATUS LUSITANUS, 1551). The theoretical context proceeds, with reference to the recent evolution of the clinical and surgical management of uterine fibroids, and a particular mention to the modern techniques of Uterine Fibroid Embolisation, which corresponds to one of the fields of interest of the anatomic studies of uterine arterial vascularization. 2) The second chapter, devoted to the anatomical description of the Uterine Angiomorphology, is based on an extensive review of the available Medical literature,illustrated by a selection of our own research observations of the human uterine vasculature. The description is organized in view of the parallelism between histological and angiological stratification and the functional hierarchy, under the control of the cyclic hormonal variations. Each layer of the uterine wall is depicted with photographs of the human uterus and descriptions of its specific vascular network: the serosa, the muscular Myometrium, and the mucosa, or endometrium. This classical description, based on extensive quotations of the international scientific literature, enhances our interest for the research of a more detailed knowledge of the endometrial microvascular network, accordingly to the modern physiologic results obtained through immunohistochemical studies. 3) The results of our experimental research, aiming to establish the intimate relationship between the anatomical and functional studies of uterine vasculature, are organized in three main steps: - The chapter of Materials and Methods debates the choice of the experimental animal, based on a short review of the comparative anatomy of the uterus, and uterine physiology, throughout the animal scale. The selection of three fundamental techniques of anatomic research is made from the current variety available in the Laboratory of Experimental Anatomy of the Lisbon School of Medical Sciences. - The Results of our personal research and observations of 25 human and 154 animal uteri,after dissection, and the techniques of arterial injection for the preparation of fluorescent corrosion casts, of vascular injection and clearing, and of arterial injection and preparation of corrosion casts for Scanning Electron Microscopy are rganized in terms of human or animal macroscopic anatomy and microvascular network, followed by a summary of the comparative anatomy of human and rat uteri, which is essential to validate the resultant experimental observations of the rat endometrial microvasculature. - The experimental research is entirely devoted to the uterine artery of the Wistar rat. The first step consists of the attempt to define macroscopic territories of vascularization, followed by microscopic observations for the definition of the angiomorphological pattern that is characteristic of each stage of the extreme variations to which the uterus is subject throughout life, from childhood to sexual maturity, throughout the hormonal cycle, in pregnancy, according to parity, and through ageing. We complete these observations with the experimental exposure of the Wistar rat uterus to pharmacologic preparations of hormones, currently available in clinical practice, and observations of the vascular uterine changes in Scanning Electron Microscopy. The outcome results of our anatomical observations are followed by a critical synthesis of the results.

Estudo do gene FOXE1 e identificação de novos genes de susceptibilidade para o cancro da tiróide familiar

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Produção de progesterona in vitro pelas células do corpo lúteo bovino ao longo da gestação

O presente trabalho foi desenvolvido para testar a hipótese de que células luteínicas bovinas em cultivo, provenientes dos três terços de gestação, comportam-se da mesma maneira que células in vivo em relação à produção de P4. Foram coletadas amostras de corpos lúteos (CL) de 90 (n=3), 150 (n=3) e 210 (n=3) dias de gestação obtidos em abatedouro. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 poços. Após 24 horas de cultivo foram feitas a lavagem dos poços e a adição do precursor pregnenolona. Os tratamentos foram realizados em octuplicata para cada tempo de tratamento (24, 48 e 96 horas) com três repetições de cada período gestacional. As amostras de meio de cultura e as células foram coletadas 24, 48 e 96 horas após adição do precursor e acondicionadas em freezer a -20ºC até o processamento. A progesterona foi dosada através de radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os resultados foram analisados estatisticamente e considerados diferentes quando p<0.05. Foi observada maior produção de P4 aos 90 dias de gestação (35,277±0,075), posterior decréscimo aos 150 dias (28,820±0,231) e novo aumento aos 210 dias (32,777±0,099). A produção de P4 em células cultivadas por 24 horas foi maior (p<0,05) em células oriundas do grupo de 90 dias (2,912±0,047) quando comparado a 150 (2,669±0,137) e 210 dias (2,741±0,088). As 48 e 96 horas de cultivo, células luteínicas bovinas de 90 dias produziram mais P4 que células de 210 dias (2,934±0,029 e 2,976±0,121 respectivamente x 2,760±0,059 e 2,695±0,149, respectivamente; p<0,05), que por sua vez produziram mais do que células de 150 dias (2,334±0,084 para 48 horas e 2,205±0,136 para 96 horas). Aos 150 dias de gestação a produção de progesterona apresentou diminuição gradativa ao longo das 96 horas de cultivo. Essas diferenças podem ser explicadas pela expressão gênica diferencial de enzimas ou também de fatores presentes na cascata esteroidogênica de acordo com a idade gestacional. Este modelo de cultura celular luteínica poderá ser utilizado em estudos funcionais uma vez que o padrão de secreção de P4 mimetizou o que ocorre in vivo.

O papel das argininas α-92 e α-141 na regulação da função de hemoglobinas por íons cloreto

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Abordagens biossintéticas em piper tuberculatum auxiliada pela síntese de precursores fenilpropanoídicos

Pós-graduação em Química - IQ

Amplificação, clonagem e sequenciamento de promotores de café (Coffea arabica cv Mundo Novo) específicos de fruto e ubíquos

The Coffee Genome Project made available to the scientific community relevant information that made practical the identification and cloning of important genes, as well as the identification of the major sequences involved on their regulation. The aim of the present study was to amplify, clone and sequence coffee promoters with specific expression patterns. For that, coffee ESTs which known expression profiles were employed. First, the promoter regions of coffee genes showing, respectively, fruitspecific and ubiquitous expression were amplified using the Genome Walking strategy. Amplified sequences were then inserted in the pGEM-Teasy vector (Promega) and sequenced. Once completed the sequencing, an expression cassette was constructed using the binary vector pCAMBIA-1381z (Cambia). These expression cassettes were cloned into Agrobacterium tumefaciens, and transgenic tobacco plants were generated aiming the functional characterization of these promoters