Imunossensores Eletroquímicos para o Diagnóstico Precoce e Descentralizado do Cancro da Mama

O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Entre as mulheres, o cancro da mama é o mais frequente. A deteção precoce do cancro é de extrema importância na medida em que pode aumentar as possibilidades de cura dos pacientes e contribuir para a diminuição da taxa de mortalidade desta doença. Um método que tem contribuído para a deteção precoce do cancro é a análise de biomarcadores. Biomarcadores associados ao cancro da mama, como o Recetor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER2) e o Antigénio Carbohidratado 15-3 (CA 15-3), podem ser detetados através de dispositivos como os biossensores. Neste trabalho foram desenvolvidos dois imunossensores eletroquímicos para a análise de HER2 e CA 15-3. Para ambos os sensores foram utilizados, como transdutores, elétrodos serigrafados de carbono. A superfície destes transdutores foi nanoestruturada com nanopartículas de ouro. Foram realizados imunoensaios não-competitivos (do tipo sandwich) em ambos os imunossensores, cuja estratégia consistiu na (i) imobilização do respetivo anticorpo de captura na superfície nanoestruturada dos elétrodos, (ii) bloqueio da superfície com caseína, (iii) incubação com uma mistura do analito (HER2 ou CA 15-3) e o respetivo anticorpo de deteção biotinilado, (iv) adição de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (S-AP; a AP foi utilizada como marcador enzimático), (v) adição de uma mistura do substrato enzimático (3-indoxil fosfato) e nitrato de prata, e (vi) deteção do sinal analítico através da redissolução anódica, por voltametria de varrimento linear, da prata depositada enzimaticamente. Com as condições experimentais otimizadas, foi estabelecida a curva de calibração para a análise de HER2 em soro, entre 15 e 100 ng/mL, obtendo-se um limite de deteção de 4,4 ng/mL. Para o CA 15-3 a curva de calibração (em solução aquosa) foi estabelecida entre 15 e 250 U/mL, obtendo-se um limite de deteção de 37,5 U/mL. Tendo em conta o valor limite (cutoff value) estabelecido para o HER2 (15 ng/mL) pode-se comprovar a possível utilidade do imunossensor desenvolvido para o diagnóstico precoce e descentralizado do cancro da mama. No caso do CA 15-3 serão necessários estudos adicionais para se poder avaliar a utilidade do imunossensor para o diagnóstico do cancro da mama.

Lab on paper: biossensores colorimétricos de papel para a detecção de membros do complexo Mycobacterium tuberculosis

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto Lab on Paper, desenvolvido no Centro de Investigação de Materiais (CENIMAT) da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT - UNL)

Development of a novel aptamer-based multi-sensor device for the detection of osteopontin

Doctoral Dissertation for PhD degree in Chemical and Biological Engineering

Biosensor para el diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias

La infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) y el Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) afecta a millones de personas en todo el mundo, y constituye una amenaza a la salud y la vida de muchas otras más, sobre todo en países en vías de desarrollo. Existe un gran interés en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el diagnóstico de dicha enfermedad de forma rápida, económica y fuera del ámbito del laboratorio por personal no especializado. Los biosensores son dispositivos ideales para cubrir esta demanda analítica facilitando la toma de decisiones y permitiendo un uso racional de técnicas analíticas confirmatorias más costosas. Se plantea el diseño de una estrategia magneto-ELISA con detección óptica así como un dispositivo magneto biosensor electroquímico para el diagnóstico de SIDA a través del recuento de células marcadoras de la enfermedad presentes en la sangre. Ambas estrategias se basan en la captura inmunomagnética de linfocitos T CD4+ con partículas magnéticas modificadas con anticuerpos monoclonales específicos (anti-CD3). La detección de las células capturadas se realiza con un anticuerpo primario anti-CD4 marcado con biotina (antiCD4-biotina) y con un conjugado de estreptavidina y de la enzima HRP (peroxidasa de rábano picante). La unión de esta enzima al anticuerpo primario se realiza a través del complejo biotina/estreptavidina. Se proponen dos tipos de sistemas de detección: óptico y electroquímico. Esto se logra mediante la elección adecuada del sustrato para cada sistema planteado. El dispositivo biosensor basados en un transductor electroquímico renovable y magnético acoplado a partículas magnéticas específicas para las células marcadoras de la enfermedad, consigue la simplificación metodológica y facilita la transferencia de la tecnología hacia la fabricación de un biokit diagnóstico en el ámbito clínico. La potencial aplicación de los dispositivos analíticos propuestos en este trabajo tienen un interés social elevado por su idoneidad para realizar análisis, rápidos, económicos y en el ámbito de la propia consulta médica.

Influência da localização do tumor na expressão tecidual da proteína p53 em doentes com câncer colorretal: estudo de 100 casos

OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi verificar, se existem diferenças na expressão tecidual da proteína p53 segundo a localização do tumor em doentes com câncer colorretal. MÉTODO: Foram estudados 100 doentes (54 mulheres), com média de idade de 59,8 anos com adenocarcinoma colorretal. A expressão da proteína p53 foi analisada por imunoistoquímica, com anticorpo monoclonal anti-p53 pela técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase. A expressão tecidual da proteína p53 foi relacionada às variáveis: gênero, idade, grau histológico, tipo histológico, tamanho do tumor, estadiamento TNM, profundidade de invasão da parede intestinal, comprometimento linfonodal, invasão angiolinfática, localização do tumor no intestino grosso em relação à flexura esplênica. Na avaliação estatística da relação entre expressão da proteína p53 e as variáveis consideradas empregou-se o teste qui-quadrado, estabelecendo-se nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: A proteína p53 foi positiva em 77% dos casos. Com relação as diferentes variáveis consideradas verificou-se maior tendência de expressão da proteína mutante quando se considerava a idade (p=0,001), grau histológico (p=0,001), tipo histológico (p=0,001), estádios tardios da classificação TNM (p=0,001), maior profundidade de invasão na parede cólica (p=0,001), comprometimento linfonodal (p=0,001), invasão angiolinfática (p=0,02), localização após a flexura esplênica (p=0,001), não se encontrando relação com gênero (p=0,49) e tamanho do tumor (p=0,08). CONCLUSÃO: Os resultados do presente estudo permitem concluir que a expressão da proteína p53 mutante ocorre com maior freqüência nos tumores localizados a partir da flexura esplênica.

Identificação imuno-histoquímica de Listeria monocytogenes em placentas fixadas em formol e embebidas em parafina

OBJETIVOS: identificar Listeria monocytogenes (Lm) em placentas humanas pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e relacionar sua presença com as alterações histológicas encontradas com as alterações histológicas encontradas no exame convencional, com o trimestre gestacional, a idade das gestantes, casos de aborto e parto prematuro e a ocorrência de aborto habitual. MÉTODOS: um estudo retrospectivo foi realizado no setor de patologia de um hospital-escola de Porto Alegre no ano 2000. O material dos blocos de parafina de 254 placentas (exames anatomopatológicos), provenientes de aborto, de parto prematuro e de nascimento a termo, foi analisado pela técnica histológica convencional com a coloração de hematoxilina e eosina (HE). A técnica de IHQ foi realizada no material de 148 exames anatomopatológicos, que apresentaram alterações inflamatórias, hemorragia, necrose e trombose, utilizando anticorpo policlonal Rabbit A "Listeria monocytogenes" B65420R (Biodesign®) na diluição 1:1000 e complexo avidina-biotina-estreptavidina. O teste c² foi aplicado para a análise estatística. RESULTADOS: a presença de Lm foi identificada em 33,7% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que estiverem associadas a diferença significativa nas placentas positivas. Lm esteve presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestre gestacional. Não houve associação entre idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro e a presença ou ausência de Lm nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem Lm no tecido placentário. CONCLUSÃO: a técnica de IHQ pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em todos os trimestres gestacionais.

Utilização de três métodos imuno-histoquímicos na detecção de aspergilose e zigomicose em animais

Visando a otimização do uso da técnica de imuno-histoquímica (IHQ) na detecção de Aspergillus spp. e zigomicetos (membros da família Mucoraceae), utilizaram-se dois anticorpos monoclonais fungo-específicos em fragmentos de tecidos de animais (fixados em formol e embebidos em parafina) com diagnóstico histomorfológico prévio de aspergilose e zigomicose, os quais foram submetidos a três sistemas de detecção diferentes (dois biotinilados e um não biotinilado). Os dois anticorpos apresentaram alta especificidade e sensibilidade nos tecidos examinados. Não ocorreram reações cruzadas entre os anticorpos utilizados e os agentes etiológicos avaliados (incluindo casos de aspergilose, zigomicose, candidíase e pitiose). No entanto, reações inespecíficas foram observadas nas hifas em alguns casos, as quais puderam ser eliminadas através de um dos métodos de detecção utilizados. Para a aspergilose, o método da estreptavidina-biotina-fosfatase alcalina não apresentou reações inespecíficas nas hifas. Enquanto que nos casos de zigomicoses, as reações inespecíficas não ocorreram no método por polímero (não biotinilado). A técnica de IHQ mostrou-se uma ferramenta muito útil na detecção e confirmação dos casos de aspergilose e zigomicose neste estudo retrospectivo.

Mastocitose na infância : estudo anátomo-patológico e imuno-histoquímico

Introdução A mastocitose abrange um grupo heterogêneo de condições crônicas caracterizado pela proliferação excessiva de mastócitos nos tecidos. Os sinais e sintomas clínicos são decorrentes da distribuição anatômica dos mastócitos e do efeito funcional dos mediadores produzidos e liberados por estas células. Na infância, a doença é considerada uma condição benigna na maioria dos casos, cujo comprometimento característico é o cutâneo. As mais freqüentes manifestações na pele são os mastocitomas e a urticária pigmentosa. Lesões cutâneas bolhosas podem manifestar-se e acompanhar todas as formas de mastocitose e quando esta apresentação é a predominante, é denominada de mastocitose bolhosa. O diagnóstico de mastocitose é suspeitado clinicamente e confirmado pela histologia. A demonstração do aumento do número de mastócitos nas lesões cutâneas características se constitui no principal critério diagnóstico. Contudo, este método tem dificuldades técnicas que impedem a adequada reprodutibilidade dos achados, dificultando a elucidação de casos duvidosos e retardando seu tratamento. Considerando as propriedades imunológicas e a importância clínica dos mastócitos reveste-se de maior importância compreender o papel destas células nas doenças, sendo indispensável identificá-las e enumerá-las com acurácia nos tecidos. Objetivos Quantificar o número de mastócitos marcados com anticorpo monoclonal antitriptase, através de técnica imuno-histoquímica e análise de imagem, em biópsias cutâneas de crianças, com diagnóstico clínico de mastocitose. Descrever os achados histológicos; quantificar o número de mastócitos marcados com o anticorpo antitriptase entre as diferentes expressões clínicas da mastocitose cutânea; comparar o número de mastócitos entre os casos de mastocitose cutânea e mastocitose associada à sintomas sistêmicos e correlacionar as contagens de mastócitos entre os dois diferentes métodos (coloração por Giemsa com contagem manual e marcação com anticorpo antitriptase e análise digital). Material e Método Foram incluídas no estudo biópsias cutâneas de crianças de 0 a 14 anos, com diagnóstico clínico e histológico de mastocitose. Os casos foram classificados de acordo com a apresentação clínica cutânea em mastocitoma, urticária pigmentosa ou mastocitose bolhosa e assinalada a presença de sintomas sistêmicos associados. Os fragmentos de pele fixados em formalina e emblocados em parafina foram cortados e utilizados para diagnóstico histopatológico convencional, corados com hematoxilina-eosina e Giemsa, e para análise imuno-histoquímica com estreptavidina peroxidase marcados com anticorpo antitriptase. A densidade de mastócitos (número de células por área) foi realizada por um único observador na técnica histológica e através de um sistema de análise de imagem de vídeo no método imuno-histoquímico. Resultados Foram avaliados 33 casos de mastocitose, sendo 21 do sexo masculino. Dez casos (30,3%) apresentavam mastocitoma, 21 (63,6%) urticária pigmentosa e 2 (6,1%) mastocitose bolhosa. Todos os casos da amostra foram classificados como tendo mastocitose incipiente e em 6 (18,8%) pacientes pôde ser identificada a associação com sintomas sistêmicos. Prurido foi o sintoma mais freqüente, sendo relatado em 21 casos. Em 21 dos 33 casos foi identificada a infiltração de mastócitos na derme havendo predominância pela região perivascular (p=0,001, teste exato de Fisher). Não houve diferenças significativas entre a presença de infiltrado mastocitário e as várias formas cutâneas de mastocitose ou a mastocitose sistêmica. A presença de eosinófilos foi identificada em 15 casos (45,5%) e em 10 casos associadamente ao infiltrado perivascular de mastócitos. A densidade de mastócitos na técnica histológica, incluindo-se todos os casos, foi 50,00 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre os pacientes com e sem sintomas sistêmicos associados aos cutâneos. A densidade de mastócitos encontrada com a técnica imuno-histoquímica e contagem por análise de imagem foi 158,85 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre aqueles com e sem sintomas sistêmicos. Comparando-se a contagem dos mastócitos por área (densidade) entre a histologia e a imuno-histoquímica houve uma diferença significativa (p=0,0001 teste não-paramétrico de Wilcoxon). A média da diferença entre as contagens foi 199,98 células/mm2 (±365,31 DP). Também não houve semelhança, entre os dois métodos, nos grupos mastocitoma e urticária pigmentosa (p=0,005 e p=0,01, respectivamente, teste não-paramétrico de Wilcoxon). Puderam ser identificados 518% a mais de mastócitos com a técnica imunohistoquímica quando comparada com a histológica. Conclusões O presente estudo permite concluir que: 1) a localização preferencial da infiltração de mastócitos é dérmica e perivascular, não sendo possível identificar diferenças histológicas entre casos de urticária pigmentosa e mastocitoma; 2) o número de mastócitos marcados com o anticorpo monoclonal antitriptase e contados com análise digital de imagem, em biópsia de pele de crianças com diagnóstico clínico de mastocitose, foi 159 células por milímetro quadrado; 3) a densidade de mastócitos, foi semelhante entre os casos de urticária pigmentosa e mastocitoma e entre os casos com e sem sintomas sistêmicos associados nas duas diferentes técnicas empregadas; 4) o número de mastócitos por milímetro quadrado com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi significativamente maior quando comparada com a coloração através de Giemsa e a contagem manual, com uma diferença média entre os dois métodos de 200 células por milímetro quadrado; 5) a densidade de mastócitos com a técnica imunohistoquímica foi significativamente maior tanto nos casos com urticária pigmentosa quanto nos com mastocitoma, quando comparada com a técnica empregada rotineiramente e 6) com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi possível identificar 518% a mais de mastócitos quando comparada com a técnica histológica.

Relação da ciclooxigenase-2 com VEGF e a caspase-3 nas neoplasias mamárias de cadelas

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Expressão imuno-histoquímica de metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) e de inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1) em neoplasias de glândulas salivares

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeitos da membrana amniótica homógena associada ao laser arseneto de gálio-alumínio (λ=660) na reparação de mucosite oral em ratos tratados com 5-fluoruracila: análise histológica e imunohistoquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Desenvolvimento de um biosensor amperométrico para a detecção do vírus da Hepatite C

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Construção de genossensor amperométrico para diagnóstico da hepatite C baseado em monocamadas auto montadas e detecção não marcada

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Desenvolvimento de dispositivos para diagnósticos e genotipagem de Hepatite C

Pós-graduação em Química - IQ

Quantificação do fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I) em plasma bovino por ELISA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)