Implementação de um espectrómetro de massa do tipo tempo de voo reflectrão

Processos de troca de carga em colisões átomo-molécula têm elevada importância em estudos a nível molecular pois encontram-se presentes em diversos mecanismos. Após interacção do átomo dador de electrão (potássio) com o alvo molecular em fase gasosa, há transferência de electrão para este, promovendo a formação de iões negativos. Os fragmentos aniónicos formados são analisados pela razão massa/carga recorrendo à técnica de espectrometria de massa do tipo tempo de voo. O aparelho de feixes cruzados existente no Laboratório de Colisões Atómicas e Moleculares do CEFITEC, é constituído por um espectrómetro de massa do tipo tempo de voo linear com uma resolução em massa de 120. De forma a aumentar o poder de resolução para cerca de 3000, no âmbito desta dissertação procedeu-se ao dimensionamento de um espectrómetro de massa do tipo tempo de voo reflectrão, a instalar oportunamente. Simultaneamente foram estudados processos de troca de carga em colisões de potássio-adenina. Os padrões de fragmentação obtidos nestes processos foram analisados tendo em conta a energia de colisão do feixe incidente. Adicionalmente, e de forma a complementar estes estudos, foram analisados vários caminhos de fragmentação através de métodos de teoria de densidade de funcional (DFT), com os funcionais BLYP, B3LYP e CAM-B3LYP.

Um sensível espectrômetro de massa de fonte sólida e sua aplicação à análise de K, Rb e Sr

Um espectrômetro de massa de fonte sólida de alta sensibilidade e construído de vidro Pyrex é descrito com detalhe. Um sistema de vácuo convencional, constituído de uma bomba mecânica e uma bomba de difusão de mercúrio de duplo estágio, possibilita obter-se, após cerca de 6 horas de contínuo bombeamento, pressão adequada para início de análise de materiais sólidos pela técnica de ionização térmica. Por esta técnica, quantidades tão pequenas quanto alguns micromicrogramas de potássio ou rubídio podem ser analisadas, enquanto que para estrôncio, quantidades tão pequenas quanto 0,1 μg podem ser dosadas. É apresentada também a precisão média obtida na análise desses elementos, bem como a precisão na medida das razões isotópicas. Finalmente, uma série de resultados obtidos em diferentes tipos de rochas empregando-se tal aparelho, é submetida a estudos estatísticos para melhor aquilatar o comportamento do mesmo.

Implementação da Técnica de Dessorção Térmica Programada (TPD) usando Espectrometria de Massa Quadrupolo

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Física

Identificação e quantificação de adutos covalentes formados entre a valina Nterminal da hemoglobina e o fármaco nevirapina em doentes de HIV: Desenvolvimento e validação de um método analítico por espectrometria de massa de alta resolução

A nevirapina é o fármaco antirretroviral mais utilizado nos países em desenvolvimento para combater o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Apesar dos seus efeitos benéficos, a nevirapina tem sido associada a casos de hipersensibilidade cutânea e hepatoxicidade graves ou mesmo fatais. Estudos recentes sugerem o envolvimento da bioactivação do seu metabolito de Fase I, 12-OHNevirapina, a espécies electrofílicas capazes de formar adutos covalentes com proteínas. A identificação dos adutos formados, por esta via de bioactivação, com a valina N-terminal da hemoglobina (Hb) isolada de doentes sob terapêutica com a nevirapina foi já efectuada. A técnica analítica utilizada envolveu a utilização do método de derivatização N-alquilo Edman que, por reacção com fenilisotiocianato (PITC), permite destacar o aduto formado com o resíduo N-terminal da Hb, sob a forma de uma hidantoina, que foi posteriormente analisado e quantificado por cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa de tandem por ionização de electrospray. O presente trabalho teve como objectivo inicial optimizar o procedimento experimental envolvido no procedimento de N-alquilo Edman, tendo-se inicialmente comparado a sensibilidades obtidas mediante a utilização de dois agentes derivatizante: o PITC e o isotiocianato de fluoresceína (FTIC). Este processo inicial permitiu estabelecer que a utilização do PTIC como agente de derivatização conduzia a melhores resultados, tendo-se prosseguido com o desenvolvimento e a validação do método analítico para a quantificação deste aduto por cromatografia líquida acoplado a espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O método analítico desenvolvido apresentou recuperações entre 36 e 57 %, supressão de sinal de 19 % e um limite de quantificação (LOQ) de 1,4 ppb (média da exactidão = 98 %; CV = 5 %). A metodologia validada foi depois aplicada na quantificação de adutos de nevirapina em duas amostras de Hb isolada de doentes de HIV e os níveis de adutos obtidos foram de 95 e 92 pmol/g de Hb.

Espectrometria de massa para análise isotópica dos bio-elementos

Mass spectrometry is an analytical technique widely used in several areas of academic research. It allows the knowledge of the information about the micro-world of atoms leading to significant advances in science today. The analysis of stable isotopes of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen and sulfur, also known as bio-elements, shows itself as a major area of interest in using the proposed method. The development of techniques and equipment coupled with mass spectrometry promises to deliver even greater progress in this field, in particular, for the biological sciences and related areas. The pyrolytic method in reduction of organic compounds at high temperatures provides simultaneous isotopic analysis of bio-elements H and O, by the gases released, H2 and CO after the pyrolitic process, significantly reducing analysis time and the amount of material to sample. This paper presents a review of mass spectrometry with its basic principles of operation, and pyrolytic method for reducing compounds at temperatures above 1400 ° C for isotopic analysis of bio-elements

Expressão de glicoesfingolipídeos no carcinoma espinocelular do trato aerodigestivo superior

Os glicoesfingolipídios (GSLs) são importantes componentes da membrana celular, organizados em microdomínios, relacionados a receptores de membrana e comportamento anti-social da célula neoplásica como crescimento descontrolado, invasão e ocorrência de metástases. OBJETIVO: Como a expressão de GSLs no carcinoma espinocelular (CEC) é tema pouquíssimo estudado decidiu-se realizar estudo prospectivo visando avaliar a expressão de GSLs no CEC do trato aerodigestivo superior. MÉTODO: Coletou-se 33 amostras de CEC e mucosa normal e GSLs extraídos e purificados por cromatografia de fase reversa em coluna de C-18 e hidrólise alcalina em metanol. Os GSLs foram quantificados por densitometria das placas de cromatografia de alta resolução em camada delgada coradas com orcinol. RESULTADOS: Observou-se aumento significativo de GSLs no CEC (3,57µg/mg) em comparação à mucosa normal (1,92µg/mg), principalmente do monosialogangliosídeo (GM3), trihexosilceramida (CTH), dihexosilceramida (CDH), globosídeo (Gb4). A expressão de monohexosilceramida (CMH) foi semelhante no CEC e na mucosa normal. O aumento do GM3 no CEC foi demonstrado por métodos imunoquímicos empregando-se MAb DH2 (anti-GM3). Analisando-se os carboidratos do CMH por cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massa constatou-se que a mucosa normal expressa glucosilceramida e o CEC glucosilceramida e galactosilceramida. CONCLUSÃO: O aumento de GSLs no tecido tumoral pode representar alterações dos microdomínios da membrana celular resultantes do processo de transformação maligna, responsáveis por uma maior interação célula-célula e célula-matriz aumentando seu potencial de infiltração e metástase, possibilitando o emprego dos GSLs e de MAbs no diagnóstico e no tratamento do CEC, a exemplo do que ocorre no melanoma.

Rastreio neonatal da homocistinúria clássica revela uma elevada frequência da deficiência em MAT I/III na Península Ibérica

A homocistinúria devida à deficiência da enzima cistationina -sintetase ou “homocistinúria clássica” é uma doença metabólica rara (1/344 000 RN), de transmissão autossómica recessiva e caracterizada por elevada heterogeneidade clínica, que frequentemente contribui para o diagnóstico tardio. Existe tratamento efetivo, se instituído antes de se instalarem sintomas irreversíveis, pelo que tem sido incluída num número considerável de programas de rastreio neonatal. O rastreio baseia-se na determinação dos níveis plasmáticos de metionina, por espectrometria de massa em tandem (ms/ms), mas conduz à identificação de muitos casos falsos-positivos, portadores de uma condição com significado clínico não completamente esclarecido, a deficiência em metionina adenosiltransferase (MAT I/III). Ambas as condições são rastreadas na Galiza e em Portugal desde 2000 e 2004, respetivamente. Desde então, foram identificados três doentes com homocistinúria clássica e 44 doentes com deficiência em MAT I/III. Uma forma dominante, e aparentemente benigna, desta última condição, associada à mutação p.R264H, parece ser muito frequente na Península Ibérica. A implementação de um teste de segunda linha, consistindo na determinação da homocisteína total, permitiria reduzir consideravelmente o número de RN identificados com deficiência em MAT I/III e melhorar a especificidade e valor positivo preditivo do rastreio da homocistinúria clássica.

Implementação de sistemas para controlo e monitorização de equilíbrio, cinética e dinâmica de adsorção

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Controlo e aquisição de dados no aparelho Posch ToF-SIMS

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Física

Célula de permeação a temperatura controlada

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para oBanho Termostatizadoenção do grau de Mestre em Engenharia Física

Gerador de misturas gasosas binárias de grande diluição

A indústria corticeira em Portugal tem uma grande importância a nível económico, social e ambiental. A cortiça utilizada para a produção de rolhas por vezes encontra-se contaminada com 2,4,6-Tricloroanisole. O TCA é o principal responsável pelo odor a “mofo” do vinho, encontrando-se presente em cerca de 80% dos vinhos contaminados. O objetivo primordial desta tese foi produzir uma fuga de referência rastreável de TCA para ser utilizada como calibrador na indústria corticeira. Desenvolveu-se um sistema capaz de gerar diluições de TCA em Ar e N2 com concentrações abaixo do ppb. A concentração gerada é calibrável a partir da pressão de vapor do TCA, da pressão do árgon que é o gás de arrasto e da densidade de fluxo de N2. A primeira diluição foi obtida colocando dentro de um reservatório TCA sólido e Ar gasoso. De seguida associou-se a esta diluição uma fuga (capilar estrangulado que é uma pequena restrição que proporciona a evacuação de gás com reduzida condutância) com um determinado fluxo. Confirmou-se que o escoamento estava em regime viscoso e que não era seletivo, isto é, se a razão do fluxo do TCA e de Ar seguia a razão das pressões parciais dos mesmos. Esta confirmação foi feita pressurizando o mesmo reservatório com Árgon e Xénon e verificando se o fluxo de cada um dos gases debitado através da fuga era proporcional à respetiva pressão parcial dentro do reservatório. Estas medições foram feitas por comparação com duas fugas de referência de Ar e de Xe utilizando um espectrómetro de massa do tipo quadrupolo. As fugas de referência também foram construídas no âmbito desta dissertação. Depois de verificado que os fluxos debitados pela fuga eram proporcionais às pressões parciais, o fluxo proveniente da primeira diluição, de TCA em Ar, encontra-se com um outro fluxo, muito maior de N2, gerando assim diluições de TCA na ordem dos ppt.

Utilização de isótopos estáveis de 13C e 15N na identificação de bacalhau Gadus e outras espécies de peixes salgados secos

O Brasil é dos países líderes na importação de peixes salgados e secos. Em 2008, importou da Noruega cerca de 30 mil toneladas destes produtos, a um custo de aproximadamente 190 milhões de dólares. O bacalhau é um produto salgado e seco bastante apreciado no país, mas espécies afins, de menor valor comercial, são também utilizadas na fabricação de peixes salgados secos e muitas vezes comercializadas como o bacalhau do Atlântico (Gadus morhua). A variação da razão de isótopos estáveis de carbono (13C/12C) e de nitrogênio (15N/14N) é medida com alta precisão por espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) e nos últimos 20 anos tem aumentado significativamente a aplicação desta tecnologia na avaliação de fraudes e adulterações dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi utilizar isótopos estáveis de 15N e 13C na identificação de bacalhau e espécies afins. Utilizando a análise isotópica, em músculos e ossos, foi possível diferenciar o bacalhau (do Atlântico e do Pacífico) de Ling, Zarbo e Saithe (p < 0,01), que são três produtos salgados e secos de menor valor comercial. Com a pele não foi possível tal distinção entre bacalhau do Pacífico e Ling (p > 0,05). A combinação de análises de valores de 15N de diferentes tecidos – músculo, pele e ossos – possibilitou a separação das espécies. A comparação gráfica de valores de 15N de músculo vs. pele, músculo vs. ossos e pele vs. ossos permite estabelecer três regiões de confiança: uma com bacalhau do Atlântico e bacalhau do Pacífico; outra com Ling e Zarbo; e finalmente, uma terceira região com o Saithe isolada de todos. Os resultados obtidos demonstram que a metodologia é viável para a distinção entre bacalhau e outros peixes salgados secos. No entanto, conclusões mais seguras serão obtidas com uma base de dados, para que, isotopicamente, se faça um histórico da origem desses peixes

Implementação e validação de um método cromatográfico para a Detecção e Quantificação de Furano em Feijão Enlatado

O furano tem sido detectado em diversos alimentos em particular nos que são sujeitos a tratamento térmico durante o processo de preparação industrial. É considerado um composto potencialmente cancerígeno para seres humanos, pelo que a sua presença nos alimentos se tornou uma questão de segurança alimentar. Desde 2007 que a Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar tem procurado recolher o maior número de informação possível, relativa à presença de furano nos alimentos. Neste trabalho utilizou-se a técnica de Cromatografia Gasosa de Espaço de Cabeça acoplada a um espectrómetro de massa (HS-GC/MS) para avaliar os teores de furano em feijões enlatados. Foram analisadas 10 amostras (latas) independentes, seleccionadas aleatoriamente no mercado, de três marcas comercializadas em Portugal. A concentração média obtida foi de 3,27 ng/g, numa gama que variou entre 2,61 e 4,45 ng/g. Os limites de detecção calculados foram de 0,80 ng/g para as amostras PD, 1,26 ng/g para as amostras C e de 0,58 ng/g para as amostras F. Os limites de quantificação foram, respectivamente, de 2,44, 3,82 e 1,77 ng/g. Os coeficientes de variação do método foram inferiores a 10% e a percentagem de recuperação foi de 95%. Para estudar o efeito do tratamento térmico doméstico, foram também, analisadas amostras aquecidas à temperatura de 80°C, tendo-se verificado um aumento significativo na concentração do furano detectada. Comparou-se ainda a concentração média do furano obtido nos feijões em lata com a concentração média para o mesmo tipo de feijão conservado em frascos de vidro, tendose constatado não existirem diferenças significativas.

Controlo e Aquisição de Dados no aparelho Posch ToF-SIMS

A espectrometria de massa de iões secundários por tempo-de-voo, ToF-SIMS, é umas das mais importantes e versáteis técnicas de análise de superfícies. As suas características únicas tais como excelente resolução em massa, alta sensibilidade, elevada resolução lateral e em profundidade e ausência de limite da massa superior, justificam a sua adopção como técnica favorita em campos tão diversos como a análise de metais, semicondutores, isoladores e compostos orgânicos. A técnica SIMS com feixe primário duplo (dual beam SIMS) é uma técnica extremamente poderosa para uma variedade de aplicações de análise em profundidade. A utilização de feixes de iões separados para a erosão e análise de uma amostra permite a variação independente de diferentes parâmetros experimentais. Desenvolveram-se duas aplicações em LabVIEWTM que permitem efectuar análises de superfícies com as técnicas SIMS estático, SIMS Imagem e dual beam SIMS. As aplicações desenvolvidas permitiram optimizar o controlo do espectrómetro de massa do tipo ToF-SIMS do laboratório de ciências de superfície do Grupo de Ciências de Superfície e Tecnologia de Vácuo do CEFITEC, a conversão e aquisição de dados e a sua representação e armazenamento. O trabalho efectuado constitui uma grande inovação no sistema de aquisição de dados e no controlo do espectrómetro de ToF-SIMS. As versões actuais das aplicações desenvolvidas estão aptas a responder, com fiabilidade, às necessidades do utilizador.

Utilização de isótopos estáveis de 13C e 15N na identificação de bacalhau Gadus e outras espécies de peixes salgados secos

O Brasil é dos países líderes na importação de peixes salgados e secos. Em 2008, importou da Noruega cerca de 30 mil toneladas destes produtos, a um custo de aproximadamente 190 milhões de dólares. O bacalhau é um produto salgado e seco bastante apreciado no país, mas espécies afins, de menor valor comercial, são também utilizadas na fabricação de peixes salgados secos e muitas vezes comercializadas como o bacalhau do Atlântico (Gadus morhua). A variação da razão de isótopos estáveis de carbono (13C/12C) e de nitrogênio (15N/14N) é medida com alta precisão por espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) e nos últimos 20 anos tem aumentado significativamente a aplicação desta tecnologia na avaliação de fraudes e adulterações dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi utilizar isótopos estáveis de 15N e 13C na identificação de bacalhau e espécies afins. Utilizando a análise isotópica, em músculos e ossos, foi possível diferenciar o bacalhau (do Atlântico e do Pacífico) de Ling, Zarbo e Saithe (p < 0,01), que são três produtos salgados e secos de menor valor comercial. Com a pele não foi possível tal distinção entre bacalhau do Pacífico e Ling (p > 0,05). A combinação de análises de valores de 15N de diferentes tecidos – músculo, pele e ossos – possibilitou a separação das espécies. A comparação gráfica de valores de 15N de músculo vs. pele, músculo vs. ossos e pele vs. ossos permite estabelecer três regiões de confiança: uma com bacalhau do Atlântico e bacalhau do Pacífico; outra com Ling e Zarbo; e finalmente, uma terceira região com o Saithe isolada de todos. Os resultados obtidos demonstram que a metodologia é viável para a distinção entre bacalhau e outros peixes salgados secos. No entanto, conclusões mais seguras serão obtidas com uma base de dados, para que, isotopicamente, se faça um histórico da origem desses peixes.