Pesquisa de alguns marcadores de patogenicidade em Escherichia coli da microbiota entérica de pacientes com doença inflamatória intestinal

A doença inflamatória intestinal (DII) é um quadro patológico marcado pela ocorrência de lesões de gravidade variável ao longo do trato intestinal. Os sintomas se manifestam na forma de duas variantes clínicas distintas: retocolite ulcerativa (RU) e doença de Crohn (DC). A DC pode afetar qualquer parte do trato gastrintestinal (TGI), desde a boca até o ânus, podendo em casos raros, acometer tecidos extraintestinais. A RU restringe-se ao intestino grosso. A predisposição para seu desenvolvimento e a causa da doença dependem de múltiplos fatores, incluindo a Genética, dieta, tabagismo, imunidade e a microbiota intestinal. Sendo uma das bactérias dominantes entre os aeróbios facultativos do cólon intestinal, a Escherichia coli tem sido foco da maioria dos estudos relacionados à microbiota. Diferentes trabalhos têm demonstrado que estas bactérias são aumentadas em pacientes com DII. Considerando-se o peso do fator genético e que pouco ou nenhum estudo equivalente tem sido realizado com a população brasileira, a proposta deste trabalho consistiu na avaliação quantitativa de alguns grupos bacterianos, em diferentes materiais clínicos de pacientes com DII. Para isto, foi investigado um total de 110 pacientes do atendimento de rotina do HC/UNESP, distribuídos em 3 categorias: 52 controles, 20 portadores de DC e 38 portadores de RU. Os espécimes clínicos consistiram majoritariamente de biópsias do reto e, em menor número, de fezes e biópsias de outros segmentos da mucosa intestinal. Análise da variação na concentração bacteriana aplicada às espécimes de um subgrupo destes pacientes (24 controles, 17 portadores de RU e 14 de DC) revelou que, em geral, portadores de DII apresentam uma maior concentração média de bactérias Gram negativas, Gram positivas e de outros microrganismos em diferentes segmentos da mucosa

Estudo dos fatores de virulência, sorogrupos, patogenicidade e susceptibilidade antimicrobiana das cepas de Escherichia coli isoladas de pintainhas de reposição de postura

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Pesquisa de fatores de patogenicidade em Escherichia coli Enteroagregativas da microbiota intestinal de pacientes com doença inflamatória intestinal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise do perfil de genes relacionados ao SST5 e SST6, formação de biofilme e invasão em cepas de Escherichia coli enteroagregativa

A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patotipo emergente e heterogêneo que causa a diarréia aguda ou persistente em indivíduos de diferentes faixas etárias e em pacientes imunocomprometidos. Além disso, EAEC é um dos principais agentes etiológicos da diarréia dos viajantes. O padrão de aderência agregativa de EAEC está associado ao plasmídeo de aderência agregativa (pAA). Genes presentes no plasmídeo e no cromossomo codificam proteínas envolvidas na secreção extracelular de fatores de virulência na superfície ou diretamente na célula hospedeira. A capacidade de produção de muco e biofilme, elaboração de toxinas, aderência e indução de inflamação intensa na mucosa intestinal são importantes características da patogenicidade de EAEC. Nesse estudo, determinamos o perfil genotípico de genes do sistema de secreção Tipo V (SST5) e sistema de secreção Tipo VI (SST6) em cepas de EAEC. Os genes do SST5 ocorreram com mais frequência que os genes do SST6. A presença de pelo menos um gene do SST5 foi detectada em 79% das cepas, enquanto que os genes relacionados ao SST6 foram detectados em apenas 42% das cepas analisadas. A produção de biofilme foi observada em teste quantitativo e verificamos que 67% das cepas produziram biofilme. No teste qualitativo, o tipo de biofilme que predomina é o biofilme moderado (11 cepas), seguido do biofilme forte (9 cepas) e do biofilme discreto (4 cepas). A presença ou ausência de genes do SST5 e SST6 não parece interferir com a capacidade de produção de biofilme, nem com o tipo de biofilme formado. Em ensaios de citotoxicidade, apenas 25% das cepas EAEC (sobrenadante) causaram redução significativa na viabilidade de células T84 avaliada pelo teste de redução com MTT. Nossos resultados mostram que as cepas EAEC isoladas de crianças com diarréia aguda ou de grupo controle são invasoras para células T84. Ao compararmos a capacidade invasora das cepas clinicas e controle, observamos que a média do índice de internalização obtido nas 15 cepas do grupo clinico foi de 5,7% 1,7 e para as 9 cepas do grupo controle foi de 2.4 % 0,7; entretanto essa diferença observada não foi estatisticamente significativa. Não foi possível correlacionar o perfil genotípico dos genes do SST5 e SST6 com o perfil fenotípico analisado (formação de biofilme, citotoxicidade e invasão).O que pode ser atribuído a heterogeneidade genotípica e fenotípica, uma característica relevante de cepas EAEC.

Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.

Análise dos aspectos biológicos e epidemiológicos de cepas de Escherichia coli associadas à infecção do trato urinário (ITU)

A invasão de bactérias no trato urinário caracteriza a infecção do sistema urinário. A Escherichia coli é o principal microrganismo associado a esta infecção devido a sua importância em causar ITU, recebeu a denominação de UPEC (Escherichia coli uropatogênica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infecções sintomática ou assintomática, a presença de 7 fatores de virulência, através das técnicas de PCR simples e multiplex para verificação dos genes que codificam adesinas P (pap) , fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotóxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), proteína de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) através do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC também foi pesquisado nestas amostras. O método difusão em disco foi o utilizado para a determinação dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etárias de maior incidência de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequência pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adesão em células Hep-2, doze amostras não apresentaram aderência (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderência agregativa (AA). Observamos aderência sem padrão típico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistência para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantoína (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).

Estabelecimento de uma nova metodologia para o cálculo do índice de patoigenicidade em amostras de escherichia coli provenientes da produção de frango de corte

Essa dissertação possui como objetivo traçar, uma nova metodologia de classificação de patogenicidade da Escherichia.coli,.através de um índice no qual, além do número de animais mortos, também foi considerado o tempo de morte e a capacidade da cepa causar lesão compatível à colibacilose em pintos de 1 dia. Para gerar esse critério, foram utilizadas 300 amostras de E.coli oriundas de lotes com lesão de celulite, cama desses mesmos aviários e amostras de quadros respiratórios. Através desse experimento foi possível observar que as amostras de E.coli originadas das camas dos aviários, apresentavam índice de patogenicidade significativamente menor do que aquelas isoladas das lesões cutâneas e de quadros respiratórios.Também foi associado às cepas de E.coli a capacidade de causar lesões de: pericardite, perihepatite, aerossaculite, peritonite e celulite. Dentre as lesões citadas somente a celulite foi considerada de apresentação significativamente mais freqüente em comparação às outras.

Prevalence of virulence factors in Escherichia coli strains isolated from the genital tract of healthy cows

Determinou-se a prevalência dos genes de virulência expressando fimbrias, produção de hemolisina, colicina e aerobactina em cepas de Escherichia coli obtidas do trato genital de vacas saudáveis que não apresentam sinais clínicos indicativos de infecção. A presença dos genes responsáveis pela expressão de fimbrias (pap, sfa, afa) foi avaliada através de reação em cadeia da polimerase utilizando primers especificos para cada um dos genes, nenhum deles foi detectado em qualquer uma das cepas isoladas. A prevalência dos fatores de virulência foi de 90,4%, 69,8%, 28,5% para colicina, hemolisina e aerobactina, respectivamente. A análise da patogenicidade das cepas do trato genital pode contribuir para o entendimento do comportamento das cepas de E. coli.

Estudo histológico de intestino delgado de camundongos colonizados por cepas de Escherichia coli enteropatogenicas de origem bovina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Fatores de virulência em linhagens de Escherichia coli isoladas de infecção do trato urinário, piometra e fezes de cães

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Propriedades de adesão e invasão de cepas de Escherichia coli isoladas de pacientes com doença inflamatória intestinal

A Doença Inflamatória Intestinal (DII) engloba um grupo de processos inflamatórios crônicos de causas não conhecidas. Duas formas clínicas da DII são reconhecidas atualmente: a Retocolite Ulcerativa (RU) e a Doença de Crohn (DC). Foram isoladas de 348 amostras, dos quais 17 foram diagnosticados com com DC, e 40 com RU. Os 41 restantes apresentavam outras patologias e compreenderam o grupo controle. Entre as amostras que apresentaram adesão positiva, 110 delas apresentaram padrão de Adesão Agregativa (AA) e 19 apresentaram padrão de Adesão Difusa (AD). A cepa, DII/013, apresentou o padrão de adesão agregativo e invisibilidade média 18 vezes superior à cepa da EIEC. Quando observada ao microscópio eletrônico, bactérias intracelulares foram detectadas na amostra. Assim, a maioria das amostras apresentaram padrão de adesão agregativo, indicando juntamente com estudos anteriores, que esse padrão teria uma possível relação com a patogenicidade da bactéria em relação a DII

Detecção e caracterização de Escherichia coli potencialmente patogênicas em aves selvagens e pombos-domésticos na cidade de Jaboticabal-SP

Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária - FCAV

Escherichia coli : host interactions in the pathogenesis of canine pyometra

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

Highly discriminatory single-nucleotide polymorphism interrogation of Escherichia coli by use of allele-specific real-time PCR and eBURST analysis

In total, 782 Escherichia coli strains originating from various host sources have been analyzed in this study by using a highly discriminatory single-nucleotide polymorphism (SNP) approach. A set of eight SNPs, with a discrimination value (Simpson's index of diversity [D]) of 0.96, was determined using the Minimum SNPs software, based on sequences of housekeeping genes from the E. coli multilocus sequence typing (MLST) database. Allele-specific real-time PCR was used to screen 114 E. coli isolates from various fecal sources in Southeast Queensland (SEQ). The combined analysis of both the MLST database and SEQ E. coli isolates using eight high-D SNPs resolved the isolates into 74 SNP profiles. The data obtained suggest that SNP typing is a promising approach for the discrimination of host-specific groups and allows for the identification of human-specific E. coli in environmental samples. However, a more diverse E. coli collection is required to determine animal- and environment-specific E. coli SNP profiles due to the abundance of human E. coli strains (56%) in the MLST database.