Caractérisation neuro-immunitaire d'un modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Ninjurin-1 est une molécule d'adhérence de la barrière hémato-encéphalique impliquée dans le recrutement de monocytes au sein du système nerveux central

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP.

Interleukin-15 in the pathogenesis of multiple sclerosis and its animal models

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie.

Expression et rôle de PD-1 et de ses ligands dans le contexte de la sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées.

Caractérisation du rôle de MCAM dans la sclérose en plaques

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires.

Prenatal Vitamin D deficiency induces an early and more severe experimental autoimmune encephalomyelitis in the second generation

In a previous study, we demonstrated that mouse adult F(1) offspring, exposed to a vitamin d deficiency during pregnancy, developed a less severe and delayed Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), when compared with control offspring. We then wondered whether a similar response was observed in the subsequent generation. To answer this question, we assessed F(2) females whose F(1) parents (males or females) were vitamin d-deprived when developing in the uterus of F(0) females. Unexpectedly, we observed that the vitamin d deficiency affecting the F(0) pregnant mice induced a precocious and more severe EAE in the F(2) generation. This paradoxical finding led us to assess its implications for the epidemiology of Multiple Sclerosis (MS) in humans. Using the REFGENSEP database for MS trios (the patient and his/her parents), we collected the parents' dates of birth and assessed a potential season of birth effect that could potentially be indicative of the vitamin d status of the pregnant grandmothers. A trend for a reduced number of births in the Fall for the parents of MS patients was observed but statistical significance was not reached. Further well powered studies are warranted to validate the latter finding.

Peptide-functionalized polymeric nanoparticles for active targeting of damaged tissue in animals with experimental autoimmune encephalomyelitis

Increased permeability of blood vessels is an indicator for various injuries and diseases, including multiple sclerosis (MS), of the central nervous system. Nanoparticles have the potential to deliver drugs locally to sites of tissue damage, reducing the drug administered and limiting associated side effects, but efficient accumulation still remains a challenge. We developed peptide-functionalized polymeric nanoparticles to target blood clots and the extracellular matrix molecule nidogen, which are associated with areas of tissue damage. Using the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in rats to provide a model of MS associated with tissue damage and blood vessel lesions, all targeted nanoparticles were delivered systemically. In vivo data demonstrates enhanced accumulation of peptide functionalized nanoparticles at the injury site compared to scrambled and naive controls, particularly for nanoparticles functionalized to target fibrin clots. This suggests that further investigations with drug laden, peptide functionalized nanoparticles might be of particular interest in the development of treatment strategies for MS.

A comparative study of antibody expressions in primary biliary cirrhosis and autoimmune cholangitis using phage display

Primary biliary cirrhosis (PBC) and autoimmune cholangitis (AIC) are serologic expressions of an autoimmune liver disease affecting biliary ductular cells. Previously we screened a phage-displayed random peptide library with polyclonal IgG from 2 Australian patients with PBC and derived peptides that identified a single conformational (discontinuous) epitope in the inner lipoyl domain of the E2 subunit of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC-E2), the characteristic autoantigen in PBC. Here we have used phage display to investigate the reactivity of PBC sera from 2 ethnically and geographically distinct populations, Japanese and Australian, and the 2 serologic expressions, PBC and AIC. Random 7-mer and 12-mer peptide libraries were biopanned with IgG from 3 Japanese patients with PBC and 3 with AIC who did not have anti-PDC-E2. The phage clones (phagotopes) obtained were tested by capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for reactivity with affinity-purified anti-PDC-E2, and compared with those obtained from Australian patients with PBC. Peptide sequences of the derived phagotopes and sequences derived by biopanning with irrelevant antisera were aligned to develop a guide tree based on physicochemical similarity. Both Australian and Japanese PBC-derived phagotopes were distributed in branches of the guide tree that contained the peptide sequences MH and FV previously identified as part of an immunodominant conformational epitope of PDC-E2, indicating that epitope selection was not influenced by the racial origin of the PBC sera. Biopanning with either PBC or AIC-derived IgG yielded phagotopes that reacted with anti-PDC-E2 by capture ELISA, further establishing that there is a similar autoimmune targeting in PBC and AIC.

Introduction: Epitope mimicry as a component cause of autoimmune disease

The causes of autoimmune diseases have yet to be fully elucidated. Autoantibodies, autoreactive T cell responses, the presence of a predisposing major histocompatibility complex (MHC) haplotype and responsiveness to corticosteroids are features, and some are possibly contributory causes of autoimmune disease. The most challenging question is how autoimmune diseases are triggered. Molecular mimicry of host cell determinants by epitopes of infectious agents with ensuing cross-reactivity is one of the most popular yet still controversial theories for the initiation of autoimmune diseases [1]. Throughout the 1990s, hundreds of research articles focusing to various extents on epitope mimicry, as it is more accurately described in an immunological context, were published annually. Many of these articles presented data that were consistent with the hypothesis of mimicry but that did not actually prove the theory. Other equally convincing reports indicated that epitope mimicry was not the cause of the autoimmune disease despite sequence similarity between molecules of infectious agents and the host. Some 20 years ago, Rothman [2] proposed a model for disease causation and I have used this as a framework to examine the role of epitope mimicry in the development of autoimmune disease. The thesis of Rothman’s model is that an effect, in this instance autoimmune disease, arises as a result of a cause. In most cases, multiple-component causes contribute synergistically to yield the effect, and each of these components alone is insufficient as a cause. Logically, some component causes, such as the presence of a particular autoimmune response, are also necessary causes.

Towards the pathogenesis of autoimmune liver disease

There have been recent improvements in the clinical understanding and definition of the major types of autoimmune liver disease. However, still lacking is knowledge of their prevalence and pathogenesis. Three areas of study are in progress in our laboratory. First, in type 1 autoimmune hepatitis, the search continues to identify a liver/disease-specific autoantigenic reactant. Using hepatocyte membrane preparations, immunoblotting has underlined the problem of distinguishing, among multiple reactants, those that may be causally rather than consequentially related to hepatocellular damage. Second, in primary biliary cirrhosis (PBC), the need for population screening to ascertain prevalence and detect preclinical cases can be met by a rapid automated procedure for detection, by specific enzyme inhibition in microtitre wells, of antibody (anti-M2) to the pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit (PDC-E2). Third, the structure of the conformational epitope within the inner lipoyl domain of PDC-E2 is being investigated by screening random phage-displayed peptide libraries using PBC sera. This has yielded phage clones in which the sequence of the peptide insert portrays the structure of this epitope, as judged by clustering of PBC-derived sequences to particular branches of a guide-tree that shows relatedness of peptides, and by reactivity of selected phage clones with anti-PDC-E2. Thus phage display identifies a peptide 'mimotope' of the antibody epitope in the inner lipoyl domain of PDC-E2.

Molecular mimicry: Can epitope mimicry induce autoimmune disease?

Mimicry of host antigens by infectious agents may induce cross-reactive autoimmune responses to epitopes within host proteins which, in susceptible individuals, may tip the balance of immunological response versus tolerance toward response and subsequently lead to autoimmune disease. Epitope mimicry may indeed be involved in the pathogenesis of several diseases such as post-viral myocarditis or Chagas disease, but for many other diseases in which it has been implicated, such as insulin-dependent diabetes mellitis or rheumatoid arthritis, convincing evidence is still lacking. Even if an epitope mimic can support a cross-reactive T or B cell response in vitro, its ability to induce an autoimmune disease in vivo will depend upon the appropriate presentation of the mimicked host antigen in the target tissue and, in the case of T cell mimics, the ability of the mimicking epitope to induce a proliferative rather than anergizing response upon engagement of the MHC-peptide complex with the T cell receptor. B cell presentation of mimicking foreign antigen to T cells is a possible mechanism for instigating an autoimmune response to self antigens that in turn can lead to autoimmune disease under particular conditions of antigen presentation, secondary signalling and effector cell repertoire. In this review evidence in support of epitope mimicry is examined in the light of the necessary immunological considerations of the theory.

Small fibre neuropathy in patients with latent autoimmune diabetes in adults

The prevalence of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) in patients diagnosed with type 2 diabetes mellitus (T2DM) ranges from 7 to 10% (1). They present at a younger age and have a lower BMI but poorer glycemic control, which may increase the risk of complications (2). However, a recent analysis of the Collaborative Atorvastatin Diabetes Study (CARDS) has demonstrated no difference in macrovascular or microvascular events between patients with LADA and T2DM, but neuropathy was not assessed (3). Previous studies quantifying neuropathy in patients with LADA are limited. In this study, we aimed to accurately quantify neuropathy in subjects with LADA compared with matched patients with T2DM.

Functional and cellular analysis of autoimmune regulator (AIRE) protein

Autoimmune diseases are a major health problem. Usually autoimmune disorders are multifactorial and their pathogenesis involves a combination of predisposing variations in the genome and other factors such as environmental triggers. APECED (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) is a rare, recessively inherited, autoimmune disease caused by mutations in a single gene. Patients with APECED suffer from several organ-specific autoimmune disorders, often affecting the endocrine glands. The defective gene, AIRE, codes for a transcriptional regulator. The AIRE (autoimmune regulator) protein controls the expression of hundreds of genes, representing a substantial subset of tissue-specific antigens which are presented to developing T cells in the thymus and has proven to be a key molecule in the establishment of immunological tolerance. However, the molecular mechanisms by which AIRE mediates its functions are still largely obscure. The aim of this thesis has been to elucidate the functions of AIRE by studying the molecular interactions it is involved in by utilizing different cultured cell models. A potential molecular mechanism for exceptional, dominant, inheritance of APECED in one family, carrying a glycine 228 to tryptophan (G228W) mutation, was described in this thesis. It was shown that the AIRE polypeptide with G228W mutation has a dominant negative effect by binding the wild type AIRE and inhibiting its transactivation capacity in vitro. The data also emphasizes the importance of homomultimerization of AIRE in vivo. Furthermore, two novel protein families interacting with AIRE were identified. The importin alpha molecules regulate the nuclear import of AIRE by binding to the nuclear localization signal of AIRE, delineated as a classical monopartite signal sequence. The interaction of AIRE with PIAS E3 SUMO ligases, indicates a link to the sumoylation pathway, which plays an important role in the regulation of nuclear architecture. It was shown that AIRE is not a target for SUMO modification but enhances the localization of SUMO1 and PIAS1 proteins to nuclear bodies. Additional support for the suggestion that AIRE would preferably up-regulate genes with tissue-specific expression pattern and down-regulate housekeeping genes was obtained from transactivation studies performed with two models: human insulin and cystatin B promoters. Furthermore, AIRE and PIAS activate the insulin promoter concurrently in a transactivation assay, indicating that their interaction is biologically relevant. Identification of novel interaction partners for AIRE provides us information about the molecular pathways involved in the establishment of immunological tolerance and deepens our understanding of the role played by AIRE not only in APECED but possibly also in several other autoimmune diseases.