Utilizacion del metodo Ovsynch (ovulacion sincronizada) en hembras bovinas receptoras para transplante de embriones en la finca Santa Rosa - UNA, Managua

El presente estudio investigativo fue realizado en la finca Santa Rosa, propiedad de la Universidad Nacional Agraria, ubicada en el departamento de Managua-Nicaragua. El objetivo fue determinar la efectividad del método Ovsynch (ovulación sincronizada) en la inducción de la ovulación en hembras bovinas receptoras. El tamaño de la muestra utilizado fue de 20 hembras receptoras; las cuales fueron previamente seleccionadas según la condición corporal, la edad comprendida entre los 3-5 años y los resultados del examen clínico y ginecológico para constatar que cumplieran con los requisitos o parámetros de salud estimados para la aplicación de este tratamiento hormonal. Las variables evaluadas fueron: 1) Tasa de ovulación. 2) Porcentaje de hembras con presentación de síntomas del celo. 3) Identificar la estructura de costos en la aplicación del método Ovsynch. Para el análisis estadístico se utilizó la Prueba de media de t de Student, estableciendo dos grupos, grupo 1 y grupo 2. Donde el grupo 1 fue el grupo bajo tratamiento (Ovsynch) y el grupo 2 fue el grupo control. Los resultados se obtuvieron con un nivel de confianza de un 95%. Para la variable porcentaje de ovulación se alcanzó una respuesta positiva de un 100% en las hembras del grupo 1 y un 70% en el grupo 2. La variable presentación de los síntomas clínicos del celo obtuvo un 100% en el grupo 1 y un 70% en el grupo 2. Se logró un 100% de hembras con presencia de cuerpo lúteo en el grupo 1 y un 70% des hembras del grupo 2. En la efectividad del tratamiento hormonal manifestó un 100% de efectividad en la inducción y sincronización de la ovulación, a diferencia del tratamiento con ovulación espontánea el cual presentó un 70% de efectividad y un 30% de no efectividad. Por lo tanto se concluye que debido a la adecuada efectividad del tratamiento hormonal y los bajos costos del mismo el método Ovsynch es factible y rentable para su implementación por parte de medianos productores de nuestro país.

Quimeras transitorias en la producción de embriones bovinos

La transmisión de genética superior y consecuente generación de numerosas crías idénticas de alto valor, permitiría aumentar rápidamente la cantidad y calidad del ganado vacuno. Con este fin, optimizamos la técnica de fecundación in vitro (FIV), la cual nos permitió obtener altas tasas de embriones y preñeces. La selección del toro y la realización de experimentos de FIV con semen sexado, consiguieron aumentar los rendimientos por pajuela y la producción de embriones del sexo deseado en nuestras condiciones. También exploramos un sistema eficiente de criopreservación de embriones libres de zona pelúcida (LZP) por vitrificación, con resultados de sobrevida similares al grupo control con ZP. En este sentido, mediante la desagregación de embriones en estadio de 2 y 4 células, y el posterior cultivo LZP, fue posible incrementar la cantidad inicial de embriones. Si bien la TO en presuntos cigotos de FIV permitió generar embriones de mayor tamaño, también afectó severamente tanto la competencia de los embriones como la de sus blastómeras individuales. Sin embargo, la complementación troboblástica de blastómeras más avanzadas desagregadas demostró ser una alternativa innovadora para la clonación embrionaria. Este procedimiento se realizó electrofusionando embirones producidos por FIV en estadío de 2 células, que luego se agregaron con una única blastómera transgénica, generando lo que llamamos quimeras transitorias. Al emplear los embriones aneuploides y más jóvenes fue posible dirigir el destino de cada tipo celular, orientándolos hacia los tejidos extrembrionarios (que se descartarían en el momento del nacimiento), y soportando el desarrollo de una blastómera individual destinada al macizo celular interno (MCI). Por lo tanto, durante el desarrollo de esta Tesis fue posible desarrollar un sistema completo y original de clonación embrionaria, basado en la producción, multiplicación y criopreservación de embriones bovinos LZP.

Microscopia electrónica de barrido en cultivos in vitro de embriones inmaduros y mesocotilos de plántulas de maíz

p.95-105

Quimeras transitorias en la producción de embriones bovinos

La transmisión de genética superior y consecuente generación de numerosas crías idénticas de alto valor, permitiría aumentar rápidamente la cantidad y calidad del ganado vacuno. Con este fin, optimizamos la técnica de fecundación in vitro (FIV), la cual nos permitió obtener altas tasas de embriones y preñeces. La selección del toro y la realización de experimentos de FIV con semen sexado, consiguieron aumentar los rendimientos por pajuela y la producción de embriones del sexo deseado en nuestras condiciones. También exploramos un sistema eficiente de criopreservación de embriones libres de zona pelúcida (LZP) por vitrificación, con resultados de sobrevida similares al grupo control con ZP. En este sentido, mediante la desagregación de embriones en estadio de 2 y 4 células, y el posterior cultivo LZP, fue posible incrementar la cantidad inicial de embriones. Si bien la TO en presuntos cigotos de FIV permitió generar embriones de mayor tamaño, también afectó severamente tanto la competencia de los embriones como la de sus blastómeras individuales. Sin embargo, la complementación troboblástica de blastómeras más avanzadas desagregadas demostró ser una alternativa innovadora para la clonación embrionaria. Este procedimiento se realizó electrofusionando embirones producidos por FIV en estadío de 2 células, que luego se agregaron con una única blastómera transgénica, generando lo que llamamos quimeras transitorias. Al emplear los embriones aneuploides y más jóvenes fue posible dirigir el destino de cada tipo celular, orientándolos hacia los tejidos extrembrionarios (que se descartarían en el momento del nacimiento), y soportando el desarrollo de una blastómera individual destinada al macizo celular interno (MCI). Por lo tanto, durante el desarrollo de esta Tesis fue posible desarrollar un sistema completo y original de clonación embrionaria, basado en la producción, multiplicación y criopreservación de embriones bovinos LZP.

Efecto del CIDR aplicado en vacas de carne receptoras para transferencia de embriones sobre la tasa de preñez.

Tesis (Maestro en Ciencias Veterinarias) UANL, 2009.

Efecto de la intensidad de la poda en el desarrollo in vitro de embriones de vides estenospermocárpicas

La técnica del rescate de embriones permite la obtención de plantas por cruzamiento directo entre cultivares sin semillas, no obstante el número de plántulas obtenidas es bajo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la intensidad de la poda en dos cultivares estenospermocárpicos de vid (Emperatriz y Fantasy Seedless) sobre el desarrollo in vitro de los embriones y correlacionar el desempeño de los mismos con distintas características de las plantas. La respuesta a los tratamientos estuvo altamente afectada por el cultivar. En Fantasy S. se obtuvo un mayor cantidad de plántulas in vitro disminuyendo el número de yemas dejadas en la poda.

Desarrollo de embriones somáticos de alcornoque en biorreactores de inmersión temporal.

El sistema de inmersión temporal (SIT) se basa en el empleo de medio líquido y el establecimiento de ciclos de aporte y retirada del medio. Esto permite aprovechar las ventajas del medio líquido (favorece la absorción de nutrientes, el crecimiento del material vegetal y la dilución de los metabolitos excretados), al tiempo que reduce sus inconvenientes (suprime el contacto continuo de los explantos con el medio de cultivo, evitando los problemas de asfixia y vitrificación). Por otra parte el SIT facilita el control y el estudio de la nutrición en el cultivo in vitro y puede contribuir al desarrollo óptimo de los explantos. En este trabajo presentamos la puesta a punto de un SIT aplicado a la obtención de embriones somáticos de albaricoque.

Obtención de clones de alcornoque (Quercus suber L.) mediante embriogénesis somática: aplicación de medios líquidos y biorreactores en la sincronización de los procesos de desarrollo y maduración de los embriones

El alcornoque tiene un gran valor ambiental, como integrante de los ecosistemas forestales mediterráneos, e interés comercial por el valor de la bellota (alimentación del cerdo ibérico), el carbón, la madera y sobre todo por las aplicaciones industriales del corcho. Las posibilidades de mejora genética del alcornoque, como las de otras especies forestales, están limitadas por sus largos ciclos reproductivos y porque su propagación vegetativa mediante estaquillado solo es posible en estados muy juveniles. Por ello este sistema de propagación tiene muy poca, o ninguna, utilidad práctica en la mejora genética. La embriogénesis somática es la vía más apropiada para la clonación de muchas especies forestales y ha hecho posible el desarrollo a gran escala de plantaciones multivarietales de coníferas. En alcornoque es posible la regeneración completa de árboles adultos mediante embriogénesis somática. Con los protocolos actuales (en medio semisólido), los embriones se generan formando acúmulos y en la fase de multiplicación conviven embriones en distintos estados de desarrollo. Es un sistema asincrónico, con baja eficacia para la propagación en masa, que no elimina completamente las dificultades para el desarrollo de programas de mejora genética del alcornoque. En otras especies la utilización de medios líquidos ha mejorado: la sincronización, productividad de los cultivos, el manejo y reducido los costes de producción. Por ello el desarrollo de suspensiones embriogénicas de alcornoque se plantea como una vía para aumentar la eficacia de la propagación clonal a gran escala. En la presente tesis se desarrollan cultivos embriogénicos de alcornoque en medio líquido. El capítulo 3 aborda el establecimiento y mantenimiento de suspensiones, el capítulo 4 el desarrollo de una fase de proliferación en medio líquido y el capítulo 5 la utilización de sistemas de cultivo en medio líquido, estacionarios y de inmersión temporal, como vía para favorecer la maduración de los embriones somáticos. Para iniciar los cultivos en medio líquido se emplearon agregados de embriones tomados de la fase de proliferación en medio semisólido. Cuando estos agregados se inocularon directamente en medio líquido no se logró el establecimiento de las suspensiones. El establecimiento se consiguió empleando como inóculo las células y Resumen pequeños agregados embriogénicos, de tamaño comprendido entre 41 y 800 μm, desprendidas por agitación breve de los agregados de embriones. El mantenimiento se logró inoculando en baja densidad masas embriogénicas compactas de tamaño comprendido entre 0,8 y 1,2 mm. Estas suspensiones, muy heterogéneas, mantuvieron su capacidad de proliferación y de regeneración de embriones al menos durante diez subcultivos consecutivos. El protocolo de iniciación y mantenimiento, desarrollado inicialmente con un solo genotipo, fue eficaz cuando se probó sobre otros 11 genotipos de alcornoque. En la fase de proliferación se ensayaron tres tipos de envase y tres velocidades de agitación. La combinación envase × velocidad determinó el intercambio gaseoso, la disponibilidad de oxígeno y el estrés hidrodinámico. Los agregados embriogénicos de alcornoque crecieron incluso en condiciones de hipoxia no siendo la disponibilidad de oxígeno un factor limitante del crecimiento para tasas de trasferencia de oxígeno comprendidas entre 0,11 h-1 y 1,47 h-1. Por otra parte la producción de biomasa creció con el estrés hidrodinámico para valores de índice de cizalladura inferiores a 5 x 10-3 cm min-1. La mayor producción de biomasa se obtuvo con matraces Erlenmeyer de 100 ml y alta velocidad de agitación (160 rpm) mientras que la diferenciación de embriones se vio favorecida por bajas velocidades de agitación (60 rpm) asociadas con bajas disponibilidades de oxígeno. La posibilidad de madurar embriones de alcornoque en medio líquido se estudió utilizando sistemas de inmersión permanente y sistemas de inmersión temporal. En inmersión permanente no se diferenciaron embriones cotiledonares (posiblemente por hiperhidricidad). Los sistemas de inmersión temporal permitieron obtener embriones maduros en estado cotiledonar y capaces de regenerar plantas in vitro. Concentraciones de sacarosa superiores a 60 g l-1 y frecuencias de inmersión iguales o inferiores a una diaria, tuvieron efectos negativos para el desarrollo de los embriones somáticos. En los sistemas de inmersión temporal los parámetros físico-químicos del medio de cultivo se mantuvieron estables y no se observó ninguna limitación de nutrientes. No obstante, estos sistemas se vieron afectados por la evaporación que generó el flujo de aire necesario para desplazar el líquido en cada periodo de inmersión. Abstract ABSTRACT Cork oak is one of the most important tree species of the Mediterranean ecosystem. Besides its high environmental value has a great economic interest due to the sustainable production of acorns (to feed the Iberian pig) charcoal, timber and cork, which is a renewable natural product with various technological applications. As happens with other forest species, cork oak genetic improvement programs are limited by their long life cycles and because vegetative propagation by cuttings it´s only possible in very juvenile plants. Hence this propagation system is useless or has little practical use for breeding cork oak. Plant regeneration by somatic embryogenesis is the most suitable way for cloning many forest species, and it is the enabling technology which has allowed the establishment of large-scale conifer multi-varietal plantations. Clonal plant regeneration of mature cork oak trees can be achieved through somatic embryogenesis. Somatic embryos at different stages of development and forming clusters are produced during the multiplication phase with current protocols (using semisolid medium). This is an asynchronous low-efficient process not suitable for mass propagation, and therefore it does not solve the difficulties presented by cork oak breeding programs. Culture in liquid medium has been used with other species to improve: synchronization, yield, handling, and to reduce production costs. Thus the development of cork oak embryogenic suspension cultures is envisaged as a way to increase the efficiency of large scale clonal propagation. The thesis herein develops cork oak embryogenic cultures in liquid medium. In chapter 3 establishment and maintenance of suspension cultures are developed, chapter 4 studies proliferation phase in liquid medium and chapter 5 considers the use of different systems of culture in liquid medium, both stationary and temporary immersion, as a way to promote somatic embryos maturation. Clusters of embryos taken from proliferating cultures on semisolid medium were used to initiate the cultures in liquid medium. When these clusters were inoculated directly in liquid medium establishment of suspension cultures was not executed. However using, as initial inoculum, cells and cell aggregates with a size between 41 and 800 μm detached from these clusters of embryos, subjected to a brief shaking, suspension cultures could be established. Suspension maintenance was achieved by inoculating compact embryogenic Abstract clumps with a size between 0.8 and 1.2 mm at low density. The suspension cultures, very heterogeneous, retained both their proliferation and embryo regeneration capacity for at least ten consecutive subcultures. The initiation and maintenance protocol, initially developed with a single genotype, was effective when tested on 11 additional genotypes of cork oak. In proliferation phase three types of vessels and three different levels of agitation were assayed. The combination vessel × orbiting speed determined gas exchange, oxygen availability and hydrodynamic stress. Cork oak embryogenic aggregates grew even under hypoxia conditions; oxygen availability at transfer rates between 0.11 and 1.47 h-1 was not a limiting factor for growth. Furthermore the biomass production was increased with hydrodynamic stress when shear rate values were of less than 5 x 10-3 cm min-1. The highest biomass production was obtained with 100 ml Erlenmeyer flask and high stirring speed (160 rpm) while the differentiation of embryos was favored by low agitation speeds (60 rpm) associated with low oxygen availability. The possibility to mature cork oak somatic embryos in liquid medium was studied using both permanent immersion systems and temporary immersion systems. Cotyledonary embryos did not differentiate in permanent immersion conditions (probably due to hyperhydricity). Temporary immersion systems allowed obtaining mature cotyledonary embryos, which were able to regenerate plants in vitro. Sucrose concentrations above 60 g l-1 and immersion frequencies equal to or lower than one each 24 h had negative effects on somatic embryo development. Physicochemical parameters of the culture medium in temporary immersion systems were stable and showed no limitation of nutrients. However, these systems were affected by the evaporation generated by the airflow necessary to relocate the medium at each immersion period.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas.

Efecto del meloxicam sobre el porcentaje de preñez en novillas receptoras de embriones

Tesis (Magister en Ciencias Veterinarias).-- Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Maestría en Ciencias Veterinarias, 2014

Evaluación del efecto de los suplementos minerales traza sobre la cantidad y calidad de embriones producidos in vitro

Tesis (Médico Veterinario). -- Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Programa de Medicina Veterinaria, 2013

Determinación de la actividad catalasa (cat) y superóxido dismutasa (sod) en embriones de yamú (brycon amazonicus) conservados A -14 °C

Tesis (Zootecnista). -- Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Programa de Zootecnia, 2014

Conservación de embriones de Yamú (brycon amazonicus) a - 14 °C como posible estrategia de producción

Tesis (Zootecnista). -- Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Programa de Zootecnia, 2014