Growth regulatory role of R -PTPmu in normal and neoplastic epithelial cells

Cellular oncogenes and tumor suppressor genes regulate cellular adhesion and proliferation, two important events in malignant transformation. Even though receptor-like protein tyrosine phosphatases (R-PTPs) can influence these events, their role in malignant transformation has not been studied. The major goal of this study was to determine whether downregulation of R-PTP$\mu$ expression in lung epithelial cells is associated with or causal to neoplastic transformation. Examination of R-PTP$\mu$ expression in normal and carcinoma cells demonstrated that lung epithelial cells expressed R-PTP$\mu$ whereas lung carcinoma cells did not, and that incubation with TGF-$\alpha$ and HGF induced a two fold increase in R-PTP$\mu$ mRNA expression. To associate the expression of R-PTP$\mu$ with neoplastic transformation, we transfected lung epithelial cells with the H-ras oncogene. Transformation resulted in the activation of the MAPK signal transduction pathway, the hyperphosphorylation of c-met, and the production of HGF. Upon analysis of R-PTP$\mu$ expression, we observed a significant decrease in R-PTP$\mu$ mRNA and protein levels suggesting that transformation can directly or indirectly downregulate the expression of R-PTP$\mu.$ TGF-$\beta$ reversed the H-ras transformed phenotype, an event directly correlated with upregulation of R-PTP$\mu.$ To provide a casual relationship between R-PTP$\mu$ and cessation of tumor cell growth, we transfected carcinoma cells with the wild type R-PTP$\mu$ cDNA. Transiently expressing cells were selected by FACS using the mAb 3D7 and plated into individual wells. Carcinoma cells positive for R-PTP$\mu$ expression did not grow into colonies whereas non-R-PTP$\mu$ expressing carcinoma cells did, suggesting that expression of R-PTP$\mu$ arrested cell growth. To better understand the growth arrest induced by R-PTP$\mu$, we transfected the H-ras transformed lung epithelial cell line (MvLu-1-ras) with R-PTP$\mu$ (MvLu-1-ras/R-PTP$\mu$). Examination of growth factor receptor phosphorylation revealed significant inhibition of c-met and EGF-R. Furthermore, these cells underwent apoptosis in the absence of serum. Taken together the data demonstrate that the downregulation of R-PTP$\mu$ expression is an important step in neoplastic transformation of lung epithelial cells and that its presence can induce apoptosis and inhibit the signaling of c-met and EGF-R, two major growth factor receptors in lung carcinoma. In conclusion, the expression of R-PTP$\mu$ is inversely correlated with neoplastic transformation, growth and survival of tumor cells. ^

Epidermal growth factor receptors, testosterone levels and parotid gland changes in rats infected with Trypanosoma cruzi

It has been demonstrated that parotid glands of rats infected with Trypanosoma cruzi present severe histological alterations; changes include reduction in density and volume of the acini and duct systems and an increase in connective tissue. We evaluated the association between morphological changes in parotid glands, circulating testosterone levels and epidermal growth factor receptor (EGF-R) expression in experimental Chagas disease in rats. Animals at 18 days of infection (acute phase) showed a significant decrease in body weight, serum testosterone levels and EGF-R expression in the parotid gland compared with a control group. Since decreases in body weight could lead to a reduction in circulating testosterone concentration, we believe that the reduction in EGF-R expression in parotid glands of infected rats is due to alterations in testosterone levels and atrophy of parotid glands is caused by changes in EGF-R expression. Additionally, at 50 days (chronic phase) of infection parotid glands showed a normal histological aspect likely due to the normalization of the body weight. These findings suggest that the testosterone-EGF-R axis is involved in the histological changes.

Protein kinases expressed in aggregating brain cell cultures during myelination.

Serum-free aggregating rat brain cell cultures provide sufficient cell surface and paracrine interactions between neurons and glial cells for compact myelination. We are interested in the part played in these signalling pathways by protein kinases and have used a PCR cDNA cloning approach to catalogue the protein kinase genes expressed by these cultures. 8 transmembrane protein kinases were identified: IGF1-R, trk B, bFGF-R, c-met, Tyro2, Tyro1, Tyro4 and a novel eck-related gene. The first 4 are receptors for ligands with known trophic functions. Tyro2 is a novel gene related to the EGF-R. The latter 3 belong to the eck gene family of more than 8 highly related putative receptors for, as yet, unknown ligands. 8 cDNAs for intracellular protein kinases were also isolated including 3 novel genes. Ongoing studies are investigating whether these proteins contribute to myelination and/or could be used as therapeutic targets in demyelinating diseases.

Peptides vasoactifs endogènes dans la prolifération accrue des cellules musculaires lisses vasculaires de rats spontanément hypertendus: rôle des facteurs de croissance.

Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R.

Modulation de la voie de signalisation de Gαq par l’hyperglycémie : mécanisme moléculaire

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie.

Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

Nouvelle approche pour modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux à l’aide de ligands bispécifiques

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques.

Le niveau réduit d’AMPc dans la surexpression des protéines G(alpha)i et la prolifération accrue des cellules du muscle lisse vasculaire des rats spontanément hypertendus

Nous avons précédemment montré que les cellules musculaires lisses vasculaires(CMLV) des rats spontanément hypertendus (SHR) présentent une expression augmentée des protéines G inhibitrices (Gi) et une prolifération cellulaire accrue par rapport aux CMLV des rats Wystar-Kyoto (WKY). Le niveau d'AMPc s’est également avéré plus faible dans les CMLV de SHR. La présente étude a donc été entreprise afin d'examiner la contribution de la diminution du niveau intracellulaire d'AMPc à l’augmentation de l'expression des protéines Gi et à la prolifération accrue des CMLV de SHR et de continuer à explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents responsables de cette réponse. Les CMLV de SHR ont montré par rapport aux CMLV des WKY une expression accrue de Giα-2 et Giα-3 qui a été diminué d'une manière dépendante de concentration par le dbcAMP, un analogue d'AMPc perméable à la membrane cellulaire. En outre, les fonctions augmentées des protéines Gi comme démontrées par l'amplification de l’inhibition de l'adénylate cyclase par les hormones inhibitrices et l'activité forskoline (FSK)-stimulée de l’adénylate cyclase par une faible concentration de GTPγS dans les CMLV de SHR ont également été restaurées aux niveaux de WKY par le dbcAMP. La prolifération accrue des CMLV de SHR a également été atténuée par le dbcAMP et la forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase. De plus, dbcAMP a restauré la production augmentée d'anion superoxyde (O2-), l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression accrue des protéines Nox 4 et p47phox observée dans les CMLV de SHR jusqu’au niveau contrôle. Par ailleurs, la phosphorylation accrue des PDGF-R, EGF-R, c-Src et ERK1/2 énoncée par les CMLV de SHR a également été diminuée par le dbcAMP d'une manière dépendante de concentration. Ces résultats suggèrent que le niveau réduit d'AMPc intracellulaire montré par les CMLV de SHR contribue à l'expression accrue des protéines Gi et à l’hyperprolifération cellulaire à travers l’augmentation du stress oxydatif, la transactivation des EGF-R, PDGF-R et la voie de signalisation des MAP kinases.

Influência da restrição proteica gestacional e lactacional sobre a morfogênese da próstata de ratos

Nos últimos anos vem aumentando o reconhecimento mundial sobre a relevância da nutrição como pilar básico para o desenvolvimento econômico e social. Milhares de crianças têm seu crescimento retardado pela má nutrição, no entanto poucos trabalhos relacionam a desnutrição proteica materna e o desenvolvimento do sistema reprodutor masculino. Dessa forma, o presente trabalho tem por objetivo investigar os possíveis efeitos da restrição proteica gestacional e durante a lactação sobre a morfogênese do complexo prostático, tendo em vista que a etiologia das doenças prostáticas relaciona-se com fatores epigenéticos, e dentre eles, fatores toxicológicos e nutricionais. Após o acasalamento e diagnóstico da prenhês, dois grupos de mães foram constituídos: Normoproteico (NP, 17% proteína, n=7) e Hipoproteico (LP, 6% proteína, n=7). No segundo dia pós-nascimento (DPN2), as ninhadas foram inspecionadas e reduzidas para no máximo oito animais (preferencialmente machos), a distância anogenital foi mensurada e, 2 machos por ninhada foram mortos por decapitação para coleta do broto prostático no dia do nascimento. Após o nascimento dos filhotes, um grupo de mães do grupo hipoproteico continuou recebendo a ração hipoproteica (n=3), enquanto as demais passaram a receber a ração normoproteica (n=3). No dia 22, dia do desmame, 2 machos de cada ninhada foram pesados, mortos por decapitação e o complexo prostático foi coletado para as análises morfológicas e imunoistoquímicas. Foram investigados a morfologia geral e o padrão de distribuição dos elementos celulares e da matriz extracelular por métodos citoquímicos e morfométricos, e a imunorreatividade para os seguintes marcadores: receptor de andrógeno (AR), Ki67, α-actina, EGF-R e P63. Os índices de proliferação e morte celular (TUNEL) foram calculados. A prole LP apresentou uma redução significativa do peso corporal e da distância anogenital no DPN2. ...

Effect of epidermal growth factor on nuclear and cytoplasmic in vitro maruration of guinea pig oocytes

The guinea pig may represent an animal model for research on ovarian infertility and improvement of the in vitro maturation (IVM) conditions is needed in this species. The aim of the present work was to immunolocalize the Epidermal Growth Factor (EGF)-Receptor in the guinea pig ovaries and to study the effect of EGF on meiotic and cytoplasmic maturation, and apoptotic rate in cumulus-oocyte-co mplexes (COCs). Immunohistochemistry was performed in paraffined ovaries using a rabbit polyclonal antibody EGF-R (1:100; Santa Cruz Biotechnology) and the ABC Vector Elite kit (Vector Laboratories). For the IVM, COCs were collected by aspiration of follicles >700μm under a stereoscopic microscope.

Regulation of Bcl-xL expression in human keratinocytes by cell–substratum adhesion and the epidermal growth factor receptor

Cell–substratum adhesion is an essential requirement for survival of human neonatal keratinocytes in vitro. Similarly, activation of the epidermal growth factor receptor (EGF-R) has recently been implicated not only in cell cycle progression but also in survival of normal keratinocytes. The mechanisms by which either cell–substratum adhesion or EGF-R activation protect keratinocytes from programmed cell death are poorly understood. Here we describe that blockade of the EGF-R and inhibition of substratum adhesion share a common downstream event, the down-regulation of the cell death protector Bcl-xL. Expression of Bcl-xL protein was down-regulated during forced suspension culture of keratinocytes, concurrent with large-scale apoptosis. Similarly, EGF-R blockade was accompanied by down-regulation of Bcl-xL steady-state mRNA and protein levels to an extent comparable to that observed in forced suspension culture. However, down-regulation of Bcl-xL expression by EGF-R blockade was not accompanied by apoptosis; in this case, a second signal, generated by passaging, was required to induce rapid and large-scale apoptosis. These findings are consistent with the conclusions that (i) Bcl-xL represents a shared molecular target for signaling through cell-substrate adhesion receptors and the EGF-R, and (ii) reduced levels of Bcl-xL expression through EGF-R blockade lower the tolerance of keratinocytes for cell death signals generated by cellular stress.

Physiological coupling of growth factor and steroid receptor signaling pathways: estrogen receptor knockout mice lack estrogen-like response to epidermal growth factor.

Past studies have shown that epidermal growth factor (EGF) is able to mimic the uterotropic effects of estrogen in the rodent. These studies have suggested a "cross-talk" model in which EGF receptor (EGF-R) signaling results in activation of nuclear estrogen receptor (ER) and its target genes in an estrogen-independent manner. Furthermore, in vitro studies have indicated the requirement for ER in this mechanism. To verify the requirement for ER in an in vivo system, EGF effects were studied in the uteri of ER knockout (ERKO) mice, which lack functional ER. The EGF-R levels, autophosphorylation, and c-fos induction were observed at equivalent levels in both genotypes indicating that removal of ER did not disrupt the EGF responses. Induction of DNA synthesis and the progesterone receptor gene in the uterus were measured after EGF treatment of both ERKO and wild-type animals. Wild-type mice showed increases of 4.3-fold in DNA synthesis, as well as an increase in PR mRNA after EGF treatment. However, these responses were absent in ERKO mice, confirming that the estrogen-like effects of EGF in the mouse uterus do indeed require the ER. These data conclusively demonstrate the coupling of EGF and ER signaling pathways in the rodent reproductive tract.

Régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires par l’activation in vivo du récepteur natriurétique de type C.

Le remodelage vasculaire dû à l’hyper-prolifération cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) observé chez les rats spontanément hypertendus (RSH) est associé à l’hypertension artérielle. Nous avons précédemment démontré que le traitement in vivo des RSH par l’agoniste spécifique du récepteur du peptide natriurétique de type C (NPR-C), le C-ANP4-23 atténue l’hyper-prolifération des CMLVs. Nous avons entrepris cette étude afin d’investiguer si l’effet antiprolifératif du C-ANP4-23 agit par l’entremise de l’inhibition de la surexpression des protéines du cycle cellulaire, et afin d’en explorer les mécanismes sous-jacents. Pour cette étude, des RSH et des rats Wistar Kyoto (WKYs) âgés de deux semaines ont été injectés en intra-péritonéale par le C-ANP4-23 de 2 jusqu’à 8 semaines d’âge, deux fois par semaine et sacrifiés à la 9ème semaine. La pression artérielle a été mesurée par méthode Queue-coiffe, la prolifération des CMLVs a été déterminée par incorporation de thymidine et par test MTT, et l’expression des protéines a été quant à elle déterminée par technique d’immunobuvardage de type Western. Les CMLVs des RSH ont démontré une prolifération élevée en comparaison avec celles des WKYs, et le traitement par le C-ANP4-23 a atténué l’hyperprolifération à un niveau de contrôle. De plus, la surexpression des cyclines D1/A/E, des kinases cyclines dépendantes 2 et 4 (cdk2, cdk4), de la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome et des protéines Gαi des CMLV des RSH a été atténuée à un niveau de contrôle. Par ailleurs, l’hyperphosphorylation d’ERK1/2, AKT, EGF-R, PDGF-R, IGF-R et de c-Src a significativement diminué par le traitement au C-ANP4-23. En outre, le niveau élevé de l’anion superoxyde (O2-), l’activité de la NADP(H) oxydase et de ses sous unités chez les RSH ont été atténués par le C-ANP4-23 .Ces résultats indiquent que l’activation in vivo de NPR-C atténue la surexpression des protéines du cycle cellulaire via l’inhibition de l’activité élevée du stress oxydatif, de c-Src et de l’activation de EGF-R, PDGF- R, IGF-R, de la signalisation de MAPK et la surexpression des protéines Gαi résultant ainsi en l’inhibition de l’hyperprolifération des CMLVs des RSH. Ainsi, il peut être suggéré que le C-ANP4-23 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose.

Régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires par l’activation in vivo du récepteur natriurétique de type C

Le remodelage vasculaire dû à l’hyper-prolifération cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) observé chez les rats spontanément hypertendus (RSH) est associé à l’hypertension artérielle. Nous avons précédemment démontré que le traitement in vivo des RSH par l’agoniste spécifique du récepteur du peptide natriurétique de type C (NPR-C), le C-ANP4-23 atténue l’hyper-prolifération des CMLVs. Nous avons entrepris cette étude afin d’investiguer si l’effet antiprolifératif du C-ANP4-23 agit par l’entremise de l’inhibition de la surexpression des protéines du cycle cellulaire, et afin d’en explorer les mécanismes sous-jacents. Pour cette étude, des RSH et des rats Wistar Kyoto (WKYs) âgés de deux semaines ont été injectés en intra-péritonéale par le C-ANP4-23 de 2 jusqu’à 8 semaines d’âge, deux fois par semaine et sacrifiés à la 9ème semaine. La pression artérielle a été mesurée par méthode Queue-coiffe, la prolifération des CMLVs a été déterminée par incorporation de thymidine et par test MTT, et l’expression des protéines a été quant à elle déterminée par technique d’immunobuvardage de type Western. Les CMLVs des RSH ont démontré une prolifération élevée en comparaison avec celles des WKYs, et le traitement par le C-ANP4-23 a atténué l’hyperprolifération à un niveau de contrôle. De plus, la surexpression des cyclines D1/A/E, des kinases cyclines dépendantes 2 et 4 (cdk2, cdk4), de la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome et des protéines Gαi des CMLV des RSH a été atténuée à un niveau de contrôle. Par ailleurs, l’hyperphosphorylation d’ERK1/2, AKT, EGF-R, PDGF-R, IGF-R et de c-Src a significativement diminué par le traitement au C-ANP4-23. En outre, le niveau élevé de l’anion superoxyde (O2-), l’activité de la NADP(H) oxydase et de ses sous unités chez les RSH ont été atténués par le C-ANP4-23 .Ces résultats indiquent que l’activation in vivo de NPR-C atténue la surexpression des protéines du cycle cellulaire via l’inhibition de l’activité élevée du stress oxydatif, de c-Src et de l’activation de EGF-R, PDGF- R, IGF-R, de la signalisation de MAPK et la surexpression des protéines Gαi résultant ainsi en l’inhibition de l’hyperprolifération des CMLVs des RSH. Ainsi, il peut être suggéré que le C-ANP4-23 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose.