Synthesis of aromatic monothiols and aromatic dithiols to increase the folding rate and yield of disulfide containing proteins

Most pharmaceutically relevant proteins and many extracellular proteins contain disulfide bonds. Formation of the correct disulfide bonds is essential for stability in almost all cases. Disulfide containing proteins can be rapidly and inexpensively overexpressed in bacteria. However, the overexpressed proteins usually form aggregates inside the bacteria, called inclusion bodies, which contains inactive and non-native protein. To obtain native protein, inclusion bodies need to be isolated and resolubilized, and then the resulting protein refolded in vitro. In vitro protein folding is aided by the addition of a redox buffer, which is composed of a small molecule disulfide and/or a small molecule thiol. The most commonly used redox buffer contains reduced and oxidized glutathione. Recently, aliphatic dithiols and aromatic monothiols have been employed as redox buffers. Aliphatic dithiols improved the yield of native protein as compared to the aliphatic thiol, glutathione. Dithiols mimic the in vivo protein folding catalyst, protein disulfide isomerase, which has two thiols per active site. Furthermore, aromatic monothiols increased the folding rate and yield of lysozyme and RNase A relative to glutathione. By combining the beneficial properties of aliphatic dithiols and aromatic monothiols, aromatic dithiols were designed and were expected to increase in vitro protein folding rates and yields. Aromatic monothiols (1-4) and their corresponding disulfides (5-8), two series of ortho- and para-substituted ethylene glycol dithiols (9-15), and a series of aromatic quaternary ammonium salt dithiols (16-17) were synthesized on a multigram scale. Monothiols and disulfides (1-8) were utilized to fold lysozyme and bovine pancreatic trypsin inhibitor. Dithiols (11-17) were tested for their ability to fold lysozyme. At pH 7.0 and pH 8.0, and high protein concentration (1 mg/mL), aromatic dithiols (16, 17) and a monothiol (3) significantly enhanced the in vitro folding rate and yield of lysozyme relative to the aliphatic thiol, glutathione. Additionally, aromatic dithiols (16, 17) significantly enhance the folding yield as compared to the corresponding aromatic monothiol (3). Thus, the folding rate and yield enhancements achieved in in vitro protein folding at high protein concentration will decrease the volume of renaturation solution required for large scale processes and consequently reduce processing time and cost.

A kinetic study of the thermally initiated free radical reactions of styrene with octanedithiol as a model for the reactions of multifunctional thiols with divinylbenzene

The kinetics of chain reactions of octanedithiol with styrene, thermally initiated with TX29B50 (a 50:50 wt% solution of TX29 diperoxy initiator in a phthalate plasticizer), have been studied over a range of initiator concentrations, a range of mixture formulations and a range of temperatures. This system has been investigated as a model system for the reactions of polyfunctional thiols with divinyl benzene. The reactions have been shown to follow first-order kinetics for both the thiol and the ene species and to be characterized by a dependence on the initiator concentration to the power of one half. The kinetic rate parameters have been shown to adhere to Arrhenius behaviour. A kinetic model for the chain reactions for this system has been proposed. (C) 2003 Society of Chemical Industry.

Mononuclear Pt(II) and Pd(II) 1,4-dithiolato complexes. Crystal structures of [Pt((−) DIOS) (PPh3)2] and [Pd(S(CH2) 4S)(Ph2P(CH2) 3PPh2)]. Application in styrene hydroformylation

Addition of 1,4-dithiols to dichloromethane solutions of [PtCl2(P-P)] (P-P = (PPh3)2, Ph2P(CH2)3PPh2, Phd2P(CH2)4PPh2; 1,4-dithiols = HS(CH2)4SH, (−)DIOSH2 (2,3-O-isopropylidene-1,4-dithiol-l-threitol), BINASH2 (1,1′-dinaphthalene-2,2′-dithiol)) in the presence of NEt3 yielded the mononuclear complexes [Pt(1,4-dithiolato)(P-P)]. Related palladium(II) complexes [Pd(dithiolato)(P-P)] (P-P=Ph2P(CH2)3PPh2, Ph2P(CH2)4PPh2; dithiolato = −S(CH2)4S−, (−)-DIOS) were prepared by the same method. The structure of [Pt((−)DIOS)(PPh3)2] and [Pd(S(CH2)4S)(Ph2P(CH2)3PPh2)] complexes was determined by X-ray diffraction methods. Pt—dithiolato—SnC12 systems are active in the hydroformylation of styrene. At 100 atm and 125°C [Pt(dithiolate)(P-P)]/SnCl2 (Pt:Sn = 20) systems provided aldehyde conversion up to 80%.

Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance Protein) Possesses a Previously Undescribed Activity, Lipoyl-dependent Peroxidase

The Ohr (organic hydroperoxide resistance) family of 15-kDa Cys-based, thiol-dependent peroxidases is central to the bacterial response to stress induced by organic hydroperoxides but not by hydrogen peroxide. Ohr has a unique three-dimensional structure and requires dithiols, but not monothiols, to support its activity. However, the physiological reducing system of Ohr has not yet been identified. Here we show that lipoylated enzymes present in the bacterial extracts of Xylella fastidiosa interacted physically and functionally with this Cys-based peroxidase, whereas thioredoxin and glutathione systems failed to support Ohr peroxidase activity. Furthermore, we could reconstitute in vitro three lipoyl-dependent systems as the Ohr physiological reducing systems. We also showed that OsmC from Escherichia coli, an orthologue of Ohr from Xylella fastidiosa, is specifically reduced by lipoyl-dependent systems. These results represent the first description of a Cys-based peroxidase that is directly reduced by lipoylated enzymes.

Self assembled monolayers for engineering of structured inorganic materials in the micrometer and submicrometer range

Deutsch:In der vorliegenden Arbeit konnten neue Methoden zur Synthese anorganischer Materialien mit neuartiger Architektur im Mikrometer und Nanometer Maßstab beschrieben werden. Die zentrale Rolle der Formgebung basiert dabei auf der templatinduzierten Abscheidung der anorganischen Materialien auf selbstorganisierten Monoschichten. Als Substrate eignen sich goldbedampfte Glasträger und Goldkolloide, die eine Mittelstellung in der Welt der Atome bzw. Moleküle und der makroskopischen Welt der ausgedehnten Festkörper einnehmen. Auf diesen Substraten lassen sich Thiole zu einer monomolekularen Schicht adsorbieren und damit die Oberflächeneigenschaften des Substrates ändern. Ein besonderer Schwerpunkt bei dieser Arbeit stellt die Synthese speziell auf die Bedürfnisse der jeweiligen Anwendung ausgerichteten Thiole dar.Im ersten Teil der Arbeit wurden goldbedampfte Glasoberflächen als Template verwendet. Die Abscheidung von Calciumcarbonat wurde in Abhängigkeit der Schichtdicke der adsorbierten Monolage untersucht. Aragonit, eine der drei Hauptphasen des Calciumcarbonat Systems, wurde auf polyaromatischen Amid - Oberflächen mit Schichtdicken von 5 - 400 nm Dicke unter milden Bedingung abgeschieden. Die einstellbaren Parameter waren dabei die Kettenlänge des Polymers, der w-Substituent, die Bindung an die Goldoberfläche über Verwendung verschiedener Aminothiole und die Kristallisationstemperatur. Die Schichtdickeneinstellung der Polymerfilme erfolgte hierbei über einen automatisierten Synthesezyklus.Titanoxid Filme konnten auf Oberflächen strukturiert werden. Dabei kam ein speziell synthetisiertes Thiol zum Einsatz, das die Funktionalität einer Styroleinheit an der Oberflächen Grenze als auch eine Möglichkeit zur späteren Entfernung von der Oberfläche in sich vereinte. Die PDMS Stempeltechnik erzeugte dabei Mikrostrukturen auf der Goldoberfläche im Bereich von 5 bis 10 µm, die ihrerseits über die Polymerisation und Abscheidung des Polymers in den Titanoxid Film überführt werden konnten. Drei dimensionale Strukturen wurden über Goldkolloid Template erhalten. Tetraethylenglykol konnte mit einer Thiolgruppe im Austausch zu einer Hydroxylgruppe monofunktionalisiert werden. Das erhaltene Molekül wurde auf kolloidalem Gold selbstorganisiert; es entstand dabei ein wasserlösliches Goldkolloid. Die Darstellung erfolgte dabei in einer Einphasenreaktion. Die so erhaltenen Goldkolloide wurden als Krstallisationstemplate für die drei dimensionale Abscheidung von Calciumcarbonat verwendet. Es zeigte sich, dass Glykol die Kristallisation bzw. den Habitus des krsitalls bei niedrigem pH Wert modifiziert. Bei erhöhtem pH Wert (pH = 12) jedoch agieren die Glykol belegten Goldkolloide als Template und führen zu sphärisch Aggregaten. Werden Goldkolloide langkettigen Dithiolen ausgesetzt, so führt dies zu einer Aggregation und Ausfällung der Kolloide aufgrund der Vernetzung mehrer Goldkolloide mit den Thiolgruppen der Alkyldithiole. Zur Vermeidung konnte in dieser Arbeit ein halbseitig geschütztes Dithiol synthetisiert werden, mit dessen Hilfe die Aggregation unterbunden werden konnte. Das nachfolgende Entschützten der Thiolfunktion führte zu Goldkolloiden, deren Oberfläche Thiol funktionalisiert werden konnte. Die thiolaktiven Goldkolloide fungierten als template für die Abscheidung von Bleisulfid aus organisch/wässriger Lösung. Die Funktionsweise der Schutzgruppe und die Entschützung konnte mittels Plasmonenresonanz Spektroskopie verdeutlicht werden. Titanoxid / Gold / Polystyrol Komposite in Röhrenform konnten synthetisiert werden. Dazu wurde ein menschliches Haar als biologisches Templat für die Formgebung gewählt.. Durch Bedampfung des Haares mit Gold, Assemblierung eines Stryrolmonomers, welches zusätzlich eine Thiolfunktionalität trug, Polymerisation auf der Oberfläche, Abscheidung des Titanoxid Films und anschließendem Auflösen des biologischen Templates konnte eine Röhrenstruktur im Mikrometer Bereich dargestellt werden. Goldkolloide fungierten in dieser Arbeit nicht nur als Kristallisationstemplate und Formgeber, auch sie selbst wurden dahingehend modifiziert, dass sie drahtförmige Agglormerate im Nanometerbereich ausbilden. Dazu wurden Template aus Siliziumdioxid benutzt. Zum einen konnten Nanoröhren aus amorphen SiO2 in einer Sol Gel Methode dargestellt werden, zum anderen bediente sich diese Arbeit biologischer Siliziumoxid Hohlnadeln aus marinen Schwämmen isoliert. Goldkolloide wurden in die Hohlstrukturen eingebettet und die Struktur durch Ausbildung von Kolloid - Thiol Netzwerken mittels Dithiol Zugabe gefestigt. Die Gold-Nanodrähte im Bereich von 100 bis 500 nm wurden durch Auflösen des SiO2 - Templates freigelegt.

Rastertunnelmikroskopie kombiniert mit optischen Methoden und ihre Anwendung für opto-elektronische Experimente an nanoskopischen Strukturen

Die vorliegende Arbeit untersucht mittels lichtunterstützter Tunnelmikroskopie (STM) den Elektronentransport in farbstoffbedeckten, nanoporösen TiO2-Schichten, die in photoelektrochemischen Solarzellen eingesetzt werden. Transportrelevante Eigenschaften wie die elektronische Zustandsdichte sowie lichtinduzierte Vorgänge wie der Aufbau einer lichtinduzierten Oberflächenladung und lokale Photoströme werden ortsaufgelöst gemessen. Für einen möglichen Einsatz in lichtunterstützter Tunnelmikroskopie werden desweiteren Gold-Nanopartikel auf einer Amino-Hexanthiol-Monolage auf Coulomb-Blockaden untersucht. Den zweite Schwerpunkt stellen methodische Arbeiten zur Messung optischer Nahfelder in STM-Experimenten dar. Erstens sollen die Vorteile von Apertur- und aperturloser optischer Rasternahfeld-Mikroskopie mit komplett metallisierten Faserspitzen verbunden werden, die durch die Faser beleuchtet werden. Es gelingt nicht, theoretisch vorhergesagte hohe optische Auflösungen zu bestätigen. Zweitens werden transparente Spitzen aus Sb-dotiertem Zinnoxid erfolgreich als Tunnelspitzen getestet. Die Spitzen ermöglichen STM-Elektrolumineszenz-Experimente zur Charakterisierung optischer Nahfelder, ohne diese durch eine metallische Spitze zu beeinträchtigen. In einer STM-Studie wird das Selbstorganisations-Verhalten von Oktanthiol und Oktandithiol auf Au(111) aus Ethanol untersucht. Bei geringer relativer Konzentration der Dithiole (1:2000), bildet sich eine Phase liegender Dithiole, deren Ordnung durch die Präsenz der Oktanthiole katalysiert wird. Schließlich wird ein als 'dynamische Tunnelmikroskopie' bezeichneter Modus für die Tunnelmikroskopie in elektrisch leitfähiger Umgebung erfolgreich getestet, der zur Unterdrückung des elektrochemischen Leckstromanteils die Ableitung des Stroms nach dem Abstand als STM-Abstandssignal verwendet.

Immunoassays, optical and electrochemical immunosensorsfor tetrodotoxin determination in puffer fish samples

Tetrodotoxin (TTX) is a low molecular weight and potent marine neurotoxin which is usually present in some species of puffer fish. TTX selectively binds to voltage-sensitive sodium channels (VSGCs), blocking the influx of sodium into the cell and affecting neural transmission. The bioaccumulation of this toxin in seafood can poses a risk to human safety. With the purpose of achieving cheap, specific and reliable tools to determine TTX in puffer fish samples, a self-assembled dithiol-based immunoassay, an electrochemical immunosensor and an optical Surface Plasmon Resonance (SPR) immunosensor are proposed. The immunoassay for TTX based on the use of dithiols self-assembled on maleimide-plates (mELISA) has been able to detect as low as 2.28 μg/L of TTX. The effect of different puffer fish matrixes on this mELISA has been quantified and the corresponding correction factors have been established. This
mELISA has enabled to establish the cross-reactivity factors for four TTX analogues: 5,6,11-trideoxy-TTX, 5,6,11-trideoxy-4-anhydro-TTX, 11-nor-TTX-6-ol and 5,11-deoxy-TTX. The crossreactivity factors have also been established by the optical SPR immunosensor previously reported, which had a limit of detection (LOD) of 4.27 μg/L. The mELISA and the SPR immunosensor have then been tested with spiked-puffer fish matrixes, providing an effective
LOD of 0.23 and 0.43 mg/kg respectively, well below the limit set in Japan (2 mg/kg). The mELISA and the SPR immunosensor have also been applied to the analysis of naturally contaminated puffer fish samples, providing similar TTXs contents between techniques and also compared to LC-MS/MS. The suitability of these immunochemical techniques has been demonstrated not only for screening purposes, but also for research activities. Currently, given that dithiols could improve the electron transfer and the sensitivity of an electrochemical assay, the mELISA strategy is being transferred to gold electrodes for the electrochemical detection of TTX and the subsequent development of the multiplexed electrochemical immunosensor.

Ions and Small Molecules as Modulators of F1FO-ATPase, Mitochondrial Bioenergetics and Cell Metabolism

The properties of the mitochondrial F1FO-ATPase activated by the natural cofactor Mg2+ or by Ca2+, were studied, mainly on heart mitochondria from swine, widely used in translational medicine. The Ca2+ driven conformational changes in the F1FO-ATPase form the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which triggers regulated cell death and is involved in severe pathologies. The Ca2+-activated F1FO-ATPase hydrolyzes ATP with kinetics slightly different from those of the Mg2+-ATPase. Known F1-ATPase inhibitors inhibit both the Ca2+-activated F1FO-ATPase and the mPTP formation strengthening the molecular link between them. The different Gd3+ effects on the Ca2+- and Mg2+-activated F1FO-ATPases confirm their difference as also phenylglyoxal which preferentially inhibits the Ca2+-activated F1FO-ATPase. The effects of phenylarsine and dibromobimane, which interact with differently distant Cys thiols, show that mPTP opening is ruled by nearby or distant dithiols. Bergamot polyphenols and melatonin inhibit the mPTP and ROS formation. H2S, a known cardiovascular protector, unaffects the F1FO-ATPase, but inhibits Ca2+ absorption and indirectly the mPTP, both in swine heart and mussel midgut gland mitochondria. New generation triazoles inhibit the Ca2+-activated F1FO-ATPase and the mPTP, but unaffect the Mg2+-activated F1FOATPase. In parallel, the energy metabolism was investigated in mammalian cells. In boar sperm ATP is mainly produced by mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), even if it decreases over time because of less active mitochondria. Insufficient ATP may induce sperm dysfunction. Also, canine mesenchymal stem cells rely on OXPHOS; those from umbilical cord which produce more ATP than those from adipose tissue, seem preferable for transplant studies. The intestinal porcine enterocyte cell line IPEC-J2, used for human gut research, responds to different fetal bovine serum concentrations by remodeling OXPHOS without altering the bioenergetic parameters. The IPEC-J2 bioenergetics is modulated by Vitamin K vitamers. These data shoulder cell bioenergetics as precious tool for medical research.