Microautophagy of the nucleus coincides with a vacuolar diffusion barrier at nuclear-vacuolar junctions.

Nuclei bind yeast vacuoles via nucleus-vacuole (NV) junctions. Under nutrient restriction, NV junctions invaginate and release vesicles filled with nuclear material into vacuoles, resulting in piecemeal microautophagy of the nucleus (PMN). We show that the electrochemical gradient across the vacuolar membrane promotes invagination of NV junctions. Existing invaginations persist independently of the gradient, but final release of PMN vesicles requires again V-ATPase activity. We find that NV junctions form a diffusion barrier on the vacuolar membrane that excludes V-ATPase but is enriched in the VTC complex and accessible to other membrane-integral proteins. V-ATPase exclusion depends on the NV junction proteins Nvj1p,Vac8p, and the electrochemical gradient. It also depends on factors of lipid metabolism, such as the oxysterol binding protein Osh1p and the enoyl-CoA reductase Tsc13p, which are enriched in NV junctions, and on Lag1p and Fen1p. Our observations suggest that NV junctions form in two separable steps: Nvj1p and Vac8p suffice to establish contact between the two membranes. The electrochemical potential and lipid-modifying enzymes are needed to establish the vacuolar diffusion barrier, invaginate NV junctions, and form PMN vesicles.

A receptor-like kinase mutant with absent endodermal diffusion barrier displays selective nutrient homeostasis defects.

The endodermis represents the main barrier to extracellular diffusion in plant roots, and it is central to current models of plant nutrient uptake. Despite this, little is known about the genes setting up this endodermal barrier. In this study, we report the identification and characterization of a strong barrier mutant, schengen3 (sgn3). We observe a surprising ability of the mutant to maintain nutrient homeostasis, but demonstrate a major defect in maintaining sufficient levels of the macronutrient potassium. We show that SGN3/GASSHO1 is a receptor-like kinase that is necessary for localizing CASPARIAN STRIP DOMAIN PROTEINS (CASPs)--major players of endodermal differentiation--into an uninterrupted, ring-like domain. SGN3 appears to localize into a broader band, embedding growing CASP microdomains. The discovery of SGN3 strongly advances our ability to interrogate mechanisms of plant nutrient homeostasis and provides a novel actor for localized microdomain formation at the endodermal plasma membrane.

Casparian strip diffusion barrier in Arabidopsis is made of a lignin polymer without suberin.

Casparian strips are ring-like cell-wall modifications in the root endodermis of vascular plants. Their presence generates a paracellular barrier, analogous to animal tight junctions, that is thought to be crucial for selective nutrient uptake, exclusion of pathogens, and many other processes. Despite their importance, the chemical nature of Casparian strips has remained a matter of debate, confounding further molecular analysis. Suberin, lignin, lignin-like polymers, or both, have been claimed to make up Casparian strips. Here we show that, in Arabidopsis, suberin is produced much too late to take part in Casparian strip formation. In addition, we have generated plants devoid of any detectable suberin, which still establish functional Casparian strips. In contrast, manipulating lignin biosynthesis abrogates Casparian strip formation. Finally, monolignol feeding and lignin-specific chemical analysis indicates the presence of archetypal lignin in Casparian strips. Our findings establish the chemical nature of the primary root-diffusion barrier in Arabidopsis and enable a mechanistic dissection of the formation of Casparian strips, which are an independent way of generating tight junctions in eukaryotes.

Apoplastic diffusion barriers in Arabidopsis.

During the development of Arabidopsis and other land plants, diffusion barriers are formed in the apoplast of specialized tissues within a variety of plant organs. While the cuticle of the epidermis is the primary diffusion barrier in the shoot, the Casparian strips and suberin lamellae of the endodermis and the periderm represent the diffusion barriers in the root. Different classes of molecules contribute to the formation of extracellular diffusion barriers in an organ- and tissue-specific manner. Cutin and wax are the major components of the cuticle, lignin forms the early Casparian strip, and suberin is deposited in the stage II endodermis and the periderm. The current status of our understanding of the relationships between the chemical structure, ultrastructure and physiological functions of plant diffusion barriers is discussed. Specific aspects of the synthesis of diffusion barrier components and protocols that can be used for the assessment of barrier function and important barrier properties are also presented.

Role of an LRR receptor-like kinase in the establishment of a functional root endodermal barrier

The endodermis is a highly conserved cell layer present in the root of all vascular plants, except Lycophytes. This tissue layer establishes a protective diffusion barrier surrounding the vasculature and is expected to prevent passive, uncontrolled flow of nutrients through the root. This barrier property is achieved by the production of Casparian strips (CS), a localized cell wall impregnation of lignin in the anticlinal walls of each endodermal cell, forming a belt-like structure sealing the extracellular space. The CS act as a selective barrier between the external cell layers and the vascular cylinder and are thought to be important in many aspects of root function. For instance, selective nutrient uptake and sequestration from the soil, resistance to different abiotic and biotic stresses are expected to involve functional CS. Although discovered 150 years ago, nothing was known about the genes involved in CS establishment until recently. The use of the model plant Arabidopsis thaliana together with both reverse and forward genetic approaches led to the discovery of an increasing number of genes involved in different steps of CS formation during the last few years. One of these genes encodes SCHENGEN3 (SGN3), a leucine-rich repeat receptor-like kinase (LRR-RLK). SGN3 was discovered first by reverse genetic due to its endodermis-enriched expression, and the corresponding mutant displays strong endodermal permeability of the apoplastic tracer Propidium Iodide (PI) indicative of defective CS. One aim of this thesis is to study the role of SGN3 at the molecular level in order to understand its involvement in establishing an impermeable CS. The endodermal permeability of sgn3 is shown to be the result of incorrect localization of key proteins involved in CS establishment (the "Casparian strip domain proteins", CASPs), leading to non-functional CS interrupted by discontinuities. CASPs localize in the plasma membrane domain subjacent to the CS, named the Casparian Strip membrane Domain (CSD). The CSD discontinuities in sgn3 together with SGN3 localization in close proximity to the CASPs lead to the assumption that SGN3 is involved in the formation of a continuous CSD. In addition, SGN3 might have a second role, acting as a kinase reporting CSD integrity leading to lignin and suberin production in CSD/CS defective plants. Up to now, sgn3 is the strongest and most specific CS mutant available, displaying tracer penetration along the whole length of the seedling root. For this reason, this mutant is well suited in order to characterize the physiological behaviour of CS affected plants. Due to the lack of such mutants in the past, it was not possible to test the presumed functions of CS by using plants lacking this structure. We decided to use sgn3 for this purpose. Surprisingly, sgn3 overall growth is only slightly affected. Nevertheless, processes expected to rely on functional CS, such as water transport through the root, nutrient homeostasis, salt tolerance and resistance to an excess of some nutrients are altered in this mutant. On the other hand, homeostasis for most elements and drought tolerance are not affected in sgn3. It is surprising to observe that homeostatic defects are specific, with a decrease in potassium and an increase in magnesium levels. It indicates a backup system, set up by the plant in order to counteract free diffusion of nutrients into the stele. For instance, potassium shortage in sgn3 upregulates the transcription of potassium influx transport proteins and genes known to be induced by potassium starvation. Moreover, sgn3 mutant is hypersensitive to low potassium conditions. Hopefully, these results about SGN3 will help our understanding of CS establishment at the molecular level. In addition, physiological experiments using sgn3 should give us a framework for future experiments and help us to understand the different roles of CS and their involvement during nutrient radial transport through the root. -- L'endoderme est un tissu présent dans les racines de toutes les plantes vasculaires à l'exception des Lycophytes. Ce tissu établit une barrière protectrice entourant les tissus vasculaires dans le but d'éviter la diffusion passive et incontrôlée des nutriments au travers de la racine. Cette propriété de barrière provient de la production des cadres de Caspary, une imprégnation localisée de lignine des parties anticlinales de la paroi de chaque cellule d'endoderme. Cela donne naissance à un anneau/cadre qui rend étanche l'espace extracellulaire. Les cadres de Caspary agissent comme une barrière sélective entre les couches externes de la racine et le cylindre central et sont supposés être importants dans beaucoup d'aspects du fonctionnement de la racine. Par exemple, l'absorption sélective de nutriments et leur séquestration à partir du sol ainsi que la résistance contre différents stress abiotiques et biotiques sont supposés impliquer des cadres de Caspary fonctionnels. Bien que découverts il y a 150 ans, rien n'était connu concernant les gènes impliqués dans Ja formation des cadres de Caspary jusqu'à récemment. Durant ces dernière années, l'utilisation de la plante modèle Arabidopsis thaliana ainsi que des approches de génétique inverse et classique ont permis la découverte d'un nombre croissant de gènes impliqués à différentes étapes de la formation de cette structure. Un des ces gènes code pour SCHENGEN3 (SGN3), un récepteur kinase "leucine-rich repeat receptor-like kinase" (LRR-RLK). SGN3 a été découvert en premier par génétique inverse grâce à son expression enrichie dans l'endoderme. Les cadres de Caspary ne sont pas fonctionnels dans le mutant correspondant, ce qui est visible à cause de la perméabilité de l'endoderme au traceur apoplastique Propidium Iodide (PI). Un des objectifs de cette thèse est d'étudier la fonction de SGN3 au niveau moléculaire dans le but de comprendre son rôle dans la formation des cadres de Caspary. J'ai pu démontrer que la perméabilité de l'endoderme du mutant sgn3 est le résultat de la localisation incorrecte de protéines impliquées dans la formation des cadres de Caspary, les "Casparian strip domain proteins" (CASPs). Cela induit des cadres de Caspary non fonctionnels, contenant de nombreuses interruptions. Les CASPs sont localisés à la membrane plasmique dans un domaine sous-jacent les cadres de Caspary appelé Casparian Strip membrane Domain (CSD). Les interruptions du CSD dans le mutant sgn3, ainsi que la localisation de SGN3 à proximité des CASPs nous font penser à un rôle de SGN3 dans l'élaboration d'un CSD ininterrompu. De plus, SGN3 pourrait avoir un second rôle, agissant en tant que kinase reportant l'intégrité du CSD et induisant la production de lignine et de subérine dans des plantes contenant des cadres de Caspary non fonctionnels. Jusqu'à ce jour, sgn3 est le mutant en notre possession le plus fort et le plus spécifique, ayant un endoderme perméable tout le long de la racine. Pour cette raison, ce mutant est adéquat dans le but de caractériser la physiologie de plantes ayant des cadres de Caspary affectés. De manière surprenante, la croissance de sgn3 est seulement peu affectée. Néanmoins, des processus censés nécessiter des cadres de Caspary fonctionnels, comme le transport de l'eau au travers de la racine, l'homéostasie des nutriments, la tolérance au sel et la résistance à l'excès de certains nutriments sont altérés dans ce mutant. Malgré tout, l'homéostasie de la plupart des nutriments ainsi que la résistance au stress hydrique ne sont pas affectés dans sgn3. De manière surprenante, les altérations de l'ionome de sgn3 sont spécifiques, avec une diminution de potassium et un excès de magnésium. Cela implique un système de compensation établi par la plante dans le but d'éviter la diffusion passive des nutriments en direction du cylindre central. Par exemple, le manque de potassium dans sgn3 augmente la transcription de transporteurs permettant l'absorption de cet élément. De plus, des gènes connus pour être induits en cas de carence en potassium sont surexprimés dans sgn3 et la croissance de ce mutant est sévèrement affectée dans un substrat pauvre en potassium. Ces résultats concernant SGN3 vont, espérons-le, aider à la compréhension du processus de formation des cadres de Caspary au niveau moléculaire. De plus, les expériences de physiologie utilisant sgn3 présentées dans cette thèse devraient nous donner une base pour des expériences futures et nous permettre de comprendre mieux le rôle des cadres de Caspary, et plus particulièrement leur implication dans le transport radial des nutriments au travers de la racine. -- Les plantes terrestres sont des organismes puisant l'eau et les nutriments dont elles ont besoin pour leur croissance dans le sol grâce à leurs racines. De par leur immobilité, elles doivent s'adapter à des sols contenant des quantités variables de nutriments et il leur est crucial de sélectionner ce dont elles ont besoin afin de ne pas s'intoxiquer. Cette sélection est faite grâce à un filtre formé d'un tissu racinaire interne appelé endoderme. L'endoderme fabrique une barrière imperméable entourant chaque cellule appelée "cadre de Caspary". Ces cadres de Caspary empêchent le libre passage des nutriments, permettant un contrôle précis de leur passage. De plus, ils sont censés permettre de résister contre différents stress environnementaux comme la sécheresse, la salinité du sol ou l'excès de nutriments. Bien que découverts il y a 150 ans, rien n'était connu concernant les gènes impliqués dans la formation des cadres de Caspary jusqu'à récemment. Durant ces dernière années, l'utilisation de la plante modèle Arabidopsis thaliana a permis la découverte d'un nombre croissant de gènes impliqués à différentes étapes de la formation de cette structure. Un de ces gènes code pour SCHENGEN3 (SGN3), un récepteur kinase "leucine-rich repeat receptor-like kinase" (LRR- RLK). Nous montrons dans cette étude que le gène SGN3 est impliqué dans la formation des cadres de Caspary, et que le mutant correspondant sgn3 a des cadres de Caspary interrompus. Ces interruptions rendent l'endoderme perméable, l'empêchant de bloquer le passage des molécules depuis le sol vers le centre de la racine. En utilisant ce mutant, nous avons pu caractériser la physiologie de plantes ayant des cadres de Caspary affectés. Cela a permis de découvrir que le transport de l'eau au travers de la racine était affecté dans le mutant sgn3. De plus, l'accumulation de certains éléments dans les feuilles de ce mutant est altérée. Nous avons également pu montrer une sensibilité de ce mutant à un excès de sel ou de certains nutriments comme le fer et le manganèse.

Characterization of root apoplastic barriers in Arabidopsis thaliana

In vascular plants, the best-known feature of a differentiated endodermal cell is the "Casparian Strip" (CS). This structure refers to a highly localized cell wall impregnation in the transversal and anticlinal walls of the cell, which surrounds the cell like a belt/ring and is tightly coordinated with respect to neighboring cells. Analogous to tight junctions in animal epithelia, CS in plants act as a diffusion barrier that controls the movement of water and ions from soil into the stele. Since its first description by Robert Caspary in 1865 there have been many attempts to identify the chemical nature of the cell wall deposition in CS. Suberin, lignin, or both have been claimed to be the important components of CS in a series of different species. However, the exact chemical composition of CS has remained enigmatic. This controversy was due to the confusion and lack of knowledge regarding the precise measurement of three developmental stages of the endodermis. The CS represent only the primary stage of endodermal differentiation, which is followed by the deposition of suberin lamellae all around the cellular surface of endodermal cells (secondary developmental stage). Therefore, chemical analysis of whole roots, or even of isolated endodermal tissues, will always find both of the polymers present. It was crucial to clarify this point because this will guide our efforts to understand which cell wall biosynthetic component becomes localized in order to form the CS. The main aim of my work was to find out the major components of (early) CS, as well as their spatial and temporal development, physiological roles and relationship to barrier formation. Employing the knowledge and tools that have been accumulated over the last few years in the model plant Arabidopsis thaliana, various histological and chemical assays were used in this study. A particular feature of my work was to completely degrade, or inhibit formation of lignin and suberin biopolymers by biochemical, classical genetic and molecular approaches and to investigate its effect on CS formation and the establishment of a functional diffusion barrier. Strikingly, interference with monolignol biosynthesis abrogates CS formation and delays the formation of function diffusion barrier. In contrast, transgenic plants devoid of any detectable suberin still develop a functional CS. The combination of all these assays clearly demonstrates that the early CS polymer is made from monolignol (lignin monomers) and is composed of lignin. By contrast, suberin is formed much later as a secondary wall during development of endodermis. These early CS are functionally sufficient to block extracellular diffusion and suberin does not play important role in the establishment of early endodermal diffusion barrier. Moreover, suberin biosynthetic machinery is not present at the time of CS formation. Our study finally concludes the long-standing debate about the chemical nature of CS and opens the door to a new approach in lignin research, specifically for the identification of the components of the CS biosynthetic pathway that mediates the localized deposition of cell walls. I also made some efforts to understand the patterning and differentiation of endodermal passage cells in young roots. In the literature, passage cells are defined as a non- suberized xylem pole associated endodermal cells. Since these cells only contain the CS but not the suberin lamellae, it has been assumed that these cells may offer a continued low-resistance pathway for water and minerals into the stele. Thus far, no genes have been found to be expressed specifically in passage cells. In order to understand the patterning, differentiation, and physiological role of passage it would be crucial to identify some genes that are exclusively expressed in these cells. In order to identify such genes, I first generated fluorescent marker lines of stele-expressed transporters that have been reported to be expressed in the passage cells. My aim was to first highlight the passage cells in a non-specific way. In order to find passage cell specific genes I then adapted a two-component system based on previously published methods for gene expression profiling of individual cell types. This approach will allow us to target only the passage cells and then to study gene expression specifically in this cell type. Taken together, this preparatory work will provide an entry point to understand the formation and role of endodermal passage cells. - Chez les plantes vasculaires, la caractéristique la plus commune des cellules différentiées de l'endoderme est la présence de cadres de Caspary. Cette structure correspond à une imprégnation localisée des parties transversales et anticlinales de la paroi cellulaire. Cela donne naissance, autour de la cellule, à un anneau/cadre qui est coordonné par rapport aux cellules voisines. De manière analogue aux jonctions serrées des épithéliums chez les animaux, les cadres de Caspary agissent chez les plantes comme barrière de diffusion, contrôlant le mouvement de l'eau et des ions à travers la racine entre le sol et la stèle. Depuis leur première description par Robert Caspary en 1865, beaucoup de tentatives ont eu pour but de définir la nature chimique de ces cadres de Caspary. Après l'étude de différentes espèces végétales, à la fois la subérine, la lignine ou les deux ont été revendiquées comme étant des composants importants de ces cadres. Malgré tout, leur nature chimique exacte est restée longtemps énigmatique. Cette controverse provient de la confusion et du manque de connaissance concernant la détermination précise des trois stades de développement de l'endoderme. Les cadres de Caspary représentent uniquement le stade primaire de différentiation de l'endoderme. Celui-ci est suivi par le second stade de différentiation, la déposition de lamelles de subérine tout autour de la cellule endodermal. De ce fait, l'analyse chimique de racines entières ou de cellules d'endoderme isolées ne permet pas de séparer les stades de différentiation primaire et secondaire et aboutit donc à la présence des deux polymères. Il est également crucial de clarifier ce point dans le but de connaître quelle machinerie cellulaire localisée à la paroi cellulaire permet l'élaboration des cadres de Caspary. En utilisant les connaissances et les outils accumulés récemment grâce à la plante modèle Arabidopsis thaliana, divers techniques histologiques et chimiques ont été utilisées dans cette étude. Un point particulier de mon travail a été de dégrader ou d'inhiber complètement la formation de lignine ou de subérine en utilisant des approches de génétique classique ou moléculaire. Le but étant d'observer l'effet de l'absence d'un de ces deux polymères sur la formation des cadres de Caspary et l'établissement d'une barrière de diffusion fonctionnelle. De manière frappante, le fait d'interférer avec la voie de biosynthèse de monolignol (monomères de lignine) abolit la formation des cadres de Caspary et retarde l'élaboration d'une barrière de diffusion fonctionnelle. Par contre, des plantes transgéniques dépourvues d'une quantité détectable de subérine sont quant à elles toujours capables de développer des cadres de Caspary fonctionnels. Mises en commun, ces expériences démontrent que le polymère formant les cadres de Caspary dans la partie jeune de la racine est fait de monolignol, et que de ce fait il s'agit de lignine. La subérine, quant à elle, est formée bien plus tard durant le développement de l'endoderme, de plus il s'agit d'une modification de la paroi secondaire. Ces cadres de Caspary précoces faits de lignine suffisent donc à bloquer la diffusion extracellulaire, contrairement à la subérine. De plus, la machinerie de biosynthèse de la subérine n'est pas encore présente au moment de la formation des cadres de Caspary. Notre étude permet donc de mettre un terme au long débat concernant la nature chimique des cadres de Caspary. De plus, elle ouvre la porte à de nouvelles approches dans la recherche sur la lignine, plus particulièrement pour identifier des composants permettant la déposition localisée de ce polymère dans la paroi cellulaire. J'ai aussi fais des efforts pour mettre en évidence la formation ainsi que le rôle des cellules de passage dans les jeunes racines. Dans la littérature, les cellules de passage sont définies comme de la cellule endodermal faisant face aux pôles xylèmes et dont la paroi n'est pas subérisée. Du fait que ces cellules contiennent uniquement des cadres de Caspary et pas de lamelle de subérine, il a été supposé qu'elles ne devraient offrir que peu de résistance au passage de l'eau et des nutriments entre le sol et la stèle. Le rôle de ces cellules de passage est toujours loin d'être clair, de plus aucun gène s'exprimant spécifiquement dans ces cellules n'a été découvert à ce jour. De manière à identifier de tels gènes, j'ai tout d'abord généré des marqueurs fluorescents pour des transporteurs exprimés dans la stèle mais dont l'expression avait également été signalée dans l'endoderme, uniquement dans les cellules de passage. J'ai ensuite développé un système à deux composants basé sur des méthodes déjà publiées, visant principalement à étudier le profil d'expression génique dans un type cellulaire donné. En recoupant les gènes exprimés spécifiquement dans l'endoderme à ceux exprimés dans la stèle et les cellules de passage, il nous sera possible d'identifier le transriptome spécifique de ces cellules. Pris dans leur ensemble, ces résultats devraient donner un bon point d'entrée dans la définition et la compréhension des cellules de passage.

Molecular dissection of Arabidopsis thaliana endodermis development, structure and function

In vascular plants, the endodermis establishes a protective diffusion barrier surrounding the vasculature preventing the passive, uncontrolled entry of nutrients absorbed by the plant. It does so by means of a differentiation feature, the "Casparian Strip" (CS), a highly localized cell wall impregnation made of lignin, which seals the extracellular space. Although the existence of this differentiation feature has been intensively described, the mechanisms establishing this hallmark remain obscure. In this work I report, the developmental sequence of events that leads to a differentiated endodermis, in the plant model Arabidopsis thaliana. In addition, my descriptive approach gave important insights as to how these cells define membrane domains involved in the directional transport of nutrients. I also participated in characterizing a new transmembrane protein family, the CASPs, localized to the membrane domain underlying the CS, which we accordingly named the Casparian Strip membrane Domain (CSD). Our molecular analysis indicates that these proteins drive CS establishment. To identify more molecular factors of CS establishment, I performed a forward genetic screen. This screen led to the identification of 11 endodermis permissive mutants, which we named schengen (sgn) mutants. The causative mutations have been mapped to 5 independent loci: SGN1 to SGN5. SGN1 and SGN3 encode Receptor Like Kinases involved in the correct establishment of the CSD. A lack of those kinases leads to an incomplete CSD, which gives rise to interrupted CS barriers. Interestingly, SGN1 seems to also regulate CSD positioning to the middle of endodermal transversal walls. SGN4 encodes an NADPH oxidase involved in lignin polymerization essential for CS formation. The sgn5 mutant induces extra divisions of cortical cells strongly affecting the cell identity, but also leading to incorrect differentiation. A thorough characterization of the sgn2 mutant will follow elsewhere, yet preliminary results indicate that SGN2 encodes an Acyl-CoA N-acyltransferase. . In summary, with my work I have contributed a first set of molecular players of Casparian strip formation and initiated their characterization. Eventually, this might lead to an understanding of the molecular mechanisms of CS establishment in A.thaliana . This in turn will hopefully help to better understand nutrient uptake in higher plants and their response to environmental stresses. - Au sein des plantes vasculaires, l'endoderme représente un tissu protecteur mettant en place une barrière imperméable, empêchant n'importe quel élément de rejoindre les tissus conducteurs par simple diffusion. Cette barrière, appelée « Cadre de Caspary », correspond à une lignification de la paroi de l'endoderme et donne lieu à un cloisonnement de l'espace intercellulaire. Bien que cet élément de différenciation soit décrit en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements aboutissant à l'établissement du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. De plus, ce travail apporte de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent des domaines membranaires importants pour le transport des nutriments. Nous décrivons une nouvelle famille de protéines membranaires, les CASPs (« CAparian Strip membrane domain Proteins »), localisées dans un domaine membranaire longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). L'analyse moléculaire des CASPs indique qu'elles dirigent la formation du cadre de Caspary. Par ailleurs, une approche génétique directe nous a permis d'identifier 11 mutants ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants Schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) qui participent à la délimitation du CSD. L'absence de ces kinases aboutit à un domaine CSD incomplet, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. De plus, SGN1 semble réguler le positionnement du CSD au milieu de la paroi transversale de l'endoderme. SGN4 produit une enzyme de type NADPH oxydase impliquée dans la polymérisation du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une division anormale des cellules du cortex créant ainsi une nouvelle couche cellulaire incapable d'achever sa différenciation en endoderme. Quant à la mutation sgn2, bien que nous pensons qu'elle affecte une Acyl-CoA N-acyltransferase, sa caractérisation ne sera réalisée que prochainement. Au final, ce travail procure de nouveaux éléments sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importants afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles. - De par leur immobilité, les plantes terrestres n'ont pas d'autre choix que de puiser leurs ressources dans leur environnement direct. La plante extrait du sol les nutriments qui lui sont nécessaires et les redistribue grâce à des tissus conducteurs. Afin de ne pas s'intoxiquer, il est donc essentiel de pouvoir sélectionner les éléments entrant dans la racine. Etonnement, ce n'est pas la surface des racines qui permet ce contrôle mais un tissu interne appelé endoderme. Ce dernier forme une barrière imperméable qui entoure chaque cellule et crée une jointure permettant de bloquer le passage des éléments entre les cellules. Cette structure, appelée « cadre de Caspary », oblige les éléments à entrer dans les cellules de l'endoderme et à être ainsi sélectionnés. Bien que cette structure soit décrite en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements qui aboutit à la formation du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce travail apporte également de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent, organisent et dirigent le transport des nutriments. Nous décrivons comment certains éléments de la cellule, les protéines CASPs (CAsparian Strip membrane domain Proteins), sont organisées un domaine particulier des membranes afin de créer une plateforme de construction longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). Afin de déterminer ce qu'il se passerait si une plante ne possédait pas de cadre de Caspary, nous avons réalisé une mutagénèse, ou approche génétique directe, et identifié 11 mutants (individu ayant un gène défectueux conduisant à la perte d'une fonction) ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. Les gènes SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) servant à l'établissement de la plateforme de construction. L'absence de ces kinases aboutit à une base incomplète, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. Qui plus est, la kinase SGN1 semble réguler le positionnement de la plateforme au milieu de l'endoderme. Le gène SGN4 est par contre, impliqué dans la construction à proprement dite du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une nouvelle couche de cellules ressemblant à de l'endoderme mais incapable de former correctement une barrière identique au cadre de Caspary. Quant au dernier mutant, sgn2, bien que cette étude fournisse des indices permettant de comprendre pourquoi le mutant sgn2 est défectueux, nous n'expliquerons ce cas que prochainement. En résumé, ce travail procure de nouvelles connaissances sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importantes afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles.

A novel protein family mediates Casparian strip formation in the endodermis.

Polarized epithelia are fundamental to multicellular life. In animal epithelia, conserved junctional complexes establish membrane diffusion barriers, cellular adherence and sealing of the extracellular space. Plant cellular barriers are of independent evolutionary origin. The root endodermis strongly resembles a polarized epithelium and functions in nutrient uptake and stress resistance. Its defining features are the Casparian strips, belts of specialized cell wall material that generate an extracellular diffusion barrier. The mechanisms localizing Casparian strips are unknown. Here we identify and characterize a family of transmembrane proteins of previously unknown function. These 'CASPs' (Casparian strip membrane domain proteins) specifically mark a membrane domain that predicts the formation of Casparian strips. CASP1 displays numerous features required for a constituent of a plant junctional complex: it forms complexes with other CASPs; it becomes immobile upon localization; and it sediments like a large polymer. CASP double mutants display disorganized Casparian strips, demonstrating a role for CASPs in structuring and localizing this cell wall modification. To our knowledge, CASPs are the first molecular factors that are shown to establish a plasma membrane and extracellular diffusion barrier in plants, and represent a novel way of epithelial barrier formation in eukaryotes.

A member of the PLEIOTROPIC DRUG RESISTANCE family of ATP binding cassette transporters is required for the formation of a functional cuticle in Arabidopsis.

Although the multilayered structure of the plant cuticle was discovered many years ago, the molecular basis of its formation and the functional relevance of the layers are not understood. Here, we present the permeable cuticle1 (pec1) mutant of Arabidopsis thaliana, which displays features associated with a highly permeable cuticle in several organs. In pec1 flowers, typical cutin monomers, such as ω-hydroxylated fatty acids and 10,16-dihydroxypalmitate, are reduced to 40% of wild-type levels and are accompanied by the appearance of lipidic inclusions within the epidermal cell. The cuticular layer of the cell wall, rather than the cuticle proper, is structurally altered in pec1 petals. Therefore, a significant role for the formation of the diffusion barrier in petals can be attributed to this layer. Thus, pec1 defines a new class of mutants. The phenotypes of the pec1 mutant are caused by the knockout of ATP BINDING CASSETTEG32 (ABCG32), an ABC transporter from the PLEIOTROPIC DRUG RESISTANCE family that is localized at the plasma membrane of epidermal cells in a polar manner toward the surface of the organs. Our results suggest that ABCG32 is involved in the formation of the cuticular layer of the cell wall, most likely by exporting particular cutin precursors from the epidermal cell.

A mechanism for localized lignin deposition in the endodermis.

The precise localization of extracellular matrix and cell wall components is of critical importance for multicellular organisms. Lignin is a major cell wall modification that often forms intricate subcellular patterns that are central to cellular function. Yet the mechanisms of lignin polymerization and the subcellular precision of its formation remain enigmatic. Here, we show that the Casparian strip, a lignin-based, paracellular diffusion barrier in plants, forms as a precise, median ring by the concerted action of a specific, localized NADPH oxidase, brought into proximity of localized peroxidases through the action of Casparian strip domain proteins (CASPs). Our findings in Arabidopsis provide a simple mechanistic model of how plant cells regulate lignin formation with subcellular precision. We speculate that scaffolding of NADPH oxidases to the downstream targets of the reactive oxygen species (ROS) that they produce might be a widespread mechanism to ensure specificity and subcellular precision of ROS action within the extracellular matrix.

A spatial accommodation by neighboring cells is required for organ initiation in Arabidopsis.

Lateral root formation in plants can be studied as the process of interaction between chemical signals and physical forces during development. Lateral root primordia grow through overlying cell layers that must accommodate this incursion. Here, we analyze responses of the endodermis, the immediate neighbor to an initiating lateral root. Endodermal cells overlying lateral root primordia lose volume, change shape, and relinquish their tight junction-like diffusion barrier to make way for the emerging lateral root primordium. Endodermal feedback is absolutely required for initiation and growth of lateral roots, and we provide evidence that this is mediated by controlled volume loss in the endodermis. We propose that turgidity and rigid cell walls, typical of plants, impose constraints that are specifically modified for a given developmental process.

The endodermis.

A Casparian strip-bearing endodermis is a feature that has been invariably present in the roots of ferns and angiosperms for approximately 400 million years. As the innermost cortical layer that surrounds the central vasculature of roots, the endodermis acts as a barrier to the free diffusion of solutes from the soil into the stele. Based on an enormous body of anatomical and physiological work, the protective endodermal diffusion barrier is thought to be of major importance for many aspects of root biology, reaching from efficient water and nutrient transport to defense against soil-borne pathogens. Until recently, however, we were ignorant about the genes and mechanisms that drive the differentiation of this intricately structured barrier. Recent work in Arabidopsis has now identified the first major players in Casparian strip formation. A mechanistic understanding of endodermal differentiation will finally allow us to specifically interfere with endodermal barrier function and study the effects on plant growth and survival under various stress conditions. Here, I critically review the major findings and models related to endodermal structure and function from other plant species and assess them in light of recent molecular data from Arabidopsis, pointing out where the older, descriptive work can provide a framework and inspiration for further molecular dissection.

Suberization-the second life of an endodermal cell.

The endodermis is the innermost cortical cell layer that surrounds the central vasculature and deposits an apoplastic diffusion barrier known as the Casparian strip. Although discovered 150 years ago, the underlying mechanisms responsible for formation of the Casparian strips have only recently been investigated. However, the fate of the endodermal cell goes further than formation of Casparian strips as they undergo a second level of differentiation, defined by deposition of suberin as a secondary cell wall. The presence and function of endodermal suberin in root barriers has remained enigmatic, as its role in barrier formation is not clear, especially in respect to the already existing Casparian strips. In this review, we present recent advances in the understanding of suberin synthesis, transport to the secondary cell wall, developmental features and functions. We focus on some of the major unknown questions revolving the function of endodermal suberin, which we now have the means to investigate. We further provide thoughts on how this knowledge might expand our current models on the developmental and physiological adaptation of root in response to the environment.

The ABCG transporter PEC1/ABCG32 is required for the formation of the developing leaf cuticle in Arabidopsis.

The cuticle is an essential diffusion barrier on aerial surfaces of land plants whose structural component is the polyester cutin. The PERMEABLE CUTICLE1/ABCG32 (PEC1) transporter is involved in plant cuticle formation in Arabidopsis. The gpat6 pec1 and gpat4 gapt8 pec1 double and triple mutants are characterized. Their PEC1-specific contributions to aliphatic cutin composition and cuticle formation during plant development are revealed by gas chromatography/mass spectrometry and Fourier-transform infrared spectroscopy. The composition of cutin changes during rosette leaf expansion in Arabidopsis. C16:0 monomers are in higher abundance in expanding than in fully expanded leaves. The atypical cutin monomer C18:2 dicarboxylic acid is more prominent in fully expanded leaves. Findings point to differences in the regulation of several pathways of cutin precursor synthesis. PEC1 plays an essential role during expansion of the rosette leaf cuticle. The reduction of C16 monomers in the pec1 mutant during leaf expansion is unlikely to cause permeability of the leaf cuticle because the gpat6 mutant with even fewer C16:0 monomers forms a functional rosette leaf cuticle at all stages of development. PEC1/ABCG32 transport activity affects cutin composition and cuticle structure in a specific and non-redundant fashion.

PEC1/AtABCG32 transport function in cuticle biosynthesis

Most aerial parts of the plants are covered by a hydrophobic coating called cuticle. The cuticle is formed of cutin, a complex mixture of esterified fatty acids that are embedded and associated with waxes. The cuticle often appears as a superposition of layers of different composition: The cuticle proper formed of cutin and a mixture of waxes and underneath, the cuticle layer containing cutin, intracuticular waxes and polysaccharides of the cell wall. In addition to its involvement in plant development by preventing organ fusions, the cuticle acts as a barrier to prevent water loss and protect plants against environmental aggressions such as excessive radiation or pathogens attacks. PEC1/AtABCG32 is an ABC transporter from the PDR family involved in cutin biosynthesis. Characterization of the peci mutant in Arabidopsis thaliana showed that PEC1 plays a significant role in the diffusion barrier formation in leaves and petals. The cuticles of leaves and flowers of peci are permeable and the cuticular layer rather than the cuticular proper was altered in the petals, underlining the importance of this particular layer in the maintenance of the diffusion barrier. Chemical analysis on the flower cutin monomer composition of ped mutant revealed a decrease in hydroxylated cutin monomers, suggesting a function of PEC1 in the incorporation of these monomers in the polymer cutin. However, the exact nature of the substrates of PEC1 remained elusive. PEC1 homologues in barley and rice, respectively HvABCG31/EIBI1 and OsABCG31, are also implicated in cuticle biosynthesis. Interestingly, the rice mutant displays more severe phenotypes such as dwarfism and spreading necrosis conducting to the seedling death. In this work, we further characterized osabcg31 mutant and hairpin-RNAi downregulated OsABCG31 plant lines showing reduced growth and cuticle permeability. Our analysis showed a decrease in hydroxylated cutin monomers and severe disruptions in the cuticle, which explain the permeability. Further insights into the function of the cuticle in rice resistance/susceptibility to Pathogens were obtained after inoculation with Magnaporthe oryzae, the fungus responsible for the rice blast disease. Osabcg31 as well as the transgenic lines downregulating OsABCG31 showed increased resistance to the fungus. However, only later steps of infection are reduced . and no impact is obseived on the germination or penetration stages, suggesting that the cuticle disruption per se is not responsible for the resistance. We further investigated the cause of the resistance by analyzing the expression of defense related gene in osabcg31 prior to infection. We found that osabcg31 constitutively express defense related genes, which may explain the resistance, the dwarfism and the cell death. osabcg31 is thus a tool to study the connection between cuticle, plant development and defense signaling networks in rice. The transport function of PEC1 family members is still unknown. In order to link cutin biosynthesis and transport activity, we combined ped mutation with mutations in cutin synthesis related genes. Here, we show that PEC1 acts independently from GPAT4 and GPAT8 pathway and partially overlaps with GPAT6 biosynthesis pathway that leads to the production of hydroxylated C16 cutin precursor 2-Mono(10,16-dihydroxyhexadecanoylJglycerol (2-MHG). In addition, we noticed that despite a comparable cutin monomer composition, ped mutant leaves cuticle are permeable while that of gpat6 mutant are not. This finding raises the possibility of PEC1 being required for the incorporation of C16 hydroxylated monomers and their structural arrangement rather than their direct transport towards the cuticle. A careful investigation of the cuticle permeability, cutin composition and ultrastructure during leave development in Wt plants and ped mutants revealed a possible different regulation of several pathways of cutin biosynthesis and showed the importance of PEC1 function early during leave cuticle maturation. In order to elucidate the transport activity of PEC1, we successfully expressed PEC1 in Nicotiana benthamiana plant system for direct transport experiments. This system will be used to test the PEC 1-dependent transport of potential substrates such as sn-2-monoacylglycerol loaded with a hydroxylated C16 fatty acid. -- Toutes les parties aériennes des plantes sont recouvertes d'une couche hydrophobe appelée «cuticule». Cette cuticule est composée de cutine, un polymère d'acides gras estérifiés, et de cires. La cuticule apparaît souvent sous forme de couches superposées: une première couche extérieure appelée «cuticle proper» formée de cutine et d'un mélange de cires, et une deuxième couche, la «cuticle layer», formée de cutine associée à des cires intracuticulaires et des polysaccharides pariétaux. La cuticule joue le rôle de barrière prévenant contre la perte d'eau et les agressions environnementales. AtABCG32/PEC1 est un transporteur ABC de la famille des PDR impliqué dans la synthèse de la cutine. L'étude du mutant peci d'Arabidopsis thaliana a révélé une fonction de PEC1 dans la formation de la barrière de diffusion. La cuticule des feuilles et fleurs de peci est perméable. Des altérations de la «cuticle layer» ont été démontrées, soulignant son importance dans le maintien de la barrière. L'analyse de la composition de la cutine de peci a montré une réduction spécifique en monomères hydroxylés, suggérant un rôle de PEC1 dans leur incorporation dans la cuticule. Cependant, la nature exacte des substrats de PEC1 n'a pas été identifiée. PEC1 possède deux homologues chez l'orge et le riz, respectivement HvABCG31 et OsABCG31, et qui sont impliqués dans la biosynthèse de la cuticule. Chez le riz, des phénotypes plus sévères ont été observés tels que nanisme et nécroses conduisant à la mort des jeunes plants. Dans cette étude, nous avons continué la caractérisation de osabcg31 ainsi que des lignées de riz sous exprimant le gène OsABCG31 et présentant une cuticule perméable tout en ayant une meilleure croissance. Notre étude a démontré une réduction des monomères hydroxylés de cutine et une désorganisation de la structure de la cuticule, aggravée dans le mutant osabcg31. Ce résultat explique la perméabilité observée. Des mformations P|us approfondies sur l'implication de la cuticule dans la résistance aux pathogènes ont été obtenues après inoculation du mutant osabcg31 et les lignées sous- exprimant OsABCG31 avec une souche virulente de Magnaporthe Oryzae, le champignon responsable de la pyriculariose du riz. Les différentes lignées testées ont démontré une résistance au pathogène. Cependant, seules les étapes tardives de l'infection sont réduites et aucun impact n'est observé sur la germination des spores ou la pénétration du champignon, suggérant que les modifications de la cuticule ne sont pas directement à l'origine de la résistance. L'analyse de l'expression de gènes impliqués dans la résistance à Magnaporthe.oryzae a mis en évidence l'expression constitutive de ces gènes en l'absence de tout contact avec le pathogène. Ceci explique la résistance, le nanisme et la mort cellulaire observés. Ainsi, osabcg31 représente un outil efficace pour l'étude intégrée des systèmes de régulation de la défense, de développement des plantes et la cuticule. La nature des substrats transportés par PEC1/AtABCG32 reste inconnue. Dans le but d'établir une liaison entre biosynthèse de cutine et transport des précurseurs par PEC1, la mutation peci a été combinée avec des mutants impliqués dans différentes voies de biosynthèse. Cette étude a démontré une fonction indépendante de PEC1 de la voie de biosynthèse impliquant les enzymes GPAT4 et GPAT8, et une fonction partiellement indépendante de la voie impliquant GPAT6 qui mène à la production de précurseurs sn-2- monoacylglycerol chargés en acides gras en C16 (2-MHG). De plus, malgré un profil similaire en monomères de cutine, gpat6 conserve une cuticule imperméable alors que celle de PEC1 est perméable. Ceci suggère que PEC1 est nécessaire à l'incorporation des monomères en C16 et leur arrangement structurel plutôt que simplement à leur transport direct. L'étude approfondie de la perméabilité cuticulaire, de la structure ainsi que de la composition en cutine pendant le développement des feuilles de peci et la plante sauvage a révélé l'existence de différentes régulations des voies de biosynthèses des monomères et a démontré l'importance de PEC1 dans les premières étapes de la mise en place de la cuticule. Pour identifier les substrats transportés, l'expression de PEC1 chez le système hétérologue Nicotiana benthamiana a été conduite avec succès. Ce système sera utilisé pour tester le transport de substrats potentiels tels que le sn-2-monoacylglycerol chargé en acide gras en C16.