Development of molecular-based techniques for the detection, identification and quantification of food-borne pathogens

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos, enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados. En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.

Rapid microbiological detection method based on ultrasonic instrumentation

Los métodos de detección rápida de microorganismos se están convirtiendo en una herramienta esencial para el control de calidad en el área de la biotecnología, como es el caso de las industrias de alimentos y productos farmacéuticos y bioquímicos. En este escenario, el objetivo de esta tesis doctoral es desarrollar una técnica de inspección rápida de microoganismos basada en ultrasonidos. La hipótesis propuesta es que la combinación de un dispositivo ultrasónico de medida y un medio líquido diseñado específicamente para producir y atrapar burbujas, pueden constituir la base de un método sensible y rápido de detección de contaminaciones microbianas. La técnica presentada es efectiva para bacterias catalasa-positivas y se basa en la hidrólisis del peróxido de hidrógeno inducida por la catalasa. El resultado de esta reacción es un medio con una creciente concentración de burbujas. Tal medio ha sido estudiado y modelado desde el punto de vista de la propagación ultrasónica. Las propiedades deducidas a partir del análisis cinemático de la enzima se han utilizado para evaluar el método como técnica de inspección microbiana. En esta tesis, se han investigado aspectos teóricos y experimentales de la hidrólisis del peróxido de hidrógeno. Ello ha permitido describir cuantitativamente y comprender el fenómeno de la detección de microorganismos catalasa-positivos mediante la medida de parámetros ultrasónicos. Más concretamente, los experimentos realizados muestran cómo el oxígeno que aparece en forma de burbujas queda atrapado mediante el uso de un gel sobre base de agar. Este gel fue diseñado y preparado especialmente para esta aplicación. A lo largo del proceso de hidrólisis del peróxido de hidrógeno, se midió la atenuación de la onda y el “backscattering” producidos por las burbujas, utilizando una técnica de pulso-eco. Ha sido posible detectar una actividad de la catalasa de hasta 0.001 unidades/ml. Por otra parte, este estudio muestra que por medio del método propuesto, se puede lograr una detección microbiana para concentraciones de 105 células/ml en un periodo de tiempo corto, del orden de unos pocos minutos. Estos resultados suponen una mejora significativa de tres órdenes de magnitud en comparación con otros métodos de detección por ultrasonidos. Además, la sensibilidad es competitiva con modernos y rápidos métodos microbiológicos como la detección de ATP por bioluminiscencia. Pero sobre todo, este trabajo muestra una metodología para el desarrollo de nuevas técnicas de detección rápida de bacterias basadas en ultrasonidos. ABSTRACT In an industrial scenario where rapid microbiological methods are becoming essential tools for quality control in the biotechnological area such as food, pharmaceutical and biochemical; the objective of the work presented in this doctoral thesis is to develop a rapid microorganism inspection technique based on ultrasounds. It is proposed that the combination of an ultrasonic measuring device with a specially designed liquid medium, able to produce and trap bubbles could constitute the basis of a sensitive and rapid detection method for microbial contaminations. The proposed technique is effective on catalase positive microorganisms. Well-known catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is the fundamental of the developed method. The physical consequence of the catalase induced hydrogen peroxide hydrolysis is an increasingly bubbly liquid medium. Such medium has been studied and modeled from the point of view of ultrasonic propagation. Properties deduced from enzyme kinematics analysis have been extrapolated to investigate the method as a microbial inspection technique. In this thesis, theoretical and experimental aspects of the hydrogen peroxide hydrolysis were analyzed in order to quantitatively describe and understand the catalase positive microorganism detection by means of ultrasonic measurements. More concretely, experiments performed show how the produced oxygen in form of bubbles is trapped using the new gel medium based on agar, which was specially designed for this application. Ultrasonic attenuation and backscattering is measured in this medium using a pulse-echo technique along the hydrogen peroxide hydrolysis process. Catalase enzymatic activity was detected down to 0.001 units/ml. Moreover, this study shows that by means of the proposed method, microbial detection can be achieved down to 105 cells/ml in a short time period of the order of few minutes. These results suppose a significant improvement of three orders of magnitude compared to other ultrasonic detection methods for microorganisms. In addition, the sensitivity reached is competitive with modern rapid microbiological methods such as ATP detection by bioluminescence. But above all, this work points out a way to proceed for developing new rapid microbial detection techniques based on ultrasound.

Aplicación de la imagen hiperespectral para la detección de contaminación microbiana en espinaca fresca envasada.

La seguridad alimentaria de hortalizas de hoja puede verse comprometida por contaminaciones microbianas, lo que ha motivado la promoción mundial de normas de seguridad en la producción, el manejo poscosecha y el procesado. Sin embargo, en los últimos años las hortalizas han estado implicadas en brotes de Escherichia coli, Salmonella spp y Listeria monocytogenes, lo que obliga a plantear investigaciones que posibiliten la detección de contaminación por microorganismos con técnicas rápidas, no destructivas y precisas. La imagen hiperespectral integra espectroscopia e imagen para proporcionar información espectral y espacial de la distribución de los componentes químicos de una muestra. Los objetivos de este estudio fueron optimizar un sistema de visión hiperespectral y establecer los procedimientos de análisis multivariante de imágenes para la detección temprana de contaminación microbiana en espinacas envasadas (Spinacia oleracea). Las muestras de espinacas fueron adquiridas en un mercado local. Se sometieron a la inoculación mediante la inmersión en suspensiones con poblaciones iniciales de 5 ó 7 unidades logarítmicas de ufc de una cepa no patógena de Listeria innocua. Después de 15 minutos de inoculación por inmersión, las hojas fueron envasadas asépticamente. Se consideró un tratamiento Control-1 no inoculado, sumergiendo las espinacas en una solución tampón (agua de peptona) en lugar de en solución inoculante, y un tratamiento Control-2 en el que las hojas no se sometieron a ninguna inmersión. Las muestras se almacenaron a 8ºC y las mediciones se realizaron 0, 1, 3, 6 y 9 días después de inocular. Cada día se determinaron los recuentos microbianos y se adquirieron las imágenes con una cámara VIS-NIR (400-1000 nm). Sobre los gráficos de dispersión de los scores de PC1 y PC2 (análisis de componentes principales computados sobre las imágenes hiperespectrales considerando el rango de 500-940 nm) se reconocieron diferentes patrones que se identificaron con niveles de degradación; así se seleccionaron píxeles que conformaron las clases de no degradados, semi-degradados y degradados. Se consideraron los espectros promedio de cada clase para asignar los píxeles anónimos a una de las tres clases. Se calculó la distancia SAM (Spectral Angle Mapper) entre el espectro promedio de cada categoría y cada espectro anónimo de las imágenes. Cada píxel se asignó a la clase a la que se calcula la distancia mínima. En general, las imágenes con los porcentajes más altos de píxeles levemente degradados y degradados correspondieron a contenidos microbiológicos superiores a 5 unidades logarítmicas de ufc.

Detección oportuna de niños en riesgo pre-lector : ponderación del valor potencial de instrumentos de evaluación de la consciencia fonológica

Se evalúan validez, confiabilidad y nivel de dificultad de instrumentos de evaluación de la conciencia fonológica, a fin de analizar su potencialidad como herramientas de detección oportuna, de pre-lectores en riesgo en una muestra de niños que crecen en un ambiente de vulnerabilidad social. Los instrumentos se seleccionaron en función de los dos niveles de CF: unidad lingüística y nivel de dificultad. Se ponderó la validez del instrumento mediante la técnica de análisis de contenido de investigaciones previas. Obtuvo buena confiabilidad (alpha de Cronbach: 0.84) y potencialidad discriminativa. Se hallan niveles diferenciales de dificultad en la resolución de las distintas tareas en pre-lectores en riesgo en comparación con buenos lectores de la misma edad. El análisis de regresión simple destaca el valor predictivo de las tareas de evaluación seleccionadas en este estudio sobre el posterior nivel alcanzado por los niños en habilidades básicas de la lectura.

Efecto del mal seco (Pythium myriotylum Drechs) en campo y sombreadero sobre la agromorfología de quince accesiones de quequisque (Xanthosoma spp) desarrollo de síntomas y detección microbiológica

El quequisque ( Xanthosoma spp.), familia Aráceae, es importante para el consumo interno y la exportación en Nicaragua, tiene como problema principal al mal seco ( Pythium myriotylum Drechs ) , que causa la pérdida total del rendimiento. Se establecieron cuatro ensayos para evaluar el efecto del mal seco sobre agromorfología de 15 accesiones de quequisque en suelos con (scams) y sin antecedentes de mal seco (ssams). Ensayo I: se evaluó el efecto del mal seco sobre la agromorfología de 15 accesiones en scams en Nueva Guinea. Se empleó el diseño BCA con tres bloques. Ensayo II: se estableció en DCA, se evaluó el comportamiento de 7 de las accesiones en ssams y se comparó con el rendimiento obtenido en scams. Ensayo III: se cultivó raíces de plantas infectadas en los medios de cultivo AN, V-8 y PARC y dilución en serie del scams para verificar la presencia de P myriotylum . Ensayo IV: se evaluó el desarrollo de síntomas de la enfermedad en las raíces, se establecieron 14 accesiones en scams en bolsas de polietileno (15 plantas por accesión) en sombreadero. Todas las accesiones desarrollaron mal seco, produjeron plantas débiles de 30-40 cm de altura, con tres hojas máximo y ningún rendimiento. Las accesiones en ssams reportaron 3-12 t ha -1 de rendimientos promedios. Las plantas en scams registrar on 91-100 % de pérdidas en el rendimiento. La infección en las raíces ocurre a partir de los 21 días después de la siembra, la planta genera nuevas raíces que también se infectan y muere por agotamiento de las reservas. La dilución en serie no resultó en el aislamiento del patógeno. Sembrar raíces recién infectadas resultó en la presencia de micelios del hongo en los medios V-8 y PARC.

Valores éticos del médico en la detección del posible donante de órganos

Resumen: La necesidad de órganos para trasplante exige que los médicos de áreas críticas sean competentes en detectar, entre sus pacientes, a posibles donantes. La baja frecuencia de comunicaciones a los equipos de procuración no corresponde con la gran cantidad de pacientes críticos que potencialmente podrían ser donantes. La brecha entre lo ideal, lo esperado y lo real induce a sospechar que los meros conceptos técnico- operativos serían insuficientes y que habría nociones que participan de este reconocimiento y cuestionan al profesional sobre lo correcto. Se tratarían de “valores éticos”. Este trabajo pretende hacer una descripción de esos valores como expresión del acto moral de la elaboración del diagnóstico de “potencial donante”, diagnóstico que deberá poseer certeza suficiente para persuadir al médico sobre lo correcto de esta detección

Detección del movimiento cíclico estacional en edificios históricos por métodos topográficos

[ES] Para más información véase el trabajo LDGP_mem_003-2: "Estudio topográfico de las deformaciones del conjunto arquitectónico de la iglesia de Nuestra Señora de la Blanca (Agoncillo, La Rioja) [Julio 2007 – Octubre 2009]", http://hdl.handle.net/10810/7050

Detección de límites arquitectónicos en edificios históricos combinando imágenes digitales con nubes de puntos

[ES] El proyecto estudia algoritmos de detección de bordes aplicados a imágenes fotográficas y procedentes de nubes de puntos, posteriormente combina los resultados y analiza las posibilidades de mejora de la solución conjunta.

Detección automática de presencia/ausencia de atún en imágenes obtenidas mediante sonar de largo alcance a bordo de buques pesqueros y aplicación de Optical Character Recognition (OCR) para la extracción de parámetros

En esta tesis de máster se presenta una metodología para el análisis automatizado de las señales del sonar de largo alcance y una aplicación basada en la técnica de reconocimiento óptico de Optical Character Recognition, caracteres (OCR). La primera contribución consiste en el análisis de imágenes de sonar mediante técnicas de procesamiento de imágenes. En este proceso, para cada imagen de sonar se extraen y se analizan las regiones medibles, obteniendo para cada región un conjunto de características. Con la ayuda de los expertos, cada región es identi cada en una clase (atún o no-atún). De este modo, mediante el aprendizaje supervisado se genera la base de datos y, a su vez, se obtiene un modelo de clasi cación. La segunda contribución es una aplicación OCR que reconoce y extrae de las capturas de pantalla de imágenes de sonar, los caracteres alfanuméricos correspondientes a los parámetros de situación (velocidad, rumbo, localización GPS) y la confi guración de sonar (ganancias, inclinación, ancho del haz). El objetivo de este proceso es el de maximizar la e ficiencia en la detección de atún en el Golfo de Vizcaya y dar el primer paso hacia el desarrollo de un índice de abundancia de esta especie, el cual esté basado en el procesamiento automático de las imágenes de sonar grabadas a bordo de la ota pesquera durante su actividad pesquera rutinaria.

Metodología para la detección y localización de faltas en redes de distribución con puesta a tierra activa

pag. var.

Desarrollo de métodos de detección de salmonella basados en la reacción en cadena de la polimerasa y su validación en muestras alimentarias

224 p.

Detección de personas basada en HOG y SVM

El presente proyecto se centra en proteger a los peatones de las vías urbanas o de una fábrica donde conviven con robots móviles, pues son los mayores afectados en los acci- dentes producidos en estos entornos. El objetivo es diseñar un algoritmo basado en visión monocular capaz de detectar a los usuarios de forma rápida y precisa de tal forma que se tenga constancia en todo momento de los peatones que se encuentran delante del vehículo.

Detección de comunidades en redes complejas basada en la sincronización

El estudio de las redes complejas atrae cada vez más el interés de muchos investigadores por muchas razones obvias. Muchos sistemas tanto reales como tecnológicos pueden representarse como redes complejas, es decir, un conjunto de entidades en interacción de acuerdo a propiedades topológicas no triviales. La interacción entre los elementos de la red puede describir comportamientos globales tales como el tráfico en Internet, el servicio de suministro de electricidad o la evolución de los mercados. Una de las propiedades topológicas de los grafos que caracterizan estos sistemas complejos es la estructura de comunidad. La detección de comunidades tiene como objetivo la identificación de los módulos o grupos con alguna o varias propiedades en común basándose únicamente en la información codificada en la topología del grafo. La detección de comunidades es importante no sólo para caracterizar el grafo, sino que además ofrece información sobre la formación de la red así como sobre su funcionalidad. El estudio de las leyes subyacentes que gobiernan la dinámica y evolución de los sistemas complejos y la caracterización de sus grafos revela que las redes a gran escala, generalmente, se caracterizan por topologías complejas y estructuras heterogéneas. La estructura de conectividad de estas redes se manifiesta por la presencia de comunidades (clusters o grupos), es decir, conjuntos de nodos que comparten propiedades comunes o juegan roles similares en la red. Las comunidades pueden representar relaciones de amistad en las redes sociales, páginas web con una temática similar, o rutas bioquímicas en las redes metabólicas. Formalmente, una red es un grafo compuesto por un gran número de nodos altamente interconectados donde una comunidad se resalta por la presencia de un gran número de aristas conectando nodos dentro de grupos individuales, pero con baja concentración de aristas entre estos grupos. El mejor modo para establecer la estructura de comunidad de una red compleja es un problema todavía sin resolver. Durante los últimos años, se han propuesto muchos algoritmos que persiguen extraer la partición óptima de una red en comunidades. El clustering espectral, los algoritmos de particionamiento de grafos, los métodos basados en la modularidad o los algoritmos basados en la sincronización son sólo algunos de estos algoritmos de extracción de comunidades. Los algoritmos dinámicos basados en la sincronización han sido estudiados por varios autores, y han demostrado que la monitorización del proceso dinámico de la sincronización permite revelar las diferentes escalas topologicas presentes en una red compleja. Muchos de estos algoritmos se basan en el modelo Kuramoto o en algunas de sus variantes como el modelo de opinión, donde cada oscilador aislado es modelado en un espacio unidimensional. El objetivo principal del presente proyecto es la implementación de un algoritmo de detección de comunidades basado en la sincronización de osciladores acoplados. Cada oscilador ha sido modelado mediante el sistema dinámico de Rossler, un sistema de ecuaciones diferenciales definido en un espacio tridimensional.

Capacidade de selamento de três materiais retrobturadores frente à infiltração microbiana por Enterococcus faecalis

O objetivo deste estudo foi comparar a capacidade de selamento apical de três materiais retrobturadores em dentes submetidos à infiltração microbiana por Enterococcus faecalis. Além de analisar a ocorrência da infiltração microbiana em relação à variável tempo. Para tal, foram utilizados 80 caninos superiores permanentes humanos extraídos, instrumentados com o sistema rotatório ProTaper Universal (MAILLEFER) e obturados pela técnica de compactação lateral, com dois tipos de cimento endodôntico: Endofill (DENTSPLY) e AH Plus (DENTSPLY). A apicetomia foi realizada com a remoção de 3mm do terço apical e o retropreparo confeccionado com pontas ultrasônicas. As amostras foram subdivididas, aleatoriamente, em 6 grupos com 10 dentes cada, e 2 grupos controles. Os materiais utilizados para a retrobturação foram MTA branco (ANGELUS), IBC BioAggregate (INNOVATIVE BIOCERAMIX INC.) e Acroseal (SEPTODONT). Foram confeccionados dispositivos para fixação dos dentes aos tubos Eppendorfs. As amostras foram inoculadas com cepas de E. faecalis e incubadas a 37C, por um período de 90 dias, para análise da presença de turvação do meio Enterococcosel. Para a realização da análise estatística foram utilizados os seguintes testes: Qui-quadrado com Prova Exata de Fisher e Kruskal-Wallis. Os resultados mostraram que todos os grupos nos quais foi realizada a obturação e a posterior retrobturação apresentaram infiltração. Comparando todos os grupos, não houve diferença significativa entre os materiais testados. Em relação apenas aos materiais retrobturadores, o Acroseal obteve a menor infiltração, seguido do MTA branco e do IBC BioAggregate. As amostras obturadas com o cimento Endofill não apresentaram diferença estatística em relação à variável tempo. Porém, nas amostras obturadas com o cimento AH Plus, houve maior ocorrência de infiltração nas amostras retrobturadas com o IBC BioAggregate e menor infiltração nas amostras retrobturadas com Acroseal, com diferença estatisticamente significante ao nível de 10%.

Emprego de microscopia de fluorescência para a quantificação microbiana em amostras salinas da indústria do petróleo

Os micro-organismos constituem um grande problema em termos econômicos para a indústria petrolífera. Estes são responsáveis pela produção de substâncias corrosivas e a formação de biofilmes, que causam deterioração dos materiais metálicos. Os principais grupos microbianos presentes em amostras ambientais da indústria do petróleo são as bactérias anaeróbias heterotróficas totais (BANHT) e as bactérias redutoras de sulfato (BRS). Atualmente, a quantificação desses grupos microbianos é realizada através da técnica do Número Mais Provável (NMP) que estima o resultado em aproximadamente 28 dias. Neste trabalho foi otimizada uma metodologia para a microscopia de fluorescência de amostras salinas provenientes de tanques de armazenamento de água/óleo. As condições testadas foram o tipo de óleo de imersão, o tipo de diluente, o volume do corante, o volume da amostra corada e a concentração do fixador (glutaraldeído) numa tentativa de correlacionar com resultados de quantificação de BANHT e BRS através da técnica convencional do NMP. Nesse caso, as células totais foram quantificadas por microscopia de fluorescência utilizando o corante fluorescente laranja de acridina (AO). Verificou-se que houve uma correlação entre os resultados da quantificação de células totais por microscopia de fluorescência e os resultados de BANHT pela técnica do NMP, devido a pouca variação de valores expressos em ambas as quantificações. Entretanto, não foi possível correlacionar os resultados da quantificação de células totais com os resultados de BRS por NMP devido à grande variação dos valores de quantificação de BRS. Na microscopia de fluorescência, foi possível, quantificar os micro-organismos em aproximadamente 30 minutos e através das fotografias, verificou-se ainda que as amostras apresentaram-se nítidas e os micro-organismos com uma boa fluorescência