Detección de mutaciones en el oncogen k - ras en neoplasias epiteliales colorrectales

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Biología Molecular e Ingenieria Genética) UANL

Detección de mutaciones en el gen CFTR en la población del Noreste de México

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Biología Molecular e Ingeniería Genética) UANL

Detección de mutaciones en el gen EDA1 en pacientes mexicanos con displasia ectodérmica ligada al cromosoma X.

Tesis (Doctor en Medicina) UANL, 2014.

Detección de mutaciones en el gen CFTR en una población de pacientes pediátricos con asma en la ciudad de Bogotá

Introducción: El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. Se asocia a hiperreactividad bronquial que lleva a episodios recurrentes de sibilancias, disnea y tos, articularmente en la noche o en la madrugada. Estos episodios se asocian con obstrucción de la vía aérea la cual es reversible con farmacoterapia. Esta enfermedad constituye un problema de salud pública a nivel mundial y su prevalencia en Colombia es cerca del 8%. Dentro los factores que contribuyen al desarrollo del asma se encuentran los ambientales y los genéticos. Se han realizado más de 500 investigaciones de asociación y en ellas el gen de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) ha emergido como un gen candidato que participa en la patofisiología del asma. Sin embargo, la asociación entre mutaciones en el gen CFTR y el desarrollo de asma es hasta el presente controversial. Algunos de los estudios realizados han establecido que el estado de portador de mutaciones en el gen CFTR contribuye a la aparición de asma, otros afirman que estas mutaciones pueden participar como un factor protector e impedir el desarrollo de la enfermedad y algunas investigaciones han arrojado la ausencia de cualquier tipo de asociación. Objetivos: En el presente estudio se busca determinar la frecuencia de las mutaciones más frecuentemente causantes de FQ en Colombia, en una muestra de pacientes pediátricos asmáticos de la ciudad de Bogotá. Materiales y Métodos: Se genotipificaron 101 pacientes pediátricos con diagnóstico clínico y paraclínico de asma, se realizo extracción de ADN y análisis molecular para las mutaciones de p.F508del, c.1881+1.6 KbA>G, p.G542X y 621+1G>T del gen de la Fibrosis Quística, mediante amplificación por PCR utilizando primers específicos, seguida de digestión con enzimas de restricción y electroforesis en geles de poliacrilamida. Resultados y Discusión: Se identificaron dos portadores: uno para la mutación p.F508del y otro para la mutación p.G542X. Según estos hallazgos la tasa de portadores para estas mutaciones es de 1 en 50. Conclusión: No hay diferencia estadísticamente significativa entre la tasa de portadores de la mutación p.F508del en la población Colombiana (1/84) y la muestra analizada (p < 0.05). Sin embargo, no es posible establecer si existe una asociación entre el estado de portador y el desarrollo de asma.

Detección de mutaciones en el gen park2 en pacientes con enfermedad de Parkinson de inicio temprano en población colombiana

Introducción: La Enfermedad de Parkinson (EP) fue descrita por primera vez por James Parkinson en 1817, es el segundo desorden neurodegenerativo más frecuente después de la enfermedad de Alzheimer. Los síntomas aparecen por una deficiencia de dopamina causada por la degeneración y perdida de las neuronas dopaminérgicas en diversas regiones del cerebro, principalmente la sustancia nigra. Se sabe actualmente que existen factores genéticos involucrados en el desarrollo de la enfermedad, principalmente en la EP de inicio temprano. Uno de los genes, que según diversos reportes ha sido frecuentemente implicado con el desarrollo de la enfermedad es el gen PARK2 o PRKN que codifica para la proteína Parkina, una proteína de 465 aminoácidos. Se conoce que la proteína Parkina tiene función de ligasa de las proteínas ubiquitinadas; las mutaciones que se han podido identificar en Parkina llevan a la pérdida de su función, reduciendo su capacidad de regular la degradación de sustratos. Metodología: Se realizó un estudio observacional descriptivo de tipo cross sectional.Para ello se evaluaron 29 pacientes diagnosticados con EP de inicio temprano (anterior a los 40 años de edad) y de 21 individuos sanos que se utilizaron como control. Se tomó una muestra de sangre periférica a los pacientes y controles, y se procedió a realizar la extracción de DNA. Posteriormente se estandarizaron las condiciones para la técnica de PCR para la amplificación de los exones 3, 4, y 5 en cada individuo. Todos los productos amplificados se sometieron a secuenciación automática para evaluar posibles mutaciones y polimorfismos en la población de estudio.

Claudin-19 mutations and clinical phenotype in Spanish patients with familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis.

Familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis is an autosomal recessive tubular disorder characterized by excessive renal magnesium and calcium excretion and chronic kidney failure. This rare disease is caused by mutations in the CLDN16 and CLDN19 genes. These genes encode the tight junction proteins claudin-16 and claudin-19, respectively, which regulate the paracellular ion reabsorption in the kidney. Patients with mutations in the CLDN19 gene also present severe visual impairment. Our goals in this study were to examine the clinical characteristics of a large cohort of Spanish patients with this disorder and to identify the disease causing mutations. We included a total of 31 patients belonging to 27 unrelated families and studied renal and ocular manifestations. We then analyzed by direct DNA sequencing the coding regions of CLDN16 and CLDN19 genes in these patients. Bioinformatic tools were used to predict the consequences of mutations. Clinical evaluation showed ocular defects in 87% of patients, including mainly myopia, nystagmus and macular colobomata. Twenty two percent of patients underwent renal transplantation and impaired renal function was observed in another 61% of patients. Results of the genetic analysis revealed CLDN19 mutations in all patients confirming the clinical diagnosis. The majority of patients exhibited the previously described p.G20D mutation. Haplotype analysis using three microsatellite markers showed a founder effect for this recurrent mutation in our cohort. We also identified four new pathogenic mutations in CLDN19, p.G122R, p.I41T, p.G75C and p.G75S. A strategy based on microsequencing was designed to facilitate the genetic diagnosis of this disease. Our data indicate that patients with CLDN19 mutations have a high risk of progression to chronic renal disease.

Identificación de regiones del ADN con baja frecuencia de lectura

[ES] El ADN es un polímero que contiene la mayor parte de la información necesaria para el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos. La información está fraccionada en diferentes segmentos, los genes, que contienen variables que son individuales y que determinan las características de cada persona. Hay dos que son de especial importancia para la atención sanitaria: la susceptibilidad genética de padecer una enfermedad y la capacidad de responder de forma diferencial a un medicamento, denominado farmacogenética. Poder identificar dichas variantes puede ayudar a comprender la enfermedad e individualizar el tratamiento del paciente respectivamente. Para conocer estas variantes debemos conocer la secuencia de ADN de los genes implicados en las patologías o en las características farmacogenéticas para un individuo determinado, un proceso denominado secuenciación. Sin embargo, existen técnicas para seleccionar y secuenciar el exoma, que es la parte del genoma que contienen los exones, fracciones de los genes que contienen la información necesaria para la fabricación de las proteínas. La secuenciación de exoma cubre la mayor parte de los exones del genoma, pero no detecta algunas regiones, lo que imposibilita la detección de variantes en ellas. Este hecho crea una incertidumbre diagnóstica, lo que limita el poder de esta herramienta para la detección de mutaciones patogénicas. Así, el objetivo principal del Trabajo Fin de Grado es la creación de una herramienta informática que permita al personal clínico, la detección de regiones del exoma con poca cobertura de secuenciación, es decir, regiones del ADN con una frecuencia de lectura baja comparándolo con respecto al genoma de referencia.

Detección molecular de mutaciones de genes asociados al síndrome de deficiencia de la hormona del crecimiento humano

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Biología Molecular e Ingeniería Genética) UANL

Rastreo de mutaciones para la detección del cáncer de ovario

Introducción. La Secretaría de Salud enfoca sus campañas de prevención y diagnóstico oportuno de cánceres ginecológicos a los tumores de mama y cervicouterino, dejando un poco en el olvido a los de endometrio y ovario. Estos dos últimos comienzan a reclamar atención debido a la falta de métodos certeros de diagnóstico. Es por ello que el presente trabajo pretende sentar las bases para el desarrollo de una futura prueba de diagnóstico molecular utilizando el Papanicolaou en base líquida; este ambicioso enfoque toma como punto de partida la descripción de las variantes genéticas presentes en población mexicana, pues a la fecha no existe un estudio que muestre este conocimiento genético. Los genes BRCA1/2 son genes cuyas mutaciones emblemáticas están presentes en el desarrollo del cáncer de ovario y que se toma como un punto de partida para los siguientes análisis de secuenciación de nueva generación. Materiales y Métodos. Al ser un primer aporte de esta nueva línea de investigación, el proyectó contempló la recolección de tumores en muestras de tejido embebido en parafina, tanto provenientes del ovario como del endometrio. Además, inició con el reclutamiento de pacientes con alguna de éstas dos neoplasias a las cuales se les solicitó una muestra de sangre, Papanicolaou en base líquida y biopsia de tejido tumoral. A todas las muestras se les realizó la extracción de su ADN para su ingresó al Biobanco Piloto Institucional y posteriormente se realizaron estudios de secuenciación de nueva generación utilizando la plataforma Illumina y teniendo como blanco de estudio a los genes BRCA1/2. Únicamente se secuenció el ADN proveniente de los tumores de ovario. Resultados. Se aportaron 50 muestras de tumores de ovario y 60 muestras de tumores de endometrio, así como cinco pacientes con cáncer de ovario y seis con cáncer de endometrio de los que, además del tumor, se obtuvo una muestra de su sangre y una más de Papanicolaou en base líquida. El análisis bioinformático de la secuenciación arrojó la presencia de 174 variantes distribuidas en 48 de las 50 muestras analizadas; 70 variantes habían sido reportadas previamente y el resto fue reportado por vez primera. Destacaron ocho variantes patogénicas (rs80356862, rs80358027, rs80358981, rs80357219 y rs80357260 en BRCA1, y rs80358557 y rs80359775 en BRCA2) y una muestra portadora de 70 variantes (tres de ellas patogénicas) las cuales comprometen la función de las proteínas producidas. Conclusión: El presente trabajo aportó una colección debidamente resguardada de tumores de ovario y otra de endometrio. En la colección de aquellos tumores de ovario se logró describir las variantes polimórficas presentes en los genes BRCA1/2, siendo el primer estudio de este tipo en la República Mexicana. El conocimiento aquí generado coloca las bases para la búsqueda de aquellas averías genéticas emblemáticas de este tumores, en pro del futuro desarrollo de una prueba de diagnóstico molecular para su detección oportuna.

Detección precoz de cáncer de cérvix según los discursos de las matronas de atención primaria en Segovia, España

OBJETIVO: Analizar los discursos de las matronas de atención primaria sobre el acceso y la utilización del Programa Preventivo de Cáncer de Cérvix. PROCEDIMIENTOS METODOLÓGICOS: Se desarrolló un estudio cualitativo en un área de baja densidad poblacional, Segovia, España, que cuenta con un alto porcentaje de población rural, entre 2008 y 2009. Se utilizó como técnica la entrevista semi-estructurada. Se realizaron diez entrevistas a las matronas de atención primaria de las 16 Zonas Básicas de Salud. El análisis de la información se basó en las propuestas de la Teoría Fundamentada. ANÁLISIS DE RESULTADOS: El acceso y utilización del Programa Preventivo de Cáncer de Cérvix se relaciona con la utilización de la consulta de la matrona por las mujeres, sus vivencias de los exámenes de citología vaginal y su percepción de riesgo a padecer un cáncer de cuello uterino. La barrera percibida es la distancia para acceder a la consulta de la matrona, y para las mujeres inmigrantes, además son barreras la posibilidad de no disponer de tarjeta sanitaria y desconocer la existencia del Programa. La exclusión social es también considerada una barrera de acceso y utilización. Se identificó como el principal facilitador, la recomendación de los médicos de familia de participar en el Programa. CONCLUSIONES: Las matronas perciben desigualdades de acceso y utilización del Programa Preventivo de Cáncer de Cérvix que se relacionan tanto con características individuales de las mujeres, como con el medio geográfico donde viven y con la propia estructura del Programa. Hay situaciones de vulneración de la equidad en colectivos de mujeres poco representadas a nivel encuestal, como las mujeres inmigrantes y las que residen en zonas rurales.

Utilidad de las muestras de sangre total desecada en papel de filtro en la detección de anticuerpos antitoxoplasma

Se compara la técnica de Aglutinación Directa (AD) utilizando muestras de sangre total desecada en papel de filtro, con la técnica de ELISA y la misma AD utilizando muestras de suero de los mismos pacientes, para la detección de anticuerpos antitoxoplasma. Los resultados muestran la validez del método de la sangre desecada en papel de filtro para la detección de anticuerpos antitoxoplasma con la técnica de AD, y se considera su utilidad en los estudios epidemiológicos de campo.

Detección de portadores asintomáticos de quistes hidatídicos: aumento de la especificidad del ensayo inmunoenzimático

Una de las actividades que realizan los programas de control de hidatidosis causada por Echinococcus granulosus en la República Argentina es la búsqueda de portadores asintomáticos de quistes hidatídicos entre la población general que habita las áreas de riesgo, mediante un ensayo inmunoenzimático (EIE) con antígeno de liquido hidatídico total (EIE-ALHT) que selecciona los posibles portadores. En base a la experiencia recogida se ha observado que dependiendo de la prevalencia del área, entre el 10% y el 30% de las personas seleccionadas por el EIE con valores de densidad óptica (DO > DO + 4S no presentan imagenes compatibles con quistes hidatídicos. El propósito del estudio fue mejorar la especificidad de la prueba. Con ese fin, se evaluó la influencia de la modificación de la oferta antigénica y el efecto de la absorción de los anticuerpos anti-componentes séricos ovinos y anti-fosforilcolina de los sueros en estudios. 114 sueros no hidatídicos seleccionados por su alto nivel de reacciones cruzadas en EIE-ALHT y 118 sueros hidatídicos se estudiaron frente a 4 fracciones antigénicas de liquido hidatídico ovino. El EIE que empleo la fracción antigénica S2B conjuntamente con la absorción previa de los sueros (EIE-S2B/A) fue el sistema que mejor discriminó los sueros hidatídicos de los no hidatídicos con altos niveles de anticuerpos no relacionados con la presencia de quistes. Se propone el empleo del sistema EIE-S2B/A para la búsqueda a campo de portadores asintomáticos de quistes hidatídicos en reemplazo del EIE-ALHT actualmente en uso. Las 4 fracciones antigénicas fueron analizadas por doble difusión y SDS-PAGE. La fracción S2B se caracterizó como enriquecida en componentes parasitarios de menos de 30 Kd entre los cuales se encontrarian el antígeno B y subunidades o fragmentos del antígeno 5.

UltramicroELISA para la detección de anticuerpos IgM anti M. leprae

La disponibilidad del sistema Ultramicroanalítico (SUMA) y de un antígeno especie-específico del M. leprae obtenido mediante síntesis química, permitió la normalización y validación de un ultramicroELISA para la detección de anticuerpos IgM específicos a esta micobacteria. El análisis de 433 sueros de banco de sangre y 265 sueros usados para validar el método y clasificados en un grupo control de donantes de banco de sangre (100), un grupo de pacientes tuberculosos (50), un grupo de enfermos de lepra (65) y un grupo de contactos de estos enfermos (50), mostró la especificidad del ensayo para evidenciar la infección con el M. leprae. Los resultados obtenidos del estudio adicional de 140 muestras de suero de contactos de enfermos estuvieron estrechamente correlacionados (r = 0,98) con los resultados obtenidos por la técnica de microELISA convencional. La utilización del SUMA no solo permite un notable ahorro de reactivos si no además facilita la lectura, cálculo, validación y almacenamiento automático de los resultados.

Evaluación del método de ELISA para detección de antígenos y complejos inmunes circulantes de Trypanosoma cruzi a través de un estudio de campo en una zona endémica de Argentina

En una zona endémica de la República Argentina se llevó a cabo un ensayo de campo de la prueba inmunoenzimática ELISA para la detección de antígenos (cAg) y complejos inmunes circulantes (CIC) en sueros de pacientes chagásicos crónicos. Del total de 215 muestras de sangre analizadas, 51 fueron positivas para ELISA-CIC y 45 lo fueron para ELISA-cAg. De los 74 (34,32% de la población) sujetos considerados infectados con dos reacciones serológicas positivas, 49 (66,21%) presentaron CIC en suero, en tanto que en 43 (58,11%) de ellos se encontró cAg por ELISA. Solo en 2 casos serológicamente no reactivos, se detectaron inespecíficamente CIC y cAg. Dentro del grupo considerado no infectado, se observó reactividad inespecífica de bajo título por una de las pruebas serológicas en 16 (11,35%) de 141 individuos. Estos sueros arrojaron resultados consistentemente negativos por ELISA-CIC y cAg demostrando la utilidad de estos métodos de diagnóstico antigénico en casos de serología conflictiva. La determinación de fracciones antigénicas circulantes por ELISA en individuos chagásicos crónicos permite evidenciar la infección por T. cruzi de manera más directa que midiendo la respuesta inmune humoral en el huésped, presentando además mayor sensibilidad que el diagnóstico parasitológico clásico