Altération de l’interaction entre la PTH et LRP6 dans les ostéoblastes humains arthrosiques via DKK2

L’ostéoarthrose (OA) se caractérise par une perte du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, et une inflammation de la membrane synoviale. Des études in vivo et in vitro indiquent que les modifications du tissu osseux sont responsables de la perte du cartilage articulaire. Les ostéoblastes (Ob) OA présentent une réduction de la réponse à l’hormone parathyroïdienne (PTH), un signal anabolique important pour le tissu osseux, versus les Ob normaux. Le récepteur à la PTH (PTH-R) interagit avec le LRP6, le récepteur des ligands Wnts, et les antagonistes Dickkopf (DKK) bloquent cette interaction. Puisque le niveau de DKK2 est élevé en réponse au TGF-β1 dans les OA Ob, nous proposons que DKK2 altère l’interaction LRP6/PTH-R, le recyclage de PTH-R, et inhibe la réponse à la PTH. Nous avons utilisé des Ob OA et normaux humains en culture primaire. L’expression de PTH-R, LPR6 et DKK2 est mesurée par RT-PCR. Les niveaux protéiques de LRP6, PTH-R et DKK2 ont été déterminés par immunobuvardage. L’inhibition de DKK2 s’est effectuée par siRNA et l’AMP cyclique (AMPc) a été mesurée par ELISA. L’effet de TGF-β1 sur l’expression de DKK2 et PTH-R a été testé sur des cellules d’ostéosarcome SaOS-2. L’expression de PTH-R et LRP6 est similaire entre Ob normaux et OA, mais le niveau protéique de PTH-R est réduit dans les Ob OA. Par contre, l’expression et la production de DKK2 sont plus élevées dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 ne modifia pas l’expression de LRP6 et PTH-R dans les Ob OA mais a augmenté le niveau protéique de PTH-R détecté par immunobuvardage alors que celui de LRP-6 demeura inchangé. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA entraîna une augmentation de PTH-R dans la fraction membranaire et une diminution de la fraction intracellulaire. Les résultats de l'inhibition de la voie de clathrine par le triflupromazine ont montré une expression accrue du récepteur PTH dans la fraction membranaire qui peut être due à l'inhibition de sa dégradation par la voie de clathrine. L’induction de DKK2 dans les cellules SaOS-2 par TGF-β1 entraîna l’inhibition de PTH-R mais non celle de LRP6. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA a stimulé la production d’AMPc en réponse à la PTH par les Ob OA. En outre, le traitement de TGF-β1 dans les cellules SaOS-2 réduit la production d'AMPc en réponse à la PTH.Ces résultats démontrent que les niveaux élevés de DKK2, via l’inhibition de la signalisation Wnt/bcaténine, sont aussi responsables de l’altération de la réponse à la PTH observée dans les Ob OA. Le niveau élevé de DKK2 diminue spécifiquement l’affichage membranaire de PTH-R dans ces cellules et non son expression. Ces résultats suggèrent donc une altération du cross-talk entre LRP6 et PTH-R dans les Ob OA en lien avec leur niveau de DKK2.

Le rôle de la signalisation Wnt dans le phénotype anormal des ostéoblastes ostéoarthrosiques

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie de forte incidence affectant les articulations. Elle est caractérisée principalement par une dégradation du cartilage articulaire, un déséquilibre au niveau du remodelage osseux et une sclérose de l’os sous-chondral. L’étiologie de cette pathologie reste encore méconnue, cependant il semble de plus en plus que tous les tissus composant l’articulation soient affectés dans cette pathologie. L’importance du rôle de l’os dans le développement de l’OA est incontestable et représente donc une cible thérapeuthique intéressante. Des études effectuées par tomodensitométrie ont démontré une structure et une organisation anormales du tissu osseux des patients OA. Parallèlement, les cultures primaires d’ostéoblastes (Ob) humains OA issus de l’os sous-chondral démontrent un phénotype altéré et une faible minéralisation in vitro. La signalisation Wnt, essentielle dans l’embryogenèse, a montré avoir un rôle clé dans la régulation de l’ostéogenèse en régulant notamment la différenciation terminale des Ob. Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), un facteur agissant notamment sur la prolifération et sur le début de la différenciation des Ob, est surexprimé par les Ob OA et pourrait moduler cette signalisation. Aussi, deux populations de patients OA peuvent être différenciées in vitro par la production de prostaglandines E2 (PGE2) par leurs Ob et les PGE2, dans une étude sur le cancer colorectal, ont montré moduler la signalisation Wnt. Notre hypothèse de travail est que l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est diminuée dans les Ob OA. Cette diminution est responsable de la sous-minéralisation et de l’altération du phénotype des Ob humains OA. Par ailleurs, DKK2, dont l’expression est contrôlée par TGF-β1, est responsable de la diminution de l’activité Wnt/β-caténine et les PGE2 peuvent en partie corriger cette situation. L’objectif général de cette étude est d’une part, de démontrer le rôle de TGF-β1, DKK2 et de PGE2 sur l’altération de la signalisation Wnt/β-caténine et d’autre part, de démontrer le lien entre TGF-β1 et DKK2 et l’effet de ces derniers sur le phénotype des Ob. Dans cette étude on a montré que la signalisation canonique Wnt est altérée dans les Ob OA et que cela était responsable de l’altération du phénotype des Ob OA. On a montré, parmi les acteurs de la signalisation Wnt, que l’expression de l’antagoniste Dickkopf-1 (DKK1) était relativement similaire entre les Ob OA et normaux contrairement à celle de l’antagoniste DKK2 qui était augmentée et à celle de l’agoniste Wnt7B qui était diminuée dans les Ob OA. On a également montré que les PGE2 pouvaient potentialiser l’activité de la signalisation Wnt dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 a permis d’augmenter l’activité de la signalisation Wnt et de corriger le phénotype anormal ainsi que d’augmenter la minéralisation des Ob OA. L’inhibition de TGF-β1, un facteur aussi surexprimé dans les Ob OA, a également permis la correction du phénotype et l’augmentation de la minéralisation dans les Ob OA. L’inhibition de TGF-β1 a aussi menée à l’inhibition de DKK2. Le contraire ne fût pas observé démontrant ainsi la régulation de DKK2 par TGF-β1. En conclusion, la signalisation canonique Wnt est diminuée dans les Ob OA et cela est dû au niveau élevé de DKK2 dans ces Ob. TGF-β1 régule positivement DKK2 et donc la surexpression de TGF-β1 entraîne celle de DKK2 ce qui a pour conséquences d’altérer le phénotype des Ob. Les PGE2 ont aussi montré pouvoir potentialiser l’activité de la signalisation Wnt et auraient donc un rôle positif. Ensemble, ces données suggèrent que ces altérations au niveau des Ob OA pourraient être responsables de la structure osseuse anormale observée chez les patients OA.