Heterotrophic cultivation of microalgae as a source of docosahexaenoic acid for aquaculture

Programa de doctorado: Acuicultura: Producción controlada de animales acuáticos

Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products

Microalgae biotechnology has recently emerged into the lime light owing to numerous consumer products that can be harnessed from microalgae. Product portfolio stretches from straightforward biomass production for food and animal feed to valuable products extracted from microalgal biomass, including triglycerides which can be converted into biodiesel. For most of these applications, the production process is moderately economically viable and the market is developing. Considering the enormous biodiversity of microalgae and recent developments in genetic and metabolic engineering, this group of organisms represents one of the most promising sources for new products and applications. With the development of detailed culture and screening techniques, microalgal biotechnology can meet the high demands of food, energy and pharmaceutical industries. This review article discusses the technology and production platforms for development and creation of different valuable consumer products from microalgal biomass.

Sustainability and economic evaluation of microalgae grown in brewery wastewater

This article evaluates the sustainability and economic potential of microalgae grown in brewery wastewater for biodiesel and biomass production. Three sustainability and two economic indicators were considered in the evaluation within a life cycle perspective. For the production system the most efficient process units were selected. Results show that harvesting and oil separation are the main process bottlenecks. Microalgae with higher lipid content and productivity are desirable for biodiesel production, although comparable to other biofuel’s feedstock concerning sustainability. However, improvements are still needed to reach the performance level of fossil diesel. Profitability reaches a limit for larger cultivation areas, being higher when extracted biomass is sold together with microalgae oil, in which case the influence of lipid content and areal productivity is smaller. The values of oil and/or biomass prices calculated to ensure that the process is economically sound are still very high compared with other fuel options, especially biodiesel.

Isolation and identification of native microalgae for biodiesel production

La demande croissante en carburants, ainsi que les changements climatiques dus au réchauffement planétaire poussent le monde entier à chercher des sources d’énergie capables de produire des combustibles alternatifs aux combustibles fossiles. Durant les dernières années, plusieurs sources potentielles ont été identifiées, les premières à être considérées sont les plantes oléagineuses comme source de biocarburant, cependant l’utilisation de végétaux ou d’huiles végétales ayant un lien avec l’alimentation humaine peut engendrer une hausse des prix des denrées alimentaires, sans oublier les questions éthiques qui s’imposent. De plus, l'usage des huiles non comestibles comme sources de biocarburants, comme l’huile de jatropha, de graines de tabac ou de jojoba, révèle un problème de manque de terre arable ce qui oblige à réduire les terres cultivables de l'industrie agricole et alimentaire au profit des cultures non comestibles. Dans ce contexte, l'utilisation de microorganismes aquatiques, tels que les microalgues comme substrats pour la production de biocarburant semble être une meilleure solution. Les microalgues sont faciles à cultiver et peuvent croitre avec peu ou pas d'entretien. Elles peuvent ainsi se développer dans des eaux douces, saumâtres ou salées de même que dans les terres non cultivables. Le rendement en lipide peut être largement supérieur aux autres sources de biocarburant potentiel, sans oublier qu’elles ne sont pas comestibles et sans aucun impact sur l'industrie alimentaire. De plus, la culture intensive de microalgues pour la production de biodiesel pourrait également jouer un rôle important dans l'atténuation des émissions de CO2. Dans le cache de ce travail, nous avons isolé et identifié morphologiquement des espèces de microalgues natives du Québec, pour ensuite examiner et mesurer leur potentiel de production de lipides (biodiesel). L’échantillonnage fut réalisé dans trois régions différentes du Québec: la région de Montréal, la gaspésie et le nord du Québec, et dans des eaux douces, saumâtres ou salées. Cent souches ont été isolées à partir de la région de Montréal, caractérisées et sélectionnées selon la teneur en lipides et leur élimination des nutriments dans les eaux usées à des températures différentes (10 ± 2°C et 22 ± 2°C). Les espèces ayant une production potentiellement élevée en lipides ont été sélectionnées. L’utilisation des eaux usées, comme milieu de culture, diminue le coût de production du biocarburant et sert en même temps d'outil pour le traitement des eaux usées. Nous avons comparé la biomasse et le rendement en lipides des souches cultivées dans une eau usée par apport à ceux dans un milieu synthétique, pour finalement identifié un certain nombre d'isolats ayant montré une bonne croissance à 10°C, voir une teneur élevée en lipides (allant de 20% à 45% du poids sec) ou une grande capacité d'élimination de nutriment (>97% d'élimination). De plus, nous avons caractérisé l'une des souches intéressantes ayant montré une production en lipides et une biomasse élevée, soit la microalgue Chlorella sp. PCH90. Isolée au Québec, sa phylogénie moléculaire a été établie et les études sur la production de lipides en fonction de la concentration initiale de nitrate, phosphate et chlorure de sodium ont été réalisées en utilisant de la méthodologie des surfaces de réponse. Dans les conditions appropriées, cette microalgue pourrait produire jusqu'à 36% de lipides et croitre à la fois dans un milieu synthétique et un milieu issu d'un flux secondaire de traitement des eaux usées, et cela à 22°C ou 10°C. Ainsi, on peut conclure que cette souche est prometteuse pour poursuivre le développement en tant que productrice potentielle de biocarburants dans des conditions climatiques locales.

Characterization of microalgae native to Quebec for biofuel production.

La production de biodiésel par des microalgues est intéressante à plusieurs niveaux. Dans le premier chapitre, un éventail de pour et contres concernant l’utilisation de microalgues pour la production de biocarburant sont ici révisés. La culture d’algues peut s'effectuer en utilisant des terres non-arables, de l’eau non-potable et des nutriments de base. De plus, la biomasse produite par les algues est considérablement plus importante que celle de plantes vasculaires. Plusieurs espèces on le contenu lipidique en forme de triacylglycérols (TAGs), qui peut correspondre jusqu'à 30% - 40% du poids sec de la biomasse. Ces proportions sont considérablement plus élevées que celui des huiles contenues dans les graines actuellement utilisées pour le biodiésel de première génération. Par contre, une production pratique et peu couteuse de biocarburant par des microalgues requiert de surpasser plusieurs obstacles. Ceci inclut le développement de systèmes de culture efficace à faible coût, de techniques de récupération requérant peu d’énergie, et de méthodes d’extraction et de conversion de l’huile non-dommageables pour l’environnement et peu couteuses. Le deuxième chapitre explore l'une des questions importantes soulevées dans le premier chapitre: la sélection d'une souche pour la culture. Une collection de souches de microalgues d'eau douce indigène au Québec a été établi et examiné au niveau de la diversité physiologique. Cette collection est composée de cent souches, que apparaissaient très hétérogènes en terme de croissance lorsque mises en culture à 10±2 °C ou 22±2 °C sur un effluent secondaire d’une usine municipale de traitement des eaux usées (EU), défini comme milieu Bold's Basal Medium (BBM). Des diagrammes de dispersion ont été utilisés pour étudier la diversité physiologique au sein de la collection, montrant plusieurs résultats intéressants. Il y avait une dispersion appréciable dans les taux de croissance selon les différents types de milieux et indépendamment de la température. De manière intéressante, en considérant que tous les isolats avaient initialement été enrichis sur milieu BBM, la distribution était plutôt symétrique autour de la ligne d’iso-croissance, suggérant que l’enrichissement sur BBM n’a pas semblé biaiser la croissance des souches sur ce milieu par rapport aux EU. Également, considérant que les isolats avaient d’abord été enrichis à 22°C, il est assez surprenant que la distribution de taux de croissance spécifiques soit aussi symétrique autour de la ligne d’iso-croissance, avec grossièrement des nombres égaux d’isolats de part et d’autre. Ainsi, l’enrichissement à 22°C ne semble pas biaiser les cellules vers une croissance à cette température plutôt que vers 10°C. Les diagrammes de dispersion obtenus lorsque le pourcentage en lipides de cultures sur BBM ont été comparées à des cultures ayant poussé sur EU soit à 10°C ou 22°C rendent évident que la production de lipides est favorisée par la culture sur EU aux deux températures, et que la production lipidique ne semble pas particulièrement plus favorisée par l’une ou l’autre de ces températures. Lorsque la collection a été examinée pour y déceler des différences avec le site d’échantillonnage, une analyse statistique a montré grossièrement que le même degré de diversité physiologique était retrouvé dans les échantillons des deux différents sites. Le troisième chapitre a poursuivi l'évaluation de la culture d'algues au Québec. L’utilisation de déchets industriels riches en nutriments minéraux et en sources de carbone pour augmenter la biomasse finale en microalgues et le produit lipidique à faible coût est une stratégie importante pour rendre viable la technologie des biocarburants par les algues. Par l’utilisation de souches de la collection de microalgues de l’Université de Montréal, ce rapport montre pour la première fois que des souches de microalgues peuvent pousser en présence de xylose, la source de carbone majoritairement retrouvée dans les eaux usées provenant des usines de pâte et papier, avec une hausse du taux de croissance de 2,8 fois par rapport à la croissance photoautotrophe, atteignant jusqu’à µ=1,1/jour. En présence de glycérol, les taux de croissance atteignaient des valeurs aussi élevées que µ=1,52/jour. La production lipidique augmentait jusqu’à 370% en présence de glycérol et 180% avec le xylose pour la souche LB1H10, démontrant que cette souche est appropriée pour le développement ultérieur de biocarburants en culture mixotrophe. L'ajout de xylose en cultures d'algues a montré certains effets inattendus. Le quatrième chapitre de ce travail a porté à comprendre ces effets sur la croissance des microalgues et la production de lipides. Quatre souches sauvages indigènes ont été obersvées quotidiennement, avant et après l’ajout de xylose, par cytométrie en flux. Avec quelques souches de Chlorella, l’ajout de xylose induisait une hausse rapide de l’accumulation de lipide (jusqu’à 3,3 fois) pendant les premières six à douze heures. Aux temps subséquents, les cellules montraient une diminution du contenu en chlorophylle, de leur taille et de leur nombre. Par contre, l’unique membre de la famille des Scenedesmaceae avait la capacité de profiter de la présence de cette source de carbone sous culture mixotrophe ou hétérotrophe sans effet négatif apparent. Ces résultats suggèrent que le xylose puisse être utilisé avant la récolte afin de stimuler l’augmentation du contenu lipidique de la culture d’algues, soit en système de culture continu ou à deux étapes, permettant la biorestauration des eaux usées provenant de l’industrie des pâtes et papiers. Le cinquième chapitre aborde une autre déché industriel important: le dioxyde de carbone et les gaz à effet de serre. Plus de la moitié du dioxyde de carbone qui est émis dans l'atmosphère chaque jour est dégagé par un processus stationnaire, soit pour la production d’électricité ou pour la fabrication industrielle. La libération de CO2 par ces sources pourrait être atténuée grâce à la biorestauration avec microalgues, une matière première putative pour les biocarburants. Néanmoins, toutes les cheminées dégagent un gaz différent, et la sélection des souches d'algues est vitale. Ainsi, ce travail propose l'utilisation d’un état de site particulier pour la bioprospection de souches d'algues pour être utilisé dans le processus de biorestauration. Les résultats montrent que l'utilisation d'un processus d'enrichissement simple lors de l'étape d'isolement peut sélectionner des souches qui étaient en moyenne 43,2% mieux performantes dans la production de biomasse que les souches isolées par des méthodes traditionnelles. Les souches isolées dans ce travail étaient capables d'assimiler le dioxyde de carbone à un taux supérieur à la moyenne, comparées à des résultats récents de la littérature.

Life-cycle assessment of microalgae biodiesel: a review

Microalgae are an attractive way to produce biofuels due to the ability to accumulate lipids and very high photosynthetic yields. This article presents a review of life-cycle assessment studies of microalgae biodiesel production, including an analysis of modeling choices and assumptions. A high variation in GHG emissions (between -0.75 and 2.9 kg CO2eq MJ-1) was found and the main causes were investigated, namely modeling choices (e.g. the approach used to deal with multifunctionality), and a high parameter uncertainty in microalgae cultivation, harvesting and oil extraction processes.

In vitro cultivation of adult human chondrocytes : importance of culture system, oxygen and zonal differences

Articular cartilage exhibits limited intrinsic regenerative capacity and focal tissue defects can lead to the development of osteoarthritis (OA), a painful and debilitating loss of cartilage tissue. In Australia, 1.4 million people are affected by OA and its prevalence is increasing in line with current demographics. As treatment options are limited, new therapeutic approaches are being investigated including biological resurfacing of joints with tissue-engineered cartilage. Despite some progress in the field, major challenges remain to be addressed for large scale clinical success. For example, large numbers of chondrogenic cells are required for cartilage formation, but chondrocytes lose their chondrogenic phenotype (dedifferentiate) during in vitro propagation. Additionally, the zonal organization of articular cartilage is critical for normal cartilage function, but development of zonal structure has been largely neglected in cartilage repair strategies. Therefore, we hypothesised that culture conditions for freshly isolated human articular chondrocytes from non-OA and OA sources can be improved by employing microcarrier cultures and a reduced oxygen environment and that oxygen is a critical factor in the maintenance of the zonal chondrocyte phenotype. Microcarriers have successfully been used to cultivate bovine chondrocytes, and offer a potential alternative for clinical expansion of human chondrocytes. We hypothesised that improved yields can be achieved by propagating human chondrocytes on microcarriers. We found that cells on microcarriers acquired a flattened, polygonal morphology and initially proliferated faster than monolayercultivated cells. However, microcarrier cultivation over four weeks did not improve growth rates or the chondrogenic potential of non-OA and OA human articular chondrocytes over conventional monolayer cultivation. Based on these observations, we aimed to optimise culture conditions by modifying oxygen tension, to more closely reflect the in vivo environment. We found that propagation at 5% oxygen tension (moderate hypoxia) did not improve proliferation or redifferentiation capacity of human osteoarthritic chondrocytes. Moderate hypoxia increased the expression of chondrogenic markers during redifferentiation. However, osteoarthritic chondrocytes cultivated on microcarriers exhibited lower expression levels of chondrogenic surface marker proteins and had at best equivalent redifferentiation capacities compared to monolayer-cultured cells. This suggests that monolayer culture with multiple passaging potentially selects for a subpopulation of cells with higher differentiation capacity, which are otherwise rare in osteoarthritic, aged cartilage. However, fibroblastic proteins were found to be highly expressed in all cultures of human osteoarthritic chondrocytes indicating the presence of a high proportion of dedifferentiated, senescent cells with a chondrocytic phenotype that was not rescued by moderate hypoxia. The different zones of cartilage support chondrocyte subpopulations, which exhibit characteristic protein expression and experience varying oxygen tensions. We, therefore, hypothesised that oxygen tension affects the zonal marker expression of human articular chondrocytes isolated from the different cartilage layers. We found that zonal chondrocytes maintained these phenotypic differences during in vitro cultivation. Low oxygen environments favoured the expression of the zonal marker proteoglycan 4 in superficial cells, most likely through the promotion of chondrogenesis. The putative zonal markers clusterin and cartilage intermediate layer protein were found to be expressed by all subpopulations of human osteoarthritic chondrocytes ex vivo and, thus, may not be reliable predictors of in vitro stratification using these clinically relevant cells. The findings in this thesis underline the importance of considering low oxygen conditions and zonal stratification when creating native-like cartilaginous constructs. We have not yet found the right cues to successfully cultivate clinically-relevant human osteoarthritic chondrocytes in vitro. A more thorough understanding of chondrocyte biology and the processes of chondrogenesis are required to ensure the clinical success of cartilage tissue engineering.

The cultivation of human retinal pigment epithelial cells on Bombyx mori silk fibroin

We have presently evaluated membranes prepared from Bombyx mori silk fibroin (BMSF), for their potential use as a prosthetic Bruch’s membrane and carrier substrate for human retinal pigment epithelial (RPE) cell transplantation. Porous BMSF membranes measuring 3 μm in thickness were prepared from aqueous solutions (3% w/v) containing poly(ethylene oxide) (0.09%). The permeability coefficient for membranes was between 3 and 9 × 10-5 cm/s by using Allura red or 70 kDa FITC-dextran respectively. Average pore size (± sd) was 4.9 ± 2.3 µm and 2.9 ± 1.5 µm for upper and lower membrane surfaces respectively. Optimal attachment of ARPE-19 cells to BMSF membrane was achieved by pre-coating with vitronectin (1 µg/mL). ARPE-19 cultures maintained in low serum on BMSF membranes for approximately 8 weeks, developed a cobble-stoned morphology accompanied by a cortical distribution of F-actin and ZO-1. Similar results were obtained using primary cultures of human RPE cells, but cultures took noticeably longer to establish on BMSF compared with tissue culture plastic. These findings encourage further studies of BMSF as a substrate for RPE cell transplantation.

Fibroin-based materials support cultivation of limbal stromal cells

Purpose: The silk protein fibroin provides a potential substrate for use in ocular tissue reconstruction. We have previously demonstrated that transparent membranes produced from fibroin support cultivation of human limbal epithelial cells (Tissue Eng A. 14(2008)1203-11). We presently extend this body of work to studies of human limbal stromal cell (HLS) growth on fibroin in the presence and absence of serum. Methods: Primary cultures of HLS cells were established in DMEM/F12 medium supplemented with either 10% fetal bovine serum (FBS) or 2% B27 supplement. Defined keratinocyte serum-free medium (DK-SFM, Invitrogen) was also tested. The resulting cultures were analysed by flow cytometry for expression of CD34, CD90, CD45, and CD141. Cultures grown under each condition were subsequently passaged either onto transparent fibroin membranes prepared from purified fibroin or within 3D scaffolds prepared from partially-solubilised fibroin. Results: HLS cultures were successfully established under each condition, but grew more slowly and passaged poorly in the absence of serum. Cultures grown in 10% FBS were <0.5% CD34+ (keratocytes) and >97% CD90+ (fibroblasts). Cultures established in 2% B27 formed floating spheres and contained >8% CD34+ cells and reduced CD90 expression. Cultures established in DK-SFM displayed traces of epithelial cell growth (CD141), but mostly consisted of CD90+ cells with <1% CD34+ cells. Cells of bone marrow lineage (CD45) were rarely observed under any conditions. Cultures grown in 10% FBS were able to adhere to and proliferate on silk fibroin 3-D scaffolds and transparent films while those grown serum-free could not. Adhesion of HLS cells to fibroin was initially poorer than that displayed on tissue culture plastic. Conclusions: HLS cultures containing cells of predominantly fibroblast lineage can be grown on fibroin-based materials, but this process is dependent upon additional ECM factors such as those provided by serum.

Methods for isolation and cultivation of filamentous fungi

Filamentous fungi are important organisms for basic discovery, industry, and human health. Their natural growth environments are extremely variable, a fact reflected by the numerous methods developed for their isolation and cultivation. Fungal culture in the laboratory is usually carried out on agar plates, shake flasks, and bench top fermenters starting with an inoculum that typically features fungal spores. Here we discuss the most popular methods for the isolation and cultivation of filamentous fungi for various purposes with the emphasis on enzyme production and molecular microbiology.

Combustion analysis of microalgae methyl ester in a common rail direct injection diesel engine

In this study, the biodiesel properties and effects of blends of oil methyl ester petroleum diesel on a CI direct injection diesel engine is investigated. Blends were obtained from the marine dinoflagellate Crypthecodinium cohnii and waste cooking oil. The experiment was conducted using a four-cylinder, turbo-charged common rail direct injection diesel engine at four loads (25%, 50%, 75% and 100%). Three blends (10%, 20% and 50%) of microalgae oil methyl ester and a 20% blend of waste cooking oil methyl ester were compared to petroleum diesel. To establish suitability of the fuels for a CI engine, the effects of the three microalgae fuel blends at different engine loads were assessed by measuring engine performance, i.e. mean effective pressure (IMEP), brake mean effective pressure (BMEP), in cylinder pressure, maximum pressure rise rate, brake-specific fuel consumption (BSFC), brake thermal efficiency (BTE), heat release rate and gaseous emissions (NO, NOx,and unburned hydrocarbons (UHC)). Results were then compared to engine performance characteristics for operation with a 20% waste cooking oil/petroleum diesel blend and petroleum diesel. In addition, physical and chemical properties of the fuels were measured. Use of microalgae methyl ester reduced the instantaneous cylinder pressure and engine output torque, when compared to that of petroleum diesel, by a maximum of 4.5% at 50% blend at full throttle. The lower calorific value of the microalgae oil methyl ester blends increased the BSFC, which ultimately reduced the BTE by up to 4% at higher loads. Minor reductions of IMEP and BMEP were recorded for both the microalgae and the waste cooking oil methyl ester blends at low loads, with a maximum of 7% reduction at 75% load compared to petroleum diesel. Furthermore, compared to petroleum diesel, gaseous emissions of NO and NOx, increased for operations with biodiesel blends. At full load, NO and NOx emissions increased by 22% when 50% microalgae blends were used. Petroleum diesel and a 20% blend of waste cooking oil methyl ester had emissions of UHC that were similar, but those of microalgae oil methyl ester/petroleum diesel blends were reduced by at least 50% for all blends and engine conditions. The tested microalgae methyl esters contain some long-chain, polyunsaturated fatty acid methyl esters (FAMEs) (C22:5 and C22:6) not commonly found in terrestrial-crop-derived biodiesels yet all fuel properties were satisfied or were very close to the ASTM 6751-12 and EN14214 standards. Therefore, Crypthecodinium cohnii- derived microalgae biodiesel/petroleum blends of up to 50% are projected to meet all fuel property standards and, engine performance and emission results from this study clearly show its suitability for regular use in diesel engines.

Fibroin-based materials support co-cultivation of limbal epithelial and stromal cells

The silk protein fibroin (Bombyx mori) provides a potential substrate for use in ocular tissue reconstruction. We have previously demonstrated that transparent membranes produced from fibroin support cultivation of human limbal epithelial (HLE) cells (Tissue Eng A. 14(2008)1203-11). We extend this body of work to studies of human limbal stromal cell (HLS) growth on fibroin in the presence and absence of serum. Also, we investigate the ability to produce a bi-layered composite scaffold of fibroin with an upper HLE layer and lower HLS layer.

In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.

A novel method for screening bacterial isolates for their potential to inhibit the growth of ruminal methanogenic Archaea was developed using a modification of the soft agar overlay technique, formally used for the isolation of lytic bacteriophages. This method may be used in the specific, hydrogen-rich conditions required for the growth of ruminal methanogenic Archaea.

Profiling of carotenoids and antioxidant capacity of microalgae from subtropical coastal and brackish waters

Carotenoids are associated with various health benefits, such as prevention of age-related macular degeneration, cataract, certain cancers, rheumatoid arthritis, muscular dystrophy and cardiovascular problems. As microalgae contain considerable amounts of carotenoids, there is a need to find species with high carotenoid content. Out of hundreds of Australian isolates, twelve microalgal species were screened for carotenoid profiles, carotenoid productivity, and in vitro antioxidant capacity (total phenolic content (TPC) and ORAC). The top four carotenoid producers at 4.68-6.88 mg/g dry weight (DW) were Dunaliella salina, Tetraselmis suecica, Isochrysis galbana, and Pavlova salina. TPC was low, with D. salina possessing the highest TPC (1.54 mg Gallic Acid Equivalents/g DW) and ORAC (577 μmol Trolox Equivalents/g DW). Results indicate that T. suecica, D. salina, P. salina and I. galbana could be further developed for commercial carotenoid production.