125 resultados para Couplage
Resumo:
Cette thse comprend deux parties distinctes, dans lesquelles seront dcrits tout dabord, le dveloppement dun procd multicatalytique en un seul pot dune raction de mthylnation suivie dun couplage de Heck, puis dans un second temps, une tude vers la synthse de lHodgsonox. Le premier thme de la thse correspond la mise en place dun procd en un seul pot, bas sur la mthodologie de mthylnation catalyse par un mtal de transition, dveloppe au sein du groupe du Pr. Lebel, et sur des couplages de Heck. Diffrentes tudes de compatibilit des ractifs mis en prsence sont abordes, ainsi que le choix des conditions optimales (Pd(OAc)2 et P(o-tol)3) pour la ralisation dun tel systme qui ne requiert aucun isolement du produit intermdiaire. Il a t dmontr que la prsence de triphnylphosphine en excs inhibe la raction de couplage de Heck, ce qui a finalement orient notre choix vers les sels de cuivre pour la catalyse de la raction de mthylnation. Le tandem squentiel a ensuite t appliqu la synthse de divers stilbnes, notamment des composs drivs du Resvratrol, molcule dintrt thrapeutique pour les maladies cardiovasculaires, et la synthse dindanes substitus, avec un couplage intramolculaire, avec de bons rendements. La deuxime partie de cette thse traite de ltude mene vers la synthse de lHodgsonox. Cette molcule correspond une nouvelle classe de sesquiterpnes tricycliques, comportant un dihydropyrane dot dune fonction ther diallylique. Cette molcule reprsente un dfi synthtique pour le groupe du Pr. Lebel, qui envisage de synthtiser les deux doubles liaisons terminales au moyen de la mthodologie de mthylnation dveloppe au sein du groupe. LHodgsonox, dont la biosynthse utilise la voie MEP, a un potentiel insecticide pour la croissance de la larve de la mouche verte dAustralie, Lucilia cuprina. La synthse envisage au cours de ces travaux est base sur la formation pralable dun cycle 5 chanons, comportant 3 centres strogniques, puis sur la cyclisation du cycle pyranique au moyen dune raction dinsertion dans un lien O H. Un ddoublement cintique dynamique sur une butyrolactone substitue permet de fixer la strochimie relative de deux centres chiraux ds la premire tape. Le cycle 5 chanons est ensuite form par mtathse aprs 6 tapes avec un rendement de 37%. Une addition conjugue suivie dune raction de Saegusa et dune raction dhydrosilylation introduit le groupement isopropyle de manire syn. Aprs mise en place dun groupement cto-ester, un transfert de groupement diazonium permet de prparer le prcurseur pour la raction dinsertion dans un lien O-H. Le bicycle correspondant la structure de base de lHodgsonox a t prpar au moyen de 16 tapes linaires avec un rendement global de 12%.
Resumo:
Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqu dans le dveloppement du cerveau, la plasticit synaptique et la pathognse de maladies telles que lpilepsie, les troubles de lanxit et la douleur chronique. Le modle actuel de fonctionnement du rcepteur GABA-B implique lhtrodimrisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des rgions du cerveau, des types cellulaires et des priodes du dveloppement crbral o la sous-unit GABA-B1 est exprime en plus grande quantit que GABA-B2, ce qui suggre quelle puisse tre fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, la surface cellulaire ou sur la membrane rticulaire. Dans le cadre de cette thse, nous montrons la capacit des rcepteurs GABA-B1 endognes activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la ligne drive de la glie DI-TNC1, qui nexprime pas GABA-B2. Les mcanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal dfinis mais dpendent de Gi/o et PKC. Limmunohistochimie de rcepteurs endognes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigs contre la partie N-terminale reconnaissent des protines localises au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protine intranuclaire. Ces donnes suggrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait tre relch par protolyse. Lintensit des fragments potentiels est affecte par le traitement agoniste tant en immunohistochimie quen immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examin la rgulation du clivage par le protasome en traitant les cellules avec linhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a rsult en laugmentation du marquage intranuclaire de GABA-B1-CT et dun interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, linduction et la translocation nuclaire dATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a compltement t abolie. Cette observation est associe une forte diminution du dcompte cellulaire. tant donn que les trois derniers rsidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protines domaines PDZ sont impliques dans la rgulation du ciblage nuclaire et de la stabilit de protines, en complment de leur rle dchaffaud la surface cellulaire, nous avons mut les trois derniers rsidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a compltement annul les effets de GABA-B1-CT sur linduction dATF-4 et le dcompte cellulaire. Cette deuxime srie dexpriences suggre lexistence possible de fragments GABA-B1 intranuclaires rguls par le traitement agoniste et le protasome dans les cellules DI-TNC1. Cette rgulation dATF-4 dpend des rsidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilit de GABA-B1-CT et favorisent peut-tre la formation dun complexe multiprotique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de mme quune protine dchaffaudage inconnue. En somme, nous dmontrons que les sous-units GABA-B1 localises au RE, lorsque non-htrodimrises avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifration, la diffrentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protines G et possiblement la protolyse rgule. Les mcanismes de signalisation proposs pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la comprhension des actions retardes rsultant de lactivation des rcepteurs 7-TMs.
Resumo:
Lintrt pour les hlicnes sest accru au fur et mesure que de nouvelles applications pour ce genre de molcules ont t dcouvertes. Par contre, la recherche dans ce domaine a t limite par le petit nombre de voies de synthse de ces molcules, la plupart ncessitant une tape de rsolution ou de sparation des nantiomres par HPLC la fin de la synthse. Le prsent projet de recherche propose dutiliser la raction de fermeture de cycle asymtrique par mtathse dolfines (asymmetric ring closing metathesis, ARCM) pour effectuer une synthse dhlicne la fois catalytique et nantioslective. La synthse nantioslective du [7]hlicne a t effectue laide dune rsolution cintique du prcurseur racmique. Au cours de cette synthse, nous avons t en mesure de dmontrer lefficacit de diffrents catalyseurs de mtathse chiraux en plus de dmontrer leffet de lajout de simples olfines comme additifs la raction. De plus, nous avons formul une hypothse expliquant cet effet laide du mcanisme de la raction. Finalement, nous avons aussi montr leffet du changement de solvant sur la slectivit de la raction. Au cours de ces travaux, nous avons galement dvelopp une nouvelle mthode de synthse de binaphtols laide dune raction de couplage oxydatif impliquant un catalyseur de cuivre. laide dtudes de ractivit, nous avons t en mesure de dmontrer que le mtal portait deux ligands N-htrocycliques (NHC). Nous avons aussi observ que le catalyseur favorisait la formation de binaphtol non symtrique avec un groupement naphtol avec une densit lectronique leve et un autre groupement naphtol avec une faible densit lectronique.
Resumo:
Les canaux calciques dpendants du voltage CaV font partie de la famille structurale des canaux ioniques 6 segments transmembranaires. Tout comme les canaux potassiques Kv, les canaux CaV possdent une srie de rsidus chargs dans lhlice S4 de chaque domaine ou sous-unit qui confrerait la protine une sensibilit aux changements de voltage. De plus les hlices S6 tapissent la paroi du pore et forment la porte dactivation de la protine. Comment le mouvement des hlices S4 se traduit par louverture de la porte dactivation des hlices S6 demeure une question encore non rsolue. Suite la publication de la structure cristalline du canal Kv1.2 en 2005, le groupe de MacKinnon a propos que le mouvement des hlices S4 est mcaniquement coupl la porte dactivation S6 travers le glissement de lhlice amphiphile S4-S5 selon un mcanisme nomm couplage lectromcanique (Long et al. 2005b). Dans le but de dterminer si la rgion S4-S5 joue un rle dans lactivation du canal calcique CaV2.3, nous avons tudi, par la mthode danalyse cyclique de mutations doubles ( Double Mutant Cycle Analysis , (Horovitz 1996)), le couplage entre la boucle S4-S5 et lhlice S6 du domaine II de ce canal. Les mesures dnergies dactivation, Gact, obtenues en prsence des sous-units auxiliaires CaV2 et CaV3 ont affich un couplage significatif pour lactivation entre les paires de rsidus V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, et S602G/I701G. Aucune de ces paires de rsidus na affich de couplage lors de linactivation, suggrant que les effets observs sont spcifiques au mcanisme dactivation. Mis ensemble, ces rsultats suggrent que la boucle IIS4-S5 et lhlice IIS6 interagissent et jouent un rle dterminant dans lactivation de CaV2.3.
Resumo:
Ralis en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort.
Resumo:
Les canaux potassiques dpendants du voltage sont forms de quatre sous-units, chacune possdant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquime et le sixime segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est ncessaire de transfrer l'nergie du senseur du voltage (gnr par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mcanisme exact de ce couplage lectromcanique est encore sous tude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette tude est de dterminer l'influence de la flexibilit du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribues dans des positions diffrentes. Elles sont responsables de la flexibilit des hlices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conserves pour tous les canaux potassiques dpendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagnes dirig, la glycine a t remplace dans chacune de ces diffrentes positions par une alanine et dans une deuxime tape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hlice). Pour tudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqu la technique de patch clamp pour dterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le cut-open oocyte voltage-clamp , nous avons tudi les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant gating) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les donnes ont montr quen rduisant la flexibilit dans le S45L, il faut avoir plus d'nergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggre que le mouvement du senseur est indpendant du pore pendant l'ouverture du canal.
Resumo:
Les canaux potassiques voltage-dpendants forment des ttramres dont chaque sous-unit comporte six segments transmembranaires (S1 S6). Le pore, form des segments S5-S6 de chaque sous-unit, est entour de quatre domaines responsables de la sensibilit au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors dune dpolarisation membranaire, le mouvement des rsidus chargs situs dans le VS entraine un mouvement de charges dtectable en lectrophysiologie, le courant de gating . Lactivation du VS conduit l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour lucider les principes qui sous-tendent le couplage lectromcanique entre ces deux domaines, nous avons tudi deux rgions prsumes responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la rgion carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du cut-open voltage clamp fluorometry (COVCF), nous avons pu dterminer que linteraction inter-sous-unitaire RELY, forme par des acides amins situs sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-units voisines, est implique dans le dveloppement de la composante lente observe lors du retour des charges de gating vers leur tat de repos, le OFF-gating . Nous avons observ que lintroduction de mutations dans la rgion RELY module la force de ces interactions molculaires et limine lasymtrie observe dans les courants de gating de type sauvage. Dailleurs, nous dmontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans ltat ouvert. Nous avons galement identifi une interaction intra-sous-unitaire entre les rsidus I384 situ sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 dune mme sous-unit. La dstabilisation de cette interaction hydrophobique dcouple compltement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, lnergie ncessaire pour activer les VS est moindre en raison de labsence du poids mcanique appliqu par le pore. De plus, labolition du couplage lectromcanique limine galement le mode shift , soit le dplacement de la dpendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mcanique du pore impos au VS entraine le mode shift , en modulant la conformation intrinsque du VS par un processus allostrique.
Resumo:
Le mouvement masticatoire est gnr et coordonn par un gnrateur de patron central (GPC) situ au niveau du pont. Plusieurs rsultats antrieurs de notre laboratoire soutiennent que le rseau de neurones lorigine de la rythmognse est situ dans le noyau sensoriel principal du nerf trijumeau (NVsnpr). Ces mmes expriences rvlent que des diminutions de la concentration calcique extracellulaire ([Ca2+]e) tiennent une place importante dans la gnration des bouffes de dcharges des neurones de cette rgion. Notre laboratoire tente de vrifier si la contribution des astrocytes lhomostasie de la concentration calcique extracellulaire est implique dans la gense du rythme. Cette tude a pour but la caractrisation spatiale du syncytium astrocytaire au sein du NVsnpr dorsal et ltude de leffet de la [Ca2+]e sur les proprits astrocytaires lectrophysiologiques et de connectivit. Nous avons utiliss pour ce faire la technique denregistrement par patch-clamp sur une prparation en tranche de tronc crbral de rat. Nous dmontrons ici que la diminution de la [Ca2+]e naffecte pas les proprits lectrophysiologiques astrocytaires, mais induit une augmentation de la taille du syncytium. De plus, nous tablissons lexistence au sein du NVsnpr dorsal dune organisation anatomofonctionnelle du rseau astrocytaire calque sur lorganisation neuronale.
Resumo:
Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
Resumo:
Les estrognes sont impliqus dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le dveloppement, la croissance, la diffrenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrognes sont transmis via l'interaction avec les rcepteurs des estrognes ER et ER. Lactivation de ER et ER contrle directement la transcription des gnes cibles ncessaires pour mdier les effets physiologiques des estrognes. Leffet des estrognes peut aussi tre mitognique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui prsentent une sensibilit accrue lhormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et lutrus. De ce fait, une surexposition de ces tissus lestrogne augmente le risque de dvelopper le cancer. Dans une ligne cellulaire qui coexprime les deux rcepteurs, nous avons identifi la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le rcepteur CXCR4 et qui dcrit une boucle de rgulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrognes. Cette rgulation induit une augmentation de lexpression des gnes cibles prolifratifs du cancer du sein. Cependant, les mcanismes exacts de cette rgulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette rgulation au niveau gnomique, nous avons dvelopp un modle cellulaire pour discriminer le rle respectif de ER et ER au niveau du contrle transcriptionnel de cette boucle de rgulation des chimiokines. En partant dune ligne cellulaire ER-, nous avons gnr un systme cellulaire qui exprime lun ou lautre des isoformes en plus du mutant ER-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc quon a test dans les lignes cellulaires gnres. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons dmontr une voie de rgulation des rcepteurs des chimiokines par les rcepteurs des estrognes. Lactivation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique lactivation directe du rcepteur de lestrogne ER par phosphorylation de la srine 87. Cette phosphorylation active ER et favorise lexpression du gne de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ER au niveau dun lment de liaison ERE que nous avons identifi dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifi une cible exacte de la rgulation des rcepteurs des chimiokines CXCR4 par le rcepteur des estrognes ER qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associes au cancer du sein et ses mtastases.
Resumo:
Le canal calcique dpendant du voltage de type-T CaV3.2 joue un rle important dans lexcitabilit neuronale et dans la perception de la douleur. Le canal CaV3.2 partage une grande homologie structurale et fonctionnelle avec les canaux NaV. Ces deux types de canaux sont activs par de faibles dpolarisations membranaires et possdent des cintiques de temps dactivation et dinactivation plus rapides que les canaux CaV de type-L. Les structures cristallines haute rsolution des canaux bactriens NaVAb (Payandeh et al. 2011; Payandeh et al. 2012) et NaVRh (Zhang et al. 2012) suggrent que lhlice amphiphile S4S5 du domaine II peut tre couple avec les rsidus de lhlice S6 dans le domaine II ainsi quavec des rsidus de lhlice homologue dans le domaine adjacent, soit le domaine III, et ce, durant lactivation du canal. Pour dterminer les rsidus fonctionnellement coupls, durant lactivation du canal CaV3.2, une analyse cyclique de doubles mutants a t effectue par substitution en glycine et alanine des rsidus cls entre lhlice S4S5 du domaine II et le segment S6 des domaines II et III. Les proprits biophysiques ont t mesures laide de la technique de cut-open sur les ovocytes. Les nergies dactivation ont t mesures pour 47 mutations ponctuelles et pour 14 paires de mutants. De grandes nergies de couplage (Ginteract > 2 kcal mol-1) ont t observes pour 3 paires de mutants introduites dans les IIS4S5/IIS6 et IIS4S5/IIIS6. Aucun couplage significatif na t observ entre le IIS4S5 et le IVS6. Nos rsultats semblent dmontrer que les hlices S4S5 et S6 provenant de deux domaines voisins sont couples durant lactivation du canal calcique de type-T CaV3.2.
Resumo:
La prsente thse porte sur les limites de la thorie de la fonctionnelle de la densit et les moyens de surmonter celles-ci. Ces limites sont explores dans le contexte d'une implmentation traditionnelle utilisant une base d'ondes planes. Dans un premier temps, les limites dans la taille des systmes pouvant tre simuls sont observes. Des mthodes de pointe pour surmonter ces dernires sont ensuite utilises pour simuler des systmes de taille nanomtrique. En particulier, le greffage de molcules de bromophnyle sur les nanotubes de carbone est tudi avec ces mthodes, tant donn l'impact substantiel que pourrait avoir une meilleure comprhension de ce procd sur l'industrie de l'lectronique. Dans un deuxime temps, les limites de prcision de la thorie de la fonctionnelle de la densit sont explores. Tout d'abord, une tude quantitative de l'incertitude de cette mthode pour le couplage lectron-phonon est effectue et rvle que celle-ci est substantiellement plus leve que celle prsume dans la littrature. L'incertitude sur le couplage lectron-phonon est ensuite explore dans le cadre de la mthode G0W0 et cette dernire se rvle tre une alternative substantiellement plus prcise. Cette mthode prsentant toutefois de svres limitations dans la taille des systmes traitables, diffrents moyens thoriques pour surmonter ces dernires sont dvelopps et prsents dans cette thse. La performance et la prcision accrues de l'implmentation rsultante laissent prsager de nouvelles possibilits dans l'tude et la conception de certaines catgories de matriaux, dont les supraconducteurs, les polymres utiles en photovoltaque organique, les semi-conducteurs, etc.
Resumo:
Le couplage neurovasculaire (CNV) est un mecanisme dhomeostasie cerebrale regulant le debit sanguin cerebral (CBF) en fonction de lactivite neuronale. La maniere dont il est altere par langiotensine II (Ang II), une hormone synthetisee et relachee dans la circulation systemique ou, alternativement, produite dans le cerveau grace aux astrocytes, demeure a elucider. Ces cellules expriment le recepteur AT1 (rAT1) et participent a lorchestration du CNV en relachant des agents vasoactifs suivant la reponse calcique astrocytaire. Nous avons donc etudie le role de cette reponse dans lalteration du CNV induite par lAng II. Nous avons trouve par fluxmetrie par laser Doppler que lAng II attenue (p<0.05) la reponse du CBF engendree par lactivation des recepteurs metabotropes du glutamate du groupe I (mGluRI) du cortex chez la souris C57BL/6. De maniere similaire, lAng II diminue l'elevation du CBF induite par la stimulation des vibrisses (p<0.05). Sur tranches de cerveaux en aigue, la polarite de la reponse vasculaire induite par un agoniste mGluRI dans les arterioles parenchymateuses a ete significativement renversee par lAng II de la vasodilatation vers la vasoconstriction. En parallele, lAng II a augmente les niveaux de calcium astrocytaire basaux et lamplitude des reponses calciques (p<0.05). Lalteration des reponses vasculaires et calciques maximales a ete prevenue par le candesartan, antagoniste des rAT1. Nos resultats suggerent que lAng II potentialise via les rAT1 la reponse calcique qui atteint un seuil favorisant la vasoconstriction par rapport a la vasodilatation, alterant ainsi laugmentation du CBF en reponse a lactivite neuronale.
Resumo:
RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est compos de diffrents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont trs longtemps rests dans l'ombre alors que les neurones, bnficiant des outils ad hoc pour tre stimuls et tudis, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le dveloppement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non lectriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'tre passives et participent activement au fonctionnement crbral. Cette participation au fonctionnement crbral se fait en partie par le biais de la libration de substances neuro-actives (appelles gliotransmetteurs) que les astrocytes librent proximit des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libration de gliotransmetteurs est principalement cause par l'activit neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Nanmoins, nous savons encore peu de chose sur les proprits prcises de la libration des gliotransmetteurs. Comprendre les proprits spatio-temporelles de cette libration est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information crbrale. En utilisant des outils fluorescents rcemment dvelopps et en combinant diffrentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations trs prcises sur la libration de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirm que cette libration tait un processus trs rapide et qu'elle tait contrle par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons galement dcrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libration des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble tre la base de la libration extrmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidit de libration et cette complexit structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulirement adaptes une communication rapide et qu'elles peuvent, au mme titre que les neurones dont elles seraient les partenaires lgitimes, participer la transmission et l'intgration de l'information crbrale.RESUMEDe petites vsicules, les SLMVs ou Synaptic Like MicroVesicles , exprimant des transporteurs vsiculaires du glutamate (VGluTs) et librant du glutamate par exocytose rgule, ont rcemment t dcrites dans les astrocytes en culture et in situ. Nanmoins, nous savons peu de chose sur les proprits prcises de la scrtion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulusscrtion des astrocytes n'est pas bas sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais ncessite l'intervention de seconds messagers et la libration du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les proprits spatio-temporelles de la scrtion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information crbrale. Nous avons utilis des outils fluorescents rcemment dvelopps pour tudier le recyclage des vsicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la scrtion des SLMVs l'chelle de la cellule mais galement l'chelle des vnements. L'utilisation combine de l'pifluorescence et de la fluorescence onde vanescente nous a permis d'obtenir une rsolution temporelle et spatiale sans prcdent. Ainsi avons-nous confirm que la scrtion rgule des astrocytes tait un processus trs rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons dcouvert que cette scrtion est contrle par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons galement dcrit des compartiments cytosoliques dlimits par le RE proximit de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble tre la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la scrtion. L'existence de compartiments subcellulaires indpendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manire efficace la nonexcitabilit lectrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des diffrents pools de vsicules recruts squentiellement et fusionnant selon des modalits distinctes ainsi que l'existence de mcanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggrent que les astrocytes peuvent faire face une stimulation soutenue de leur scrtion. Ces donnes suggrent que la libration de gliotransmetteurs par exocytose rgule n'est pas seulement une proprit des astrocytes en culture mais bien le rsultat d'une forte spcialisation de ces cellules pour la scrtion. La rapidit de cette scrtion donne aux astrocytes toutes les comptences pour pouvoir intervenir de manire active dans la transmission et l'intgration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.
Resumo:
Quand on parle de l'acide lactique (aussi connu sous le nom de lactate) une des premires choses qui vient l'esprit, c'est son implication en cas d'intense activit musculaire. Sa production pendant une activit physique prolonge est associe avec la sensation de fatigue. Il n'est donc pas tonnant que cette molcule ait t longtemps considre comme un rsidu du mtabolisme, possiblement toxique et donc liminer. En fait, il a t dcouvert que le lactate joue un rle prpondrant dans le mtabolisme grce son fort potentiel nergtique. Le cerveau, en particulier les neurones qui le composent, est un organe trs gourmand en nergie. Rcemment, il a t dmontr que les astrocytes, cellules du cerveau faisant partie de la famille des cellules gliales, utilisent le glucose pour produire du lactate comme source d'nergie et le distribue aux neurones de manire adapte leur activit. Cette dcouverte a renouvel l'intrt scientifique pour le lactate. Aujourd'hui, plusieurs tudes ont dmontr l'implication du lactate dans d'autres fonctions de la physiologie crbrale. Dans le cadre de notre tude, nous nous sommes intresss au rapport entre neurones et astrocytes avec une attention particulire pour le rle du lactate. Nous avons dcouvert que le lactate possde la capacit de modifier la communication entre les neurones. Nous avons aussi dcrypt le mcanisme grce auquel le lactate agit, qui est bas sur un rcepteur prsent la surface des neurones. Cette tude montre une fonction jusque-l insouponne du lactate qui a un fort impact sur la comprhension de la relation entre neurones et astrocytes. - Relatively to its volume, the brain uses a large amount of glucose as energy source. Furthermore, a tight link exists between the level of synaptic activity and the consumption of energy equivalents. Astrocytes have been shown to play a central role in the regulation of this so-called neurometabolic coupling. They are thought to deliver the metabolic substrate lactate to neurons in register to glutamatergic activity. The astrocytic uptake of glutamate, released in the synaptic cleft, is the trigger signal that activates an intracellular cascade of events that leads to the production and release of lactate from astrocytes. The main goal of this thesis work was to obtain detailed information on the metabolic and functional interplay between neurons and astrocytes, in particular on the influence of lactate besides its metabolic effects. To gain access to both spatial and temporal aspects of these dynamic interactions, we used optical microscopy associated with specific fluorescent indicators, as well as electrophysiology. In the first part of this thesis, we show that lactate decreases spontaneous neuronal, activity in a concentration-dependent manner and independently of its metabolism. We further identified a receptor-mediated pathway underlying this modulatory action of lactate. This finding constituted a novel mechanism for the modulation of neuronal transmission by lactate. In the second part, we have undergone a characterization of a new pharmacological tool, a high affinity glutamate transporter inhibitor. The finality of this study was to investigate the detailed pharmacological properties of the compound to optimize its use as a suppressor of glutamate signal from neuron to astrocytes. In conclusion, both studies have implications not only for the understanding of the metabolic cooperation between neurons and astrocytes, but also in the context of the glial modulation of neuronal activity. - Par rapport son volume, le cerveau utilise une quantit massive de glucose comme source d'nergie. De plus, la consommation d'quivalents nergtiques est troitement lie au niveau d'activit synaptique. Il a t montr que dans ce couplage neuromtabolique, un rle central est jou par les astrocytes. Ces cellules fournissent le lactate, un substrat mtabolique, aux neurones de manire adapte leur activit glutamatergique. Plus prcisment, le glutamate libr dans la fente synaptique par les neurones, est rcupr par les astrocytes et dclenche ainsi une cascade d'vnements intracellulaires qui conduit la production et libration de lactate. Les travaux de cette thse ont vis tudier la relation mtabolique et fonctionnelle entre neurones et astrocytes, avec une attention particulire pour des rles que pourrait avoir le lactate au-del de sa fonction mtabolique. Pour tudier les aspects spatio-temporels de ces interactions dynamiques, nous avons utilis la fois la microscopie optique associe des indicateurs fluorescents spcifiques, ainsi que l'lectrophysiologie. Dans la premire partie de cette thse, nous montrons que le lactate diminue l'activit neuronale spontane de faon concentration-dpendante et indpendamment de son mtabolisme. Nous avons identifi l'implication d'un rcepteur neuronal au lactate qui sous-tend ce mcanisme de rgulation. La dcouverte de cette signalisation via le lactate constitue un mode d'interaction supplmentaire et nouveau entre neurones et astrocytes. Dans la deuxime partie, nous avons caractris un outil pharmacologique, un inhibiteur des transporteurs du glutamate haute affinit. Le but de cette tude tait d'obtenir un agent pharmacologique capable d'interrompre spcifiquement le signal mdi par le glutamate entre neurones et astrocytes pouvant permettre de mieux comprendre leur relation. En conclusion, ces tudes ont une implication non seulement pour la comprhension de la coopration entre neurones et astrocytes mais aussi dans le contexte de la modulation de l'activit neuronale par les cellules gliales.
