Alterações vasculares na coróide de ratos diabéticos tratados e não tratados

OBJETIVO: Conhecer os efeitos do diabetes e o impacto de seu tratamento medicamentoso em curto e longo prazo sobre os vasos da coróide e membrana de Bruch. MÉTODOS: Foram estudados 30 ratos Wistar, divididos em 3 grupos experimentais: grupo controle (GC), grupo diabético (GD) e grupo diabético tratado (GT), estudados 1 mês (momento M1) e 12 meses (momento M2) após o início do experimento. O diabetes foi induzido por aloxana endovenosa, na dose de 42 mg/kg. O GT foi tratado com hipoglicemiante oral (acarbose) e insulina subcutânea. Após o sacrifício, os olhos foram preparados para exame ao microscópio eletrônico de transmissão, interessando a ultra-estrutura da membrana de Bruch e os vasos da coróide. RESULTADOS: O exame ultra-estrutural da coróide dos ratos diabéticos mostrou depósitos na membrana de Bruch, acúmulo de vesículas, glicogênio e corpos densos no citoplasma das células endoteliais. O grupo mais afetado foi de ratos diabéticos de 12 meses (GDM2). Os animais com menor intensidade de alterações foram os ratos tratados por 12 meses (GTM2). CONCLUSÃO: Os ratos diabéticos desenvolveram alterações degenerativas na membrana de Bruch e vasos da coróide. Estas alterações foram mais evidentes nos animais submetidos à doença crônica, mas também ocorreram agudamente. O tratamento a curto prazo não foi capaz de evitar os processos degenerativos. A longo prazo, o tratamento inibiu a progressão destes processos.

Expressão antigênica em carcinomas do plexo coróide humano: relato de dois casos

Neoplasias provenientes do epitélio de revestimento do plexo coróide são inco-muns, tendo sido descritos 6 padrões morfológicos. O padrão anaplásico, também denominado carcinoma do plexo coróide, é o de menor freqüência e pode dar metastases fora do SNC. A distinção histológica desses tumores, particularmente da variedade anaplásica, com outras neoplasias primárias e metastáticas no SNC pode ser difícil. O uso de técnicas imunocitoquimicas em parafina tem-se mostrado útil no esclarecimento das linhagens tumorais. Os papilomas do plexo coróide têm, no entanto, sido objeto de controvérsia, por sua complexa expressão antigênica. Usando a técnica de imunoperoxidase (sistema avidina-biotina-peroxidase) pesquisaram-se, em dois casos da variedade anaplásica, os seguintes marcadores: proteína glial fibrilar ácida (GFAP) com anticorpo monoclonal e policlonal; ceratinas de 40-50kDa, ceratinas de 60-70kDa (callus ceratina), enolase neuronal específica (NSE) e proteína S-100, com anticorpos monoclonais. Os dois tumores mostraram positividade para NSE, proteína S-100 e ceratina de 40-50kDa; uma das duas neoplasias mostrou diferenciação glial, revelando positividade para GFAP tanto com anticorpo monoclonal quanto policlonal.

Melanoma de coróide: Relato de caso insuspeito

The choroidal melanoma is the most frequent intraocular tumor in elderly, occurring mainly in the 60th. This paper shows a misdiagnosis tumor affecting a female aging 36 years-old, misdiagnosed and initially treated as a toxoplasmic uveitis. The tumor had orbit and neck metastasis. The authors call attention to the necessity of early diagnosis to improve the outcome.

Detecção das metaloproteinases-2 e -9 no plexo coróide e no liquor de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Análise da expressão do gene do receptor do fator de crescimento epidermal em tumores pediátricos do sistema nervoso central

Introdução: Os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC) constituem um grupo heterogêneo de neoplasias e representam o tumor sólido mais comum na infância e adolescência (DEANGELIS 2001). A tumorigênese é um processo de múltiplas etapas envolvendo alterações genéticas que levam a transformação progressiva de células normais para a formação de derivados altamente malignos (HANAHAN 2000). O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) é um receptor transmembrana que atua num sistema de sinalização fundamental para a fisiologia normal da célula e na manutenção do estado tumorigênico (JORISSEM 2003). O EGFR e seus ligantes estão envolvidos em mais de 70% de todas as neoplasias (YARDEN 2001). Em vários tipos de tumores, incluindo os tumores cerebrais, o EGFR é expresso aproximadamente 100 vezes mais do que o número normal de receptores encontrados na superfície de células normais. A hiperexpressão do EGFR e do ErbB2, tem sido associada com neoplasias que apresentam um comportamento clínico mais agressivo (ALROY 1997). Objetivos: Analisar a expressão do gene do EGFR em tumores primários do SNC. Material e Método: Análise de 18 amostras de tumores primários do SNC em crianças de 01 a 14 anos de idade utilizando uma técnica semi-quantitativa de RT-PCR. A coleta das amostras foi feita no período de 2002 a 2004. Resultados: A amostra foi composta por: um astrocitoma grau I, três astrocitomas grau III, três astrocitomas grau IV, três carcinomas de plexo coróide, 1 craniofaringeoma, três ependimomas, um tumor neuroectodérmico primitivo e três meduloblastomas. 33% da amostra apresentou hiperexpressão de EGFR. Ao analisar-se os resultados de expressão do EGFR nas amostras de astrocitomas verificou-se um aumento na expressão do EGFR para os tumores de grau IV, com exceção de uma amostra que apresentou um índice baixo de 0.13 RNAm. Para as demais amostras de astrocitoma grau 3 a expressão do EGFR foi baixa e os pacientes apresentaram sobrevida com doença, uma vez que não foi possível realizar ressecção cirúrgica total. Conclusão:Ainda que este estudo forneça dados de uma população bastante heterogênea é possível evidenciar diferenças nítidas de expressão do EGFR entre as diversas histologias que compreendem os tumores pediátrico do SNC. Tais resultados sugerem um importante papel do EGFR nos tumores cerebrais da infância e encorajam a continuidade de investigações que elucidem a real aplicabilidade deste fator de crescimento como marcador prognóstico e alvo terapêutico.

Prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes na cidade de Natal/Brasil

Objetivo: Determinar a prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes de escolas das redes pública e privada de Natal-RN. Métodos: Avaliação oftalmológica foi realizada em 990 alunos, de 5 a 21 anos, matriculados nas escolas das redes públicas e privada do município de Natal- RN, que estiveram cursando alguma série do ensino fundamental ou médio, no período de 03 a 06 de 2001. Resultados: Alterações fundoscópicas foram observadas em 5,3% dos estudantes. As anormalidades encontradas, por ordem de freqüência, foram: branco sem pressão, 1,0%; cicatriz de retinocoroidite sugestiva de toxoplasmose, 1,0%; atrofia do epitélio pigmentado da retina, 0,8%; nevos da coróide, 0,4%; escavação da cabeça do nervo óptico aumentada, 0,4%; degeneração em treliça, 0,3%; buraco operculado, 0,2%; fundus miópico, 0,2%; tortuosidade vascular aumentada, 0,2%; granuloma sugestivo de toxocaríase, 0,2%; hipoplasia da cabeça do nervo óptico, 0,1%; persistência da artéria hialoidea, 0,1%; persistência de fibras de mielina, 0,1%; retina sal e pimenta, 0,1%; retinosquise, 0,1%. Conclusão: Houve uma baixa prevalência de alterações fundoscópicas na população estudada

Prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes na cidade de Natal-Brasil

Objetivo: Determinar a prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes de escolas das redes pública e privada de Natal-RN. Métodos: Avaliação oftalmológica foi realizada em 990 alunos, de 5 a 21 anos, matriculados nas escolas das redes públicas e privada do município de Natal-RN, que estiveram cursando alguma série do ensino fundamental ou médio, no período de 03 a 06 de 2001. Resultados: Alterações fundoscópicas foram observadas em 5,3% dos estudantes. As anormalidades encontradas, por ordem de freqüência, foram: branco sem pressão, 1,0%; cicatriz de retinocoroidite sugestiva de toxoplasmose, 1,0%; atrofia do epitélio pigmentado da retina, 0,8%; nevos da coróide, 0,4%; escavação da cabeça do nervo óptico aumentada, 0,4%; degeneração em treliça, 0,3%; buraco operculado, 0,2%; fundus miópico, 0,2%; tortuosidade vascular aumentada, 0,2%; granuloma sugestivo de toxocaríase, 0,2%; hipoplasia da cabeça do nervo óptico, 0,1%; persistência da artéria hialoidea, 0,1%; persistência de fibras de mielina, 0,1%; retina sal e pimenta, 0,1%; retinosquise, 0,1%. Conclusão: Houve uma baixa prevalência de alterações fundoscópicas na população estudada

Three-dimensional magnetic resonance reconstruction images before and after surgical therapy of spontaneous canine brain tumors

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Micropartículas biodegradáveis para liberação prolongada intraocular de cetorolaco de trometamina obtidas po Spray Drying

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Histomorfometria do bulbo do olho de peneireiro-de-dorso-malhado (Falco tinnunculus – LINNAEUS, 1758)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Histopatologia e imunoistoquímica do bulbo do olho de equinos (Equus caballus, Linnaeus, 1758) soropositivos ou soronegativos para leptospirose

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Controle epigenético do gene imprinted SNRPN durante o desenvolvimento e reprogramação nuclear em equídeos

A tranferência nuclear de células somáticas (TNCS) está sendo utilizada para produzir cavalos de elite. No entanto, durante este procedimento pode ocorrer a perfuração da zona pelúcida, levando, ocasionalmente, à secção da massa celular interna, e conseqüente derivação de gêmeos monozigóticos. Além de serem relatadas alterações no processo de imprinting genômico, que conduzem ao desenvolvimento de doenças. Com a descoberta da possibilidade de reprogramar as células somáticas a um estado de pluripotência (iPSCs), estas células passaram a ser muito utilizadas em pesquisas de neurociência. Contudo, também ocorrem modificações epigenéticas durante esta reprogramação celular. Portanto, nossas hipóteses são que os gêmeos eqüinos gerados pela TNCS podem levar às irregularidades no desenvolvimento do sistema nervoso. O padrão de metilação do SNRPN nas estruturas dos fetos muares clonados, e as células iPSCs são diferentes dos padrões encontrados nos muares analisados. A expressão dos genes SNRPN, Necdin e UBE3A são maiores no cérebro, enquanto a expressão do H19 é maior nas membranas extra-embrionárias. Em nosso estudo, obtivemos duas gestações gemelares equinas derivadas da TNCS, que foram interrompidas com 40 e 60 dias de gestação, e comparados com gestações eqüinas únicas de idade similar. Diferenças no comprimento entre os embriões gêmeos foram observadas aos 40 (2.0 e 2.2 cm 10%) e aos 60 (6,5 e 8,5 cm 24%) dias de gestação. Somente o plexo coróide do quarto ventrículo apresentou-se mais desenvolvido nos fetos com maior comprimento. Ao analisarmos fetos muares clonados em diferentes idades gestacionais e compará-los com muares, nos períodos embrionário, fetal e adulto, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, na décima passagem das células iPSC o padrão de metilação alterou, em relação aos muares estudados e ao padrão observado nos fibroblastos. Ao analisarmos os fetos clonados nas diferentes idades gestacionais observou-se no cérebro menor expressão dos gene H19 e UBE3A, e maior expressão do gene SNRPN. Contudo, a expressão do gene Necdin variou entre as estruturas estudadas. Em conclusão, apesar dos gêmeos eqüinos provenientes de TNCS diferirem quanto ao tamanho, morfologicamente são iguais. Dentre as estruturas cerebrais o plexo coróide se apresentou mais desenvolvido nos fetos de maior comprimento. Os fetos muares clonados não apresentaram diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, as iPSCs apresentaram alteração no padrão de metilação deste gene na décima passagem. Embora os genes SNRPN, Necdin e UBE3A sejam expressos no cérebro, o SNRPN apresentou-se prevalente nessa estrutura

Prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes na cidade de Natal/Brasil

Objetivo: Determinar a prevalência de alterações fundoscópicas em estudantes de escolas das redes pública e privada de Natal-RN. Métodos: Avaliação oftalmológica foi realizada em 990 alunos, de 5 a 21 anos, matriculados nas escolas das redes públicas e privada do município de Natal- RN, que estiveram cursando alguma série do ensino fundamental ou médio, no período de 03 a 06 de 2001. Resultados: Alterações fundoscópicas foram observadas em 5,3% dos estudantes. As anormalidades encontradas, por ordem de freqüência, foram: branco sem pressão, 1,0%; cicatriz de retinocoroidite sugestiva de toxoplasmose, 1,0%; atrofia do epitélio pigmentado da retina, 0,8%; nevos da coróide, 0,4%; escavação da cabeça do nervo óptico aumentada, 0,4%; degeneração em treliça, 0,3%; buraco operculado, 0,2%; fundus miópico, 0,2%; tortuosidade vascular aumentada, 0,2%; granuloma sugestivo de toxocaríase, 0,2%; hipoplasia da cabeça do nervo óptico, 0,1%; persistência da artéria hialoidea, 0,1%; persistência de fibras de mielina, 0,1%; retina sal e pimenta, 0,1%; retinosquise, 0,1%. Conclusão: Houve uma baixa prevalência de alterações fundoscópicas na população estudada