Notch1 and T-cell development: insights from conditional knockout mice.

Notch proteins influence cell-fate decisions in many developmental systems. Gain-of-function studies have suggested a crucial role for Notch1 signaling at several stages during lymphocyte development, including the B/T, alphabeta/gammadelta and CD4/CD8 lineage choices. Here, we critically re-evaluate these conclusions in the light of recent studies that describe inducible and tissue-specific targeting of the Notch1 gene.

Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Effect of loss of CDKL5 on brain development in a new Cdkl5 knockout mouse model

Rett's Syndrome (RTT) is a severe neurodevelopmental disorder, characterized by cognitive disability that appears in the first months/years of life. Recently, mutations in the X-linked cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) gene have been detected in RTT patients characterized by early-onset seizures. CDKL5 is highly expressed in the brain starting from early postnatal stages to adulthood, suggesting the importance of this kinase for proper brain maturation and function. However, the role/s of CDKL5 in brain development and the molecular mechanisms whereby CDKL5 exerts its effects are still largely unknown. In order to characterize the role of CDKL5 on brain development, we created a mice carrying a targeted conditional knockout allele of Cdkl5. A first behavioral characterization shows that Cdkl5 knockout mice recapitulate several features that mimic the clinical features described in CDKL5 patients and are a useful tool to investigate phenotypic and functional aspects of Cdkl5 loss. We used the Cdkl5 knockout mouse model to dissect the role of CDKL5 on hippocampal development and to establish the mechanism/s underlying its actions. We found that Cdkl5 knockout mice showed increased precursor cell proliferation in the hippocampal dentate gyrus. Interestingly, this region was also characterized by an increased rate of apoptotic cell death that caused a reduction in the final neuron number in spite of the proliferation increase. Moreover, loss of Cdkl5 led to decreased dendritic development of new generated granule cells. Finally, we identified the Akt/GSK3-beta signaling as a target of Cdkl5 in the regulation of neuronal precursor proliferation, survival and maturation. Overall our findings highlight a critical role of CDKL5/AKT/GSK3-beta signaling in the control of neuron proliferation, survival and differentiation and suggest that CDKL5-related alterations of these processes during brain development underlie the neurological symptoms of the CDKL5 variant of RTT.

Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn

Patched 1 conditional null allele in mice

The patched gene (Ptc) is a member of the hedgehog signaling pathway which plays a central role in the development of many invertebrate and vertebrate tissues. In addition, Ptc and a number of other pathway members are mutated in some common human cancers. Patched is the receptor for the hedgehog ligand and in the mouse ablation of the Ptc gene leads to developmental defects and an embryonic lethal phenotype. Here we describe a conditional Ptc allele in mice which will have utility for the temporospatial ablation of Ptc function. genesis 36:158-161, 2003. (C) 2003 Wiley-Liss, Inc.

Modeling prostate cancer: a perspective on transgenic mouse models

Despite considerable success in treatment of early stage localized prostate cancer (PC), acute inadequacy of late stage PC treatment and its inherent heterogeneity poses a formidable challenge. Clearly, an improved understanding of PC genesis and progression along with the development of new targeted therapies are warranted. Animal models, especially, transgenic immunocompetent mouse models, have proven to be the best ally in this respect. A series of models have been developed by modulation of expression of genes implicated in cancer-genesis and progression; mainly, modulation of expression of oncogenes, steroid hormone receptors, growth factors and their receptors, cell cycle and apoptosis regulators, and tumor suppressor genes have been used. Such models have contributed significantly to our understanding of the molecular and pathological aspects of PC initiation and progression. In particular, the transgenic mouse models based on multiple genetic alterations can more accurately address the inherent complexity of PC, not only in revealing the mechanisms of tumorigenesis and progression but also for clinically relevant evaluation of new therapies. Further, with advances in conditional knockout technologies, otherwise embryonically lethal gene changes can be incorporated leading to the development of new generation transgenics, thus adding significantly to our existing knowledge base. Different models and their relevance to PC research are discussed.

The adhesion molecule L1 regulates transendothelial migration and trafficking of dendritic cells

The adhesion molecule L1, which is extensively characterized in the nervous system, is also expressed in dendritic cells (DCs), but its function there has remained elusive. To address this issue, we ablated L1 expression in DCs of conditional knockout mice. L1-deficient DCs were impaired in adhesion to and transmigration through monolayers of either lymphatic or blood vessel endothelial cells, implicating L1 in transendothelial migration of DCs. In agreement with these findings, L1 was expressed in cutaneous DCs that migrated to draining lymph nodes, and its ablation reduced DC trafficking in vivo. Within the skin, L1 was found in Langerhans cells but not in dermal DCs, and L1 deficiency impaired Langerhans cell migration. Under inflammatory conditions, L1 also became expressed in vascular endothelium and enhanced transmigration of DCs, likely through L1 homophilic interactions. Our results implicate L1 in the regulation of DC trafficking and shed light on novel mechanisms underlying transendothelial migration of DCs. These observations might offer novel therapeutic perspectives for the treatment of certain immunological disorders.

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

The role of the nuclear receptor Nr5a2 in ovulation in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux.

Diversité fonctionnelle du facteur de transcription Tbx5 dans le coeur

Le cœur des vertébrés est un organe modulaire qui requiert le " patterning " complexe des champs morphogénétiques cardiogènes et la convergence coordonnée des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques. Au moins 7 facteurs de transcription de la famille T-box coopèrent au sein de ces nombreuses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques afin de réguler la morphogenèse et l’agencement de multiples structures le long de l’ébauche cardiaque, ce qui explique que les mutations humaines de ces gènes engendrent diverses malformations congénitales cardiaques (MCCs). L’un de ces gènes T-box, Tbx5, dont l’haploinsuffisance génère le syndrome de Holt-Oram (SHO), intervient dans une grande variété de réseaux de régulation géniques (RRGs) qui orchestrent la morphogenèse des oreillettes, du ventricule gauche, de la valve mitrale, des septums inter-auriculaire et inter-ventriculaire, ainsi que du système de conduction cardiaque. La diversité des RRGs impliqués dans la formation de ces structures cardiaques suggère que Tbx5 détient une profusion de fonctions qui ne seront identifiables qu’en répertoriant ses activités moléculaires dans chaque lignée cardiaque examinée isolément. Afin d’aborder cette problématique, une ablation génétique de Tbx5 dans l’endocarde a été réalisée. Cette expérience a démontré le rôle crucial de Tbx5 dans la survie des cellules endocardiques bordant le septum primum et des cardiomyocytes au sein de cette structure embryonnaire qui contribuera à la morphogenèse du septum inter-auriculaire. En outre, cette étude a révélé l’existence d’une communication croisée entre la sous-population de cellules endocardiques Tbx5+ et le myocarde au niveau du septum primum, afin d’assurer la survie des cardiomyocytes, et ultimement de garantir la maturation du septum inter-auriculaire. Nos résultats confirment aussi l’importance de l’interdépendance génétique (Tbx5 et Gata4 ainsi que Tbx5 et Nos3) entre différents loci dans la morphogenèse de la cloison inter-auriculaire, et particulièrement de l’influence que peut avoir l’environnement sur la pénétrance et l’expressivité des communications inter-auriculaires (CIAs) dans le SHO. En outre, puisque les fonctions d’un gène dépendent ordinairement des différents isoformes qu’il peut générer, une deuxième étude a focalisé davantage sur l’aspect transcriptionnel de Tbx5. Cette approche a mené à la découverte de 6 transcrits alternatifs exhibant des fonctions à la fois communes et divergentes. La caractérisation de 2 de ces isoformes a révélé le rôle de l’isoforme long (Tbx5_v1) dans la régulation de la croissance des cardiomyocytes durant la cardiogénèse, tandis que l’isoforme court (Tbx5_v2), préférentiellement exprimé dans le cœur mature, réprime la croissance cellulaire. Il est donc entièrement concevable que les mutations de TBX5 entraînant une troncation de la région C-terminale accroissent la concentration d’une protéine mutée qui, à l’instar de Tbx5_v2, interfère avec la croissance de certaines structures cardiaques. En revanche, la divergence de fonctions de ces isoformes, caractérisée par les disparités de localisation subcellulaire et de d’interaction avec d’autres cofacteurs cardiaques, suggère que les mutations affectant davantage un isoforme favoriseraient l’émergence d’un type particulier de MCC. Finalement, un dernier objectif était d’identifier le ou les mécanisme(s) moléculaire(s) par le(s)quel(s) Tbx5 régule son principal gène cible, Nppa, et d’en extraire les indices qui éclairciraient sa fonction transcriptionnelle. Cet objectif nécessitait dans un premier lieu d’identifier les différents modules cis-régulateurs (MCRs) coordonnant la régulation transcriptionnelle de Nppa et Nppb, deux gènes natriurétiques dont l’organisation en tandem et le profil d’expression durant la cardiogénèse sont conservés dans la majorité des vertébrés. L’approche d’empreinte phylogénétique employée pour scanner le locus Nppb/Nppa a permis d’identifier trois MCRs conservés entre diverses espèces de mammifères, dont un (US3) est spécifique aux euthériens. Cette étude a corroboré que la régulation de l’expression du tandem génique Nppb/Nppa requérait l’activité transcriptionnelle d’enhancers en complément aux promoteurs de Nppa et Nppb. La concordance quasiment parfaite entre les profils d’expression de Tbx5 et de ces deux gènes natriurétiques chez les mammifères, suggère que le gradient d’expression ventriculaire de Tbx5 est interprété par le recrutement de ce facteur au niveau des différents enhancers identifiés. En somme, les études présentées dans cette thèse ont permis de clarifier la profusion de fonctions cardiaques que possède Tbx5. Certaines de ces fonctions émanent de l’épissage alternatif de Tbx5, qui favorise la synthèse d’isoformes dotés de propriétés spécifiques. Les diverses interactions combinatoires entre ces isoformes et d’autres facteurs cardiaques au sein des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogènes contribuent à l’émergence de RRGs cardiaques divergents.

The orphan nuclear receptor NR5A2 regulates peri-ovulatory events and their consequent luteinization in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune.

Leptin modulation of locomotor and emotional behaviors : the role of STAT3 signaling in dopamine neurons

La leptine circule en proportion de la masse graisseuse du corps et la transduction de son signal à travers la forme longue de son récepteur via un certain nombre de voies neurales , y compris MAPK, PI3-K ,AMPK et JAK2 - STAT3 . Il faut noter que STAT3 constitue une voie clée au récepteur de la leptine par laquelle la leptine module l'expression des gènes impliqués dans la régulation du bilan énergétique. La plupart des recherches ont porté sur la fonction du récepteur de la leptine au sein de l' hypothalamus, en particulier la fonction du récepteur de la leptine dans le noyau arqué. Toutefois, les récepteurs de la leptine sont également exprimés sur les neurones dopaminergiques de l'aire tégmentale ventrale et la leptine agit sur cette région du cerveau pour influencer la prise alimentaire, la motivation, la locomotion, l'anxiété et la transmission de la dopamine. De plus, la leptine active la STAT3 dans les dopaminergiques et GABAergiques populations neuronales. Bien que ces résultats contribuent à notre compréhension des multiples actions de la leptine dans le système nerveux central, il reste à résoudre les cellules et la signalisation du récepteur de la leptine qui sont responsables des effets neurocomportementaux de la leptine dans le mésencéphale. Visant à déterminer la contribution de la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous avons généré une lignée de souris knockout conditionnel dans lequel l'activation du gène de STAT3 sur son résidu tyrosine 705 ( Tyr 705 ) est absent spécifiquement dans les neurones dopaminergiques. Avec l'utilisation de ce modèle de souris génétique, nous avons évalué l'impact de l'ablation de la signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques sur un certain nombre de fonctions liées à la dopamine, y compris l'alimentation, la locomotion, les comportements liés à la récompense, l'émotion et la libération de dopamine dans le noyau accumbens. Fait intéressant, nous avons observé un dimorphisme sexuel dans le phénotype des souris STAT3DAT-KO. L'activation de la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques est responsable de l'action de la leptine dans la réduction de la locomotion, récompense liée à l'activité physique, et de l'augmentation de la libération et de la disponibilité de la dopamine chez les souris mâles. Cependant, il ne module pas le comportement émotionnel. D'autre part, les souris femelles STAT3DAT-KO augmentent les niveaux d'anxiété et les niveaux plasmatiques de corticostérone, sans provoquer de changements de la dépression. Cependant, la perte d'activation de STAT3 dans les neurones dopaminergiques ne module pas le comportement locomoteur chez les souris femelles. Notamment, les actions de la leptine dans le mésencéphale pour influencer le comportement alimentaire ne sont pas médiées par l'activation de STAT3 dans les neurones dopaminergiques, considérant que les souris mâles et femelles ont un comportement alimentaire normal. Nos résultats démontrent que la voie de signalisation STAT3 dans les neurones dopaminergiques est responsable des effets anxiolytiques de la leptine, et soutient l'hypothèse que la leptine communique l'état d'énergie du corps (i.e. la relation entre la dépense et les apports énergétiques) pour les régions mésolimbiques pour atténuer les effets de motivation et de récompense de plusieurs comportements qui servent à réhabiliter ou à épuiser les réserves d'énergie. En outre, ce travail souligne l'importance d'étudier la modulation de la signalisation de la leptine dans différente types de cellules, afin d'identifier les voies de signalisation et les mécanismes cellulaires impliqués dans les différentes fonctions neuro-comportementales de la leptine.

Bases moléculaires et cellulaires d’un trouble neurodéveloppemental causé par l’haploinsuffisance de SYNGAP1.

La déficience intellectuelle est la cause d’handicap la plus fréquente chez l’enfant. De nombreuses évidences convergent vers l’idée selon laquelle des altérations dans les gènes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodéveloppementales telles que la déficience intellectuelle ou encore l’autisme. Jusqu’à récemment, la majorité des mutations associées à la déficience intellectuelle a été liée au chromosome X ou à la transmission autosomique récessive. D’un autre côté, plusieurs études récentes suggèrent que des mutations de novo dans des gènes à transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticité synaptique peuvent être à la source d’une importante fraction des cas de déficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de l’exome et le séquençage de l’ADN génomique, notre laboratoire a précédemment reporté les premières mutations pathogéniques dans le gène à transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernières ont été associées à des troubles comportementaux tels que la déficience intellectuelle, l’inattention, des problèmes d’humeur, d’impulsivité et d’agressions physiques. D’autres patients sont diagnostiqués avec des troubles autistiques et/ou des formes particulières d’épilepsie généralisée. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) résulte en des déficits comme l’hyperactivité locomotrice, une réduction du comportement associée à l’anxiété, une augmentation du réflexe de sursaut, une propension à l’isolation, des problèmes dans le conditionnement à la peur, des troubles dans les mémoires de travail, de référence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- représente un modèle approprié pour l’étude des effets délétères causés par l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur le développement de circuits neuronaux. D’autre part, il est de première importance de statuer si les mutations humaines aboutissent à l’haploinsuffisance de la protéine. SYNGAP1 encode pour une protéine à activité GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entraîne l’augmentation des niveaux d’activité de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogenèse anormale des épines dendritiques et un excès dans la concentration des récepteurs AMPA à la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs études suggèrent que l’augmentation précoce de l’insertion des récepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue à certains phénotypes observés chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les conséquences de l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) d’identifier l’impact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de déterminer si SYNGAP1 contribue au développement et à la fonction des circuits GABAergiques; 3) de révéler comment l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publié les premières mutations humaines de type faux-sens dans le gène SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernières sont toutes de novo à l’exception de c.283dupC, héritée d’un père mosaïque pour la même mutation. Dans cette étude, nous avons confirmé que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 présentent, entre autre, des phénotypes associés à des troubles comportementaux relatifs à la déficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de l’ADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales réduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de l’activité neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle précédemment répertoriée R579X, n’engendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces résultats suggèrent que ces mutations faux-sens et tronquante résultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour conséquences d’affecter la régulation du développement cérébral. Plusieurs études publiées suggèrent que les déficits cognitifs associés à l’haploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent émerger d’altérations dans le développement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manière ces mutations affectent le développement des interneurones GABAergiques résultant en un déséquilibre entre l’excitation et l’inhibition et aux déficits cognitifs restent sujet de controverses. Par conséquent, nous avons examiné la contribution de Syngap1 dans le développement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons généré une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allèle de Syngap1 est spécifiquement excisé dans les interneurones GABAergiques issus de l’éminence ganglionnaire médiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons démontré que la réduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs résulte en des altérations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densité synaptique. De plus, réalisés sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux évoqués au moyen de l’optogénétique (oIPSC) dévoilent une réduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons comparé les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ à celles de leurs congénères contrôles dans une batterie de tests comportementaux. À l’inverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne présentent pas d’hyperactivité locomotrice, ni de comportement associé à l’anxiété. Cependant, elles démontrent des déficits similaires dans la mémoire de travail et de reconnaissance sociale, suggérant que l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques dérivés de l’éminence ganglionnaire médiale récapitule en partie certains des phénotypes cognitifs observés chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD établissent pour la première fois que les mutations humaines dans le gène SYNGAP1 associés à la déficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protéine. Mes études dévoilent, également pour la première fois, l’influence significative de ce gène dans la régulation du développement et de la fonction des interneurones. D’admettre l’atteinte des cellules GABAergiques illustre plus réalistement la complexité de la déficience intellectuelle non syndromique causée par l’haploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une compréhension raffinée de cette condition neurodéveloppementale pourra mener à une approche thérapeutique adéquate.

A dual role for integrin-linked kinase in platelets: regulating integrin function and alpha-granule secretion

Integrin-linked kinase (ILK) has been implicated in the regulation of a range of fundamental biological processes such as cell survival, growth, differentiation, and adhesion. In platelets ILK associates with beta 1- and beta 3-containing integrins, which are of paramount importance for the function of platelets. Upon stimulation of platelets this association with the integrins is increased and ILK kinase activity is up-regulated, suggesting that ILK may be important for the coordination of platelet responses. In this study a conditional knockout mouse model was developed to examine the role of ILK in platelets. The ILK-deficient mice showed an increased bleeding time and volume, and despite normal ultrastructure the function of ILK-deficient platelets was decreased significantly. This included reduced aggregation, fibrinogen binding, and thrombus formation under arterial flow conditions. Furthermore, although early collagen stimulated signaling such as PLC gamma 2 phosphorylation and calcium mobilization were unaffected in ILK-deficient platelets, a selective defect in alpha-granule, but not dense-granule, secretion was observed. These results indicate that as well as involvement in the control of integrin affinity, ILK is required for alpha-granule secretion and therefore may play a central role in the regulation of platelet function. (Blood. 2008; 112: 4523-4531)

Increased hippocampal excitability and impaired spatial memory function in mice lacking VGLUT2 selectively in neurons defined by tyrosine hydroxylase promoter activity

Three populations of neurons expressing the vesicular glutamate transporter 2 (Vglut2) were recently described in the A10 area of the mouse midbrain, of which two populations were shown to express the gene encoding, the rate-limiting enzyme for catecholamine synthesis, tyrosine hydroxylase (TH).One of these populations (‘‘TH– Vglut2 Class1’’) also expressed the dopamine transporter (DAT) gene while one did not ("TH–Vglut2 Class2"), and the remaining population did not express TH at all ("TH-Vglut2-only"). TH is known to be expressed by a promoter which shows two phases of activation, a transient one early during embryonal development, and a later one which gives rise to stable endogenous expression of the TH gene. The transient phase is, however, not specific to catecholaminergic neurons, a feature taken to advantage here as it enabled Vglut2 gene targeting within all three A10 populations expressing this gene, thus creating a new conditional knockout. These knockout mice showed impairment in spatial memory function. Electrophysiological analyses revealed a profound alteration of oscillatory activity in the CA3 region of the hippocampus. In addition to identifying a novel role for Vglut2 in hippocampus function, this study points to the need for improved genetic tools for targeting of the diversity of subpopulations of the A10 area