Effets non cancérogènes associés aux BPC : revue critique des études épidémiologiques et analyse du lien de causalité

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Encapsulation de Dehalococcoides: avantage pour la déhalogénation des solvants chlorés en sites contaminés

Le tétrachloroéthène (PCE) et les éthènes chlorés qui lui sont apparentés ont été abondamment utilisés pour plusieurs applications en industrie dès le début du 20e siècle. Ils sont cependant comptés parmi les polluants les plus communs des sols et de l’eau et beaucoup d’efforts sont déployés afin de les éliminer. Nous croyons que la conversion des éthènes chlorés en éthènes par des microorganismes est une solution prometteuse. Le premier aspect du projet visait donc à établir les conditions pour lesquelles un consortium enrichi en Dehalococcoides ethenogenes permettrait la conversion complète de PCE en éthène. Les expériences réalisées nous ont permis de souligner le rôle de l’acide lactique ajouté aux cultures comme source de carbone et source indirecte d’électrons pour la déhalorespiration. Nous avons également pu établir l’effet de la concentration initiale de biomasse dans les cultures sur le profil de déhalogénation du PCE. Le deuxième aspect du projet visait à développer un protocole d’encapsulation du consortium dans une matrice polymérique afin de profiter des nombreux avantages potentiels de l’encapsulation. Nous avons testé trois montages d’encapsulation différents : atomisation avec jet d’air, atomisation avec vibrations ultrasoniques et « drop-wise ». Le dernier montage prévoyait l’encapsulation des cultures dans des billes d’alginate enrobées de chitosane gélifié par du lignosulfonate. C’est le seul montage qui nous a permis d’encapsuler le consortium de façon efficace sans effet significatifs négatifs sur son activité de déchlorination. Aussi, la comparaison des profils de déhalogénation du PCE de cellules encapsulées et cellules libres a montré une plus faible accumulation de TCE, 1,2-DCE et VC dans les échantillons de cellules encapsulée et, par conséquent, une conversion plus rapide et plus complète du PCE en éthène. Finalement, nous avons observé une tendance favorable à l’idée que les microorganismes encapsulés bénéficient d’un effet de protection contre de faibles concentrations d’oxygène.

Effet de la source du sélénium sur le statut du sélénium, de la GSH-Px et sur le système immunitaire des bovins de boucherie

Résumé L’objectif de cette étude était de déterminer les effets de la source de sélénium sur les concentrations de Se et de GSH-Px des vaches de boucherie (n =33) et leurs veaux et sur des paramètres immunitaires des veaux. Deux groupes de vaches ont reçu 3 mg/j/animal de Se organique ou inorganique dans le minéral. Le troisième groupe n'a pas été supplémenté en Se et leurs veaux ont été divisés en deux sous-groupes, l’un des deux a reçu une injection de sélénite de sodium (0,087 mg/Kg) à la naissance. Le Se et la GSH-Px ont été respectivement mesurés par HPLC-UV et par cinétique enzymatique. La phagocytose, la flambée respiratoire et le ratio CD4:CD8ont été évalués par des kits commerciaux et les IgG totales ont été mesurés par immunodiffusion radiale. La supplémentation de Se a augmenté significativement le Se sérique et colostral (P<0,02) et la GSH-Px(P≤0,04) pour les vaches et leurs veaux avec un effet significativement plus élevé pour le Se organique. Le Se du lait a augmenté de façon significative uniquement avec la source organique du Se (P≤0,0007). L’injection du Se chez les veaux a permis une augmentation significative mais temporaire (P<0,0001) du Se sérique. La supplémentation en Se n’a pas influencé les paramètres immunitaires mesurés (P>0,01, non significatif après correction de Bonferroni). Nous concluons que la supplémentation en Se améliore le niveau du Se colostral, lacté et sérique ainsi que la GSH-Px pour les vaches et leurs veaux sans effet sur les paramètres immunitaires mesurés des veaux. Mots clés: Sélénium, veaux de boucherie, phagocytose, flambée respiratoire, anticorps, ratio CD4:CD8, GSH-Px.

Analyse systématique de la relation entre l’exposition prénatale aux biphényles polychlorés et les effets neurodéveloppementaux et thyroïdiens chez l’enfant

Les biphényles polychlorés (BPC) sont des contaminants de l’environnement, omniprésents dans la chaîne alimentaire, qui ont une propension à la bioaccumulation dans le corps humain. Ils traversent la barrière placentaire et sont suspectés d’induire des altérations du développement mental ou moteur chez des enfants exposés aux BPC pendant la vie intrautérine. Ces effets s’expliqueraient notamment par la capacité des BPC à perturber l’homéostasie de la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Malgré le nombre considérable d’études épidémiologiques réalisées, la relation entre l’exposition prénatale aux BPC et les altérations du développement mental et moteur ou de la fonction thyroïdienne n’a pas encore été clairement établie ; d’une part, différents bioindicateurs de l’exposition ont été employés (différents congénères de BPC mesurés et différentes matrices biologiques ou unités de mesure) limitant la comparaison directe entre les études et, d’autre part, le lien de causalité entre les BPC et les effets ciblés n’a pas été vérifié avec des critères épidémiologiques reconnus. Cette étude a été réalisée afin d’analyser la relation « concentration biologique de BPC – effet » entre l'exposition aux BPC de la mère pendant la grossesse et le développement mental et moteur de l’enfant ainsi que les paramètres de la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte et le nouveau-né à partir d’une analyse systématique des études épidémiologiques disponibles en standardisant les données biologiques entre les études. Sur la base de considérations toxicocinétiques et en appliquant des facteurs de conversion établis à partir de la littérature épidémiologique publiée, les concentrations des BPC rapportées dans les différentes études revues ont été standardisées en termes d’équivalent de BPC totaux par kilogramme de lipides dans le plasma maternel (µg PCBMPEQ/kg de lipides). Afin d’analyser la possibilité d’une association causale entre l’exposition aux BPC et les effets d’intérêt, les critères de Hill ont été appliqués systématiquement à l’ensemble des associations « concentrations biologiques standardisées – effet ciblés ». En appliquant cette approche aux données publiées de 20 études épidémiologiques sur la relation entre les BPC et le poids à la naissance, l’exposition prénatale aux BPC, aux niveaux décrits (moyenne < 1920 µg PCBMPEQ/kg de lipides), n’apparaît pas associée de manière significative à un poids à la naissance inférieur à 2500 g dans les populations étudiées. Par ailleurs, en considérant des études menées sur le suivi de neuf cohortes d’enfants, la probabilité qu’une altération cognitive ou motrice cliniquement significative, qui persiste entre la naissance et l’âge scolaire, soit observée à des concentrations de BPC totaux inférieures à 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides semble faible. Aussi, à partir de l’analyse systématique des données de 17 études épidémiologiques, l’exposition aux BPC aux niveaux standardisés décrits (moyenne < 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides) ne semble pas induire de variation des hormones thyroïdiennes ou de TSH en dehors des intervalles physiologiques reconnus chez la femme enceinte et le nouveau-né. Ainsi, la valeur biologique de référence établie à 1000 µg PCBMPEQ/kg de lipides pour prévenir les effets sur le développement devrait aussi prévenir les effets sur le poids à la naissance et la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Les résultats présentés dans cette thèse fournissent aux autorités de santé publique responsables de l’établissement de directives et des normes de l’information utile à la révision des critères sanitaires visant à protéger des effets des BPC sur le développement de l’enfant et la fonction thyroïdienne chez la femme enceinte et le nouveau-né.

Impacts moléculaires d’un excès d’acides gras sur l’androgenèse des cellules surrénaliennes

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) touche entre 5 à 10 % des femmes en âge de procréer et est associé à de nombreuses complications. Ce désordre endocrinien est caractérisé par des niveaux circulants élevés d’androgènes, dont la production est principalement modulée par la P450c17 et son cofacteur, soit la P450oxydoréductase (POR). Plusieurs études démontrent que l’hyperandrogénie présente chez les femmes SOPK pourrait être causée par la formation de phénomènes toxiques survenant à la suite de l’exposition des tissus non adipeux à un excès d’acides gras non estérifiés (AGNE), appelé lipotoxicité. Ainsi, l’objectif de cette étude est de déterminer les mécanismes cellulaires sous-jacents à l’hyperandrogénie induite par la surexposition des cellules productrices d’androgènes aux AGNE. Pour y arriver, les cellules surrénaliennes bovines (CSB) ont été exposées en présence de forskoline (Fsk; 1X/2 jours; 10 µM; activateur des adénylates cyclases) et d’oléate (acide gras monoinsaturé, 2X/jour; 200 µM) durant 48 heures. Par la suite, le milieu de culture a été prélevé afin de doser le DHEA (principal androgène surrénalien) par ELISA. De plus, les protéines ont été récoltées afin de déterminer l’expression protéique de la P450c17 et de POR par Western blot. Finalement, pour déterminer les activités 17αhydroxylase et 17,20-lyase de la P450c17, la concentration de plusieurs stéroïdes a été déterminé par LC-MS/MS et le ratio produit/substrat a été effectué. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM. Ainsi, sous stimulation à la Fsk, la présence de 200 µM d’oléate (vs absence d’oléate) augmente la production de DHEA de 114% par les CSB (n=17; 214 ± 20% vs 100 ± 0%; p<0,0001). De plus, l’ajout d’oléate n’affecte pas l’expression de la P450c17 (n=8; 98 ± 6% vs 100 ± 0%; p=0,74) et de POR (n=7; 119 ± 13% vs 100 ± 0%; p= 0,22). Finalement, la présence d’oléate augmente l’activité 17αhydroxylase de la P450c17 de 124% (n=7; 224 ± 19% vs 100 ± 0%; p= 0,02) et tends à augmenter l’activité 17,20-lyase de la P450c17 de 81% (n=7; 181 ± 28% vs 100 ± 0%; p= 0,08). Ainsi, l’augmentation de la production des androgènes induite par les AGNE pourrait être due principalement à leurs effets sur l’augmentation des deux activités enzymatiques de la P450c17, sans effet significatifs sur l’expression de la P450c17 ni de son cofacteur POR. Les mécanismes sous-jacents à l’augmentation des activités de la P450c17 demeurent à élucider.

Étude de la fonction ovarienne chez les souris déficientes des enzymes hyaluronidases

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa.

Caractérisation fonctionnelle du gène AP1S1 mutant associé au syndrome de MEDNIK

Dans les cellules eucaryotes, le trafic intracellulaire de nombreuses protéines est assuré par des vésicules de transport tapissées de clathrine. Les complexes adaptateurs de clathrine (AP) sont responsables de l’assemblage de ces vésicules et de la sélection des protéines qui seront transportées. Nous avons étudié cinq familles atteintes du syndrome neurocutané MEDNIK qui est caractérisé par un retard mental, une entéropathie, une surdité, une neuropathie périphérique, de l’icthyose et de la kératodermie. Tous les cas connus de cette maladie à transmission autosomique récessive sont originaires de la région de Kamouraska, dans la province de Québec. Par séquençage direct des gènes candidats, nous avons identifié une mutation impliquant le site accepteur de l’épissage de l’intron 2 du gène codant pour la sous-unité σ1 du complexe AP1 (AP1S1). Cette mutation fondatrice a été retrouvée chez tous les individus atteints du syndrome MEDNIK et altère l’épissage normal du gène, menant à un codon stop prématuré. Afin de valider l’effet pathogène de la mutation, nous avons bloqué la traduction de cette protéine chez le poisson zébré en injectant une séquence d’oligonucléotides antisenses spécifique à AP1S1. À 48 heures après la fertilisation, les larves knock down pour AP1S1 montrent une réduction de la pigmentation, une désorganisation de la structure de l’épiderme et une perturbation du développement moteur. Alors que la surexpression de l’AP1S1 humain dans ce modèle a permis la récupération du phénotype normal, l’expression de l’AP1S1 mutant fut sans effet sur les phénotypes moteurs et cutanés des larves knock down. Les résultats obtenus montrent que la mutation du AP1S1 responsable du syndrome de MEDNIK est associée à une perte de fonction et que la sous-unité σ1 du complexe AP1 joue un rôle crucial dans l’organisation de l’épiderme et le développement de la moelle épinière.

Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

Mécanismes cellulaires de l'induction du facteur de transcription Nur77 après un traitement aux antipsychotiques

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération.

The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.

Découverte de nouvelles interactions entre le virus de l'Hépatite C et l'hôte par une approche combinée de Spectrométrie de Masse et de Génomique Fonctionnelle

La réplication et l’assemblage du virus de l’hépatite C (VHC) sont régulés finement dans le temps et l’espace par les interactions protéiques entre le virus avec l’hôte. La compréhension de la biologie du virus ainsi que sa pathogénicité passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hôte. Afin d’identifier ces interactions, nous avons exploité une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à une détection par spectrométrie de masse (MS), pour ensuite évaluer le rôle des protéines identifiées dans le cycle viral par une technique de silençage génique. Les protéines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont été exprimées individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprécipitées afin d’isoler des complexes protéiques qui ont été soumis à l’analyse MS. Ainsi, 98 protéines de l’hôte ont été identifiées avec un enrichissement significatif et illustrant une spécificité d’interaction. L’enrichissement de protéines connues dans la littérature a démontré la force de l’approche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hôte. Enfin, le rôle de ces interactants sur la réplication virale a été évalué dans un criblage génomique par ARN interférant (ARNi). Deux systèmes rapporteurs de la réplication virale ont été utilisés : le système de réplicon sous-génomique (Huh7-Con1-Fluc) et le système infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi qu’un essai de toxicité cellulaire (Alamar Blue). Parmi les protéines de l’hôte interagissant avec le VHC, 28 protéines ont démontré un effet significatif sans effet de toxicité cellulaire, suggérant fortement un rôle dans la réplication du VHC. Globalement, l’étude a mené à l’identification de nouvelles interactions virus/hôte et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Étude Pharmacologique de la Douleur Neuropathique Centrale à la suite d'une Hémorragie Intrathalamique induite chez le Rat.

La douleur neuropathique centrale post accident vasculaire cérébral est une condition débilitante dont le traitement s’avère souvent délicat et infructueux. Le but de ce projet était de reproduire cette condition chez le rat en injectant par stéréotaxie une solution de collagènase produisant une hémorragie localisée dans le noyau ventropostérolatéral du thalamus. Des tests comportementaux évaluant la coordination motrice, la sensibilité mécanique, au chaud et au froid étaient réalisés régulièrement afin d’établir la présence de douleur neuropathique puis les effets de l’administration de kétamine, d’amitriptyline, de gabapentine, et de carbamazepine étaient évalués. L’induction d’une hémorragie intrathalamique conduit à l’apparition d’allodynie mécanique bilatérale persistante ainsi que d’allodynie au froid transitoire chez certains sujets et ce sans modification de la coordination motrice. L’administration de kétamine à forte dose renverse l’allodynie mécanique mais est associée à une altération de la motricité. L’administration de gabapentine renverse également cette allodynie mécanique sans effet notable sur la coordination motrice. Les autres médicaments n’ont pas démontré d’effet significatif. L’évaluation histopathologique des cerveaux montre une lésion bien localisée dans la zone d’intérêt. Ces résultats montrent que l’injection intrathalamique de collagénase peut être utilisée comme un modèle fiable de douleur neuropathique centrale. Si la kétamine semble capable de soulager ce type de douleur, elle est associée à des effets indésirables. En revanche, la gabapentine serait une molécule prometteuse pour le traitement de cette condition. Le rôle des récepteurs NMDA et des canaux calciques voltage dépendants, cibles respectives de la kétamine et de la gabapentine dans le maintien de cette douleur mérite d’être précisé.

Évaluations physiologiques de la tricaïne méthanesulfonate pour l’anesthésie des grenouilles africaines à griffes (Xenopus laevis)

Il existe peu d’études sur les effets physiologiques et pharmacologiques du médicament anesthésiant le plus utilisé chez les anoures, la tricaïne méthanesulfonate, et son utilisation chez la grenouille Xenopus laevis. Notre premier objectif était d’évaluer l’effet de bains d’immersion de 20 minutes de 1 et 2 g/L de tricaïne méthanesulfonate sur la fonction cardiorespiratoire, l’analgésie et les réflexes ainsi que d’étudier la pharmacocinétique. Nos résultats démontrent que des bains de 1 et 2 g/L produisent une anesthésie chirurgicale de 30 et 60 minutes respectivement, sans effet significatif sur le système cardiorespiratoire. À la suite d’une immersion à 2 g/L, on note une demi-vie terminale de 3,9 heures. Cette dose ne produit aucun effet sur l’histologie des tissus 24 heures après l’immersion. Dans une deuxième expérience, nous avons évalué les effets d’une surdose de tricaïne méthanesulfonate en bain d’immersion sur les systèmes cardiorespiratoire et nerveux central grâce à l’électroencéphalographie ainsi que l’effet d’une injection de pentobarbital sodique après 2 heures d’immersion. L’EEG montre un effet dépresseur sur le SNC avec l’utilisation de la tricaïne méthanesulfonate sans voir un arrêt de signal d’EEG sur la période de 2 heures d’enregistrement. Les surdoses à 1 g/L et 3 g/L n’ont pas d’effet significatif sur le rythme cardiaque, et l’injection de pentobarbital suite au bain d’immersion de tricaïne méthanesulfonate est nécessaire pour induire l’euthanasie. Nous avons démontré que le bain de tricaïne méthanesulfonate peut produire une anesthésie de 30 à 60 minutes avec dépression du SNC sans effet cardiovasculaire chez les Xenopus laevis.

Effets de l'activité physique durant la grossesse sur le cerveau de la mère et de l'enfant

La grossesse est un moment charnière de la vie où la femme reconsidère les bienfaits de chacune de ses habitudes de vie. Il est bien connu que l'activité physique apporte des bénéfices pour la cognition des enfants et des adultes, mais est-ce aussi le cas des femmes enceintes? Et qu'en est-il de l'enfant à naitre? L’objectif général de cette thèse était d’examiner l'effet de l'interaction entre l'activité physique et la grossesse sur les fonctions cognitives de la mère et de l'enfant. Une première étude démontre que la cognition de la femme enceinte diminue lors du troisième trimestre sans effet de condition physique. Une seconde étude présente les effets d'une séance d'activité physique sur plusieurs habiletés cognitives des femmes enceintes. On retrouve chez elles une diminution de la mémoire de travail et de la capacité d'attention soutenue alors qu'il n'y a pas d'effet chez la femme non enceinte. Enfin, une dernière étude présente l'impact de l'activité physique pratiquée tout au long de la grossesse sur le cerveau du nouveau-né. Cette étude démontre que les nouveau-nés de mères actives présentent des réponses neurophysiologiques plus matures que les enfants de mères sédentaires. L'ensemble de ces résultats démontre que la grossesse entraine des déficits cognitifs. De plus, les fonctions cognitives de la femme enceinte seront réduites à la suite d'une séance d'activité physique. Il serait donc préférable pour elle de ne pas prévoir son activité physique avant une activité qui nécessite ses capacités cognitives. Elle devrait tout de même effectuer de l'activité physique tout au long de sa grossesse afin d'offrir le meilleur départ possible dans la vie à son enfant.

Characterization of microalgae native to Quebec for biofuel production.

La production de biodiésel par des microalgues est intéressante à plusieurs niveaux. Dans le premier chapitre, un éventail de pour et contres concernant l’utilisation de microalgues pour la production de biocarburant sont ici révisés. La culture d’algues peut s'effectuer en utilisant des terres non-arables, de l’eau non-potable et des nutriments de base. De plus, la biomasse produite par les algues est considérablement plus importante que celle de plantes vasculaires. Plusieurs espèces on le contenu lipidique en forme de triacylglycérols (TAGs), qui peut correspondre jusqu'à 30% - 40% du poids sec de la biomasse. Ces proportions sont considérablement plus élevées que celui des huiles contenues dans les graines actuellement utilisées pour le biodiésel de première génération. Par contre, une production pratique et peu couteuse de biocarburant par des microalgues requiert de surpasser plusieurs obstacles. Ceci inclut le développement de systèmes de culture efficace à faible coût, de techniques de récupération requérant peu d’énergie, et de méthodes d’extraction et de conversion de l’huile non-dommageables pour l’environnement et peu couteuses. Le deuxième chapitre explore l'une des questions importantes soulevées dans le premier chapitre: la sélection d'une souche pour la culture. Une collection de souches de microalgues d'eau douce indigène au Québec a été établi et examiné au niveau de la diversité physiologique. Cette collection est composée de cent souches, que apparaissaient très hétérogènes en terme de croissance lorsque mises en culture à 10±2 °C ou 22±2 °C sur un effluent secondaire d’une usine municipale de traitement des eaux usées (EU), défini comme milieu Bold's Basal Medium (BBM). Des diagrammes de dispersion ont été utilisés pour étudier la diversité physiologique au sein de la collection, montrant plusieurs résultats intéressants. Il y avait une dispersion appréciable dans les taux de croissance selon les différents types de milieux et indépendamment de la température. De manière intéressante, en considérant que tous les isolats avaient initialement été enrichis sur milieu BBM, la distribution était plutôt symétrique autour de la ligne d’iso-croissance, suggérant que l’enrichissement sur BBM n’a pas semblé biaiser la croissance des souches sur ce milieu par rapport aux EU. Également, considérant que les isolats avaient d’abord été enrichis à 22°C, il est assez surprenant que la distribution de taux de croissance spécifiques soit aussi symétrique autour de la ligne d’iso-croissance, avec grossièrement des nombres égaux d’isolats de part et d’autre. Ainsi, l’enrichissement à 22°C ne semble pas biaiser les cellules vers une croissance à cette température plutôt que vers 10°C. Les diagrammes de dispersion obtenus lorsque le pourcentage en lipides de cultures sur BBM ont été comparées à des cultures ayant poussé sur EU soit à 10°C ou 22°C rendent évident que la production de lipides est favorisée par la culture sur EU aux deux températures, et que la production lipidique ne semble pas particulièrement plus favorisée par l’une ou l’autre de ces températures. Lorsque la collection a été examinée pour y déceler des différences avec le site d’échantillonnage, une analyse statistique a montré grossièrement que le même degré de diversité physiologique était retrouvé dans les échantillons des deux différents sites. Le troisième chapitre a poursuivi l'évaluation de la culture d'algues au Québec. L’utilisation de déchets industriels riches en nutriments minéraux et en sources de carbone pour augmenter la biomasse finale en microalgues et le produit lipidique à faible coût est une stratégie importante pour rendre viable la technologie des biocarburants par les algues. Par l’utilisation de souches de la collection de microalgues de l’Université de Montréal, ce rapport montre pour la première fois que des souches de microalgues peuvent pousser en présence de xylose, la source de carbone majoritairement retrouvée dans les eaux usées provenant des usines de pâte et papier, avec une hausse du taux de croissance de 2,8 fois par rapport à la croissance photoautotrophe, atteignant jusqu’à µ=1,1/jour. En présence de glycérol, les taux de croissance atteignaient des valeurs aussi élevées que µ=1,52/jour. La production lipidique augmentait jusqu’à 370% en présence de glycérol et 180% avec le xylose pour la souche LB1H10, démontrant que cette souche est appropriée pour le développement ultérieur de biocarburants en culture mixotrophe. L'ajout de xylose en cultures d'algues a montré certains effets inattendus. Le quatrième chapitre de ce travail a porté à comprendre ces effets sur la croissance des microalgues et la production de lipides. Quatre souches sauvages indigènes ont été obersvées quotidiennement, avant et après l’ajout de xylose, par cytométrie en flux. Avec quelques souches de Chlorella, l’ajout de xylose induisait une hausse rapide de l’accumulation de lipide (jusqu’à 3,3 fois) pendant les premières six à douze heures. Aux temps subséquents, les cellules montraient une diminution du contenu en chlorophylle, de leur taille et de leur nombre. Par contre, l’unique membre de la famille des Scenedesmaceae avait la capacité de profiter de la présence de cette source de carbone sous culture mixotrophe ou hétérotrophe sans effet négatif apparent. Ces résultats suggèrent que le xylose puisse être utilisé avant la récolte afin de stimuler l’augmentation du contenu lipidique de la culture d’algues, soit en système de culture continu ou à deux étapes, permettant la biorestauration des eaux usées provenant de l’industrie des pâtes et papiers. Le cinquième chapitre aborde une autre déché industriel important: le dioxyde de carbone et les gaz à effet de serre. Plus de la moitié du dioxyde de carbone qui est émis dans l'atmosphère chaque jour est dégagé par un processus stationnaire, soit pour la production d’électricité ou pour la fabrication industrielle. La libération de CO2 par ces sources pourrait être atténuée grâce à la biorestauration avec microalgues, une matière première putative pour les biocarburants. Néanmoins, toutes les cheminées dégagent un gaz différent, et la sélection des souches d'algues est vitale. Ainsi, ce travail propose l'utilisation d’un état de site particulier pour la bioprospection de souches d'algues pour être utilisé dans le processus de biorestauration. Les résultats montrent que l'utilisation d'un processus d'enrichissement simple lors de l'étape d'isolement peut sélectionner des souches qui étaient en moyenne 43,2% mieux performantes dans la production de biomasse que les souches isolées par des méthodes traditionnelles. Les souches isolées dans ce travail étaient capables d'assimiler le dioxyde de carbone à un taux supérieur à la moyenne, comparées à des résultats récents de la littérature.