Comportamiento de los residuos de clorpirifos en uvas y vinos

La tesis demuestra la degradación del insecticida clorpirifos con el transcurso del tiempo, en viñedos tratados con el plaguicida. También se detemina la presencia, o no del insecticida en los vinos elaborados con uvas con residuos de clorpirifos.

Curva de degradación a campo de clorpirifos en cultivo de tomate y su persistencia luego del lavado y pelado doméstico

Las normativas legales sobre residuos de plaguicidas son cada vez más exigentes a nivel mundial. Con frecuencia hay una reducción significativa en el Límite Máximo de Residuos (LMR) y en casos severos la prohibición de su uso. La estrategia de control fitosanitario debe tener en cuenta los niveles de residuos que quedan en la fruta que llega al consumidor y la cinética de disipación que disminuye los riesgos toxicológicos y comerciales. El clorpirifos es un insecticida organofosforado, liposoluble, cuyo modo de acción es por contacto, ingestión o inhalación. Es utilizado por la mayoría de los productores, para el control de diversas plagas debido a que es económico y efectivo. En cultivos de tomate es utilizado para controlar a Tuta absoluta la “polilla del tomate", debido a su importancia en relación a los daños ocasionados en el cultivo (CITEF, 1977) y a Bemisia tabaci la “mosca blanca", por su incidencia durante todo el año y su agresividad como plaga de los cultivos hortícolas especialmente solanáceas, obliga a realizar una gran cantidad de pulverizaciones para mantenerla por debajo de los umbrales de daño económico. Tiene una amplia distribución y un gran impacto en los cinturones hortícolas de casi todo el país (SYNGENTA, 2011). Dicho plaguicida es muy tóxico o moderadamente tóxico para aves y humanos, según las formulaciones disponibles en el mercado, muy tóxico para abejas y extremadamente tóxico para peces (CASAFE, 2011). La legislación argentina establece un LMR de 0.5 mg/Kg. para fruto de tomate entero y un periodo de carencia (plazo de seguridad entre última aplicación y cosecha del producto) de 21 días (SENASA, 2010). La finalidad del trabajo es ofrecer al sector agrícola información sólida que le permita predecir la concentración de clorpirifos desde el momento de la aplicación y así evitar excesos de residuos en los frutos para consumo o comercialización.

Períodos críticos de protección contra Spodoptera frugiperda (J.E. smith) (Lepidoptera: noctuidae) para producción de chilote en maíz (Zea mays) de riego y primera

Este estudio fue realizado con el objetivo de determinar el periodo critico para el control de spodoptera fruiperda en la producción de chilotes tanto en época de riego como de primera. Para su realización se usó carboofurán al momento de la siembra (30 lbs/mz) y clorpirifos en dósis de 0.5 lts/mz, estableciéndose 8 períodos de protección para s. frugiperda que van desde 0 hasta 50 días después de la emergencia (DDE), tiempo en el cual la planta de maíz es suceptible al ataque de cogollero. Los resultados indican que las aplicaciones de cabofurán no ejercen control sobre corgollero en las 2 épocas de siembra. En primera, cuando las infestaciones son menores del 45% de corgollos infestados, las aplicaciones de clorpirifos resultan innecesarias. en época de Riego 1 aplicación de clorpirifos después de los 20 DDE es suficiente para obtener los rendimientos máximos. Esta aseveración es fundamentada en el análisis económico el que demuestra que los 5 diferentes tratamientos (0-50, 20-40, 20-50 y 10-40 días de protección) ejercen igual control y no existe diferencia estadística entre ellos en relación a la ganancia neta.

Insecticides evaluated for control of fall armyworm (Lepidóptera: Noctuidae) on Sorghum)

El gusano cogollero [Spodoptera fnugiperda (J.E. Smith) (lnsecta: Lepidoptera: Noctuidae)], es uno de los principales insectos que afectan el cultivo de sorgo en El Salvador. En vista de lo anterior, durante los meses de septiembre de 2001 y enero de 2002, se realizó una investigación en la estación experimental dos del Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA), ubicado en el valle de San Andrés, departamento de La Libertad. El objetivo de la investigación fue determinar la efectividad de productos químicos, botánicos y biológicos para el control del gusano cogollero. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, con nueve tratamientos y cuatro repeticiones. Los tratamientos fueron: insecticida botánico (Agrolnagor), Aceite de Nim, Beauveria bassiana, Virus de la Poliedrosis Nuclear (VPN), Lufenuron, Teflubanzuron, Agua azucarada, testigo relativo ( clorpirifos) y testigo absoluto (sin aplicación). Los datos de mortalidad se obtuvieron 24 horas y cuatro días después de las aplicaciones. Los resultados muestran diferencias significativas entre tratamientos en los porcentajes de mortalidad de la plaga. Los insecticidas inhibidores de la quitina, lufeneron y tetlubenzuron, mostraron mayor efectividad (superior al 90 por ciento) comparados con los otros tratamientos insecticidas, los cuales mostraron niveles de mortalidad interior al 65 por ciento cuatro días después de su aplicación. El porcentaje de mortalidad obtenido en parcelas tratadas con chlorpyrifos fue de 63.3 por ciento durante el primer muestreo. La mortalidad fue superior en larvas de los primeros estadios, comparada con larvas de los últimos estadios. Los tratamientos con Neem, productos biológicos (Beauveria bassiana y el virus de la poliedrosis nuclear) y agua azucarada presentaron los más bajos niveles de mortalidad. Hubo diferencias significativas en el rendimiento del cultivo, sin embargo, dichas diferencias no siempre estuvieron relacionadas a los niveles de mortalidad presentados por los tratamientos insecticidas.

Application of insecticide in various volumes of waterat stages of Sorghum development for control of fall armyworm (Lepidóptera: Noctuidae)

Una debilidad en las aplicaciones de insecticidas para el control de plagas del sorgo, es el desconocimiento existente acerca del efecto de los volúmenes de agua sobre la efectividad del producto químico aplicado. El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de diferentes volúmenes de agua aplicados en diferentes etapas fonológicas del cultivo sobre la efectividad de clorpirifos sobre el gusano cogollero (Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (lnsecta: Lepidoptera: Noctuidae)) . El ensayo se estableció el 20 de Septiembre de 2001, en terrenos de la es~ación experimental numero 2 del Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA), ubicado en SanAndrés, departamento de la Libertad, El Salvador .. Se efectuaron aplicaciones de chlorpyrifos en dosis de ~ .4 1 ha·, utilizando 285 y ~42 litros de agua, aplicado en dos etapas de crecimiento del cultivo de sorgo (25 y 45 días después de siembra). Los tratamientos incluyeron una aplicación a un determinado volumen y tiempo (25 días después de siembra), y dos a aplicaciones a determinados volúmenes y tiempo, una a los 25 y otra a los 45 días después de siembra. La aplicación de Chlorpyrifos redujo de significativamente la intestación de larvas a las 24 horas después de la primera aplicación, cuando se le compara con el tratamiento control. Sin embargo, no se determinaron diferencias significativas en la eficacia del insecticida, cuando se comparó la infestación de larvas en parcelas tratadas con diferentes cantidades de agua. El volumen mayor de agua pareciera que mejora la distribución del producto qufmico sobre la planta, lo que conduce a una mayor mortalidad de larvas. Una segunda aplicación de insecticida, 20 días después de la primera aplicación, redujo significativamente la infestación de larvas comparada con una sola aplicación. Esta información indica que el incremento en los volúmenes de agua mejora la eficacia del insecticida Chlorpyrifos contra el gusano cogollero en el cultivo de sorgo. Una segunda aplicación del tratamiento insecticida es efectiva contra relnfestaciones de larvas y sugiere que el cogollero que se alimenta de estructuras vegetativas del sorgo, en los ntveles encontrados en este estudio en el Salvador, puede reducir la producción de grano del sorgo.

Frequency of insecticide spray application for control of fall armyworm (Lepidóptera: Noctuidae) on sorghum

Existe desconocimiento del efecto de frecuencias de aplicación de los insecticidas sobre el comportamiento de las poblaciones del gu· sano cogollero ( Spodoptera frugipercta) y la repercusión de estas en los rendimientos del sorgo granifero (Sorghum bicolor l. Moench). El estudio se realizó en la Estación Experimental dos del Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA), ubicado en San Andrés, departamento de La Libertad, El Salvador, durante los meses de septiembre del año 2001 y enero de 2002. El objetivo de la investigación fue determinar el efecto del numero de aplicaciones de clorpirifos sobre las poblaciones de larvas de gusano cogollero en el cultivo del sorgo. Para este ensayo se estableció un diseño de bloques al azar con cinco tratamientos y cuatro repeticiones. Se realizaron aplicaciones de Chlorpyrifos en el cultivo del sorgo, en dosis de 1.4 1 ha·1, en 285 1 de agua durante cuatro fechas (4 estados de desarrollo de la planta), específicamente a los 15, 25, 35 y 45 días después de la siembra. Las parcelas contratamientos recibieron 1 , 2, 3 y 4 aplicaciones de insecticidas y fueron comparadas con una parcela sin aplicación. Cada tratamiento insecticida inicialmente tuvo reducciones significativas en las poblaciones de cogollero, comparados con la parcela sin aplicación. Tratamientos con cada aplicación adicional tuvo reducciones significativas en las poblaciones de larvas vivas, comparados con tratamientos que tuvieron menor numero de aplicaciones. El cogollero, tuvo reinfestaciones, en las parcelas que recibieron ya sea una, dos o tres aplicaciones de insecticidas, durante el periodo de observación después de cada uno de los tres tratamientos. Estos resultados muestran las reinfecciones de las poblaciones de cogollero después de las aplicaciones de insecticidas, y la carencia de efecto residual de los mismos. A pesar de que no se determinaron diferencias significativas en el rendimiento de grano, las diferencias numéricas oscilaron desde 555 a 1 674 kg ha·1 mas allá del rendimiento observado en el tratamiento sin aplicación, lo cual sugiere que el manejo efectivo del daño ocasionado por el cogollero en el cultivo de sorgo, puede resultar en mejora de los rendimientos.

Lacertid lizards as bioindicators of agricultural contamination

Apesar do recente aumento no número de estudos, os lagartos persistem como um dos grupos menos estudados em ecotoxicologia e o desconhecimento em relação à sua resposta à contaminação ambiental é enorme. A nível europeu, os lacertídeos têm sido identificados como potenciais espécies modelo para a ecotoxicologia com répteis. O principal objectivo deste projecto era determinar se um lacertídeo abundante pertencente ao género Podarcis, podia ser utilizado como bioindicador de exposição e toxicidade em zonas agrícolas. Para atingir este objectivo, utilizámos uma estratégia integrada com três fases. Numa primeira fase realizou-se um estudo de campo para documentar o tipo de exposição e parâmetros populacionais de populações de lacertídeos que ocorrem em zonas de uso intenso de pesticidas e zonas de agricultura orgânica. A segunda fase consistiu num estudo de mesocosmo em que se expuseram juvenis a um conjunto de pesticidas em condições controladas durante um período de um ano. Finalmente, a terceira fase incluiu um estudo laboratorial sobre os efeitos do clorpirifos, um dos insecticidas mais utilizado a nível global, em lagartixas. No término de cada um dos estudos, analisaram-se diversos biomarcadores e parâmetros de exposição e toxicidade a pesticidas nos diferentes indivíduos. Este conjunto abrangente de parâmetros foi analisado em diferentes níveis de organização biológica, incluindo parâmetros populacionais, bem como comportamentais, fisiológicos, bioquímicos e histológicos. Em geral, detectaram-se poucas diferenças estatísticas significativas entre as populações dos campos expostos a pesticidas e populações referência. Confirmando a dificuldade que existe em isolar os efeitos de diferentes contaminantes sobre as populações de outros factores locais, ciclos sazonais ou eventos estocásticos. As populações de P. bocagei parecem ser capazes de lidar com o nível observado de exposição a pesticidas. No entanto, indivíduos que vivem em locais expostos a pesticidas parecem estar menos adaptados ecologicamente do que aqueles que vivem em locais referência, apresentando um estado de depleção nutricional e sinais de stress metabólico. Os resultados obtidos com os animais da experiência de mesocosmo parecem reforçar estes resultados. Os animais prosperaram relativamente bem em todos os mesocosmos, independentemente do tratamento ou não com pesticidas, apresentando uma ampla gama de comportamentos naturais. A abordagem laboratorial confirmou P. bocagei como um valioso indicador de exposição sub-letal a doses ambientalmente realistas de clorpirifos. De acordo, com o conjunto d resultados obtidos, P. bocagei parece ser um bioindicador adequado de exposição a pesticidas.

Single and joint effects of natural and chemical stressors to the terrestrial isopod Porcellionides pruinosus

Environmental contamination and climate changes constitute two of the most serious problems affecting soil ecosystems in agricultural fields. Agriculture is nowadays a highly optimized process that strongly relies on the application of multiple pesticides to reduce losses and increase yield production. Although constituting, per se, a serious problem to soil biota, pesticide mixtures can assume an even higher relevance in a context of unfavourable environmental conditions. Surprisingly, frameworks currently established for environmental risk assessments keep not considering environmental stressors, such as temperature, soil moisture or UV radiation, as factors liable to influence the susceptibility of organisms to pesticides, or pesticide mixtures, which is raising increasing apprehension regarding their adequacy to actually estimate the risks posed by these compounds to the environment. Albeit the higher attention received on the last few years, the influence of environmental stressors on the behaviour and toxicity of chemical mixtures remains still poorly understood. Aiming to contribute for this discussion, the main goal of the present thesis was to evaluate the single and joint effects of natural stressors and pesticides to the terrestrial isopod Porcellionides pruinosus. The first approach consisted on evaluating the effects of several abiotic factors (temperature, soil moisture and UV radiation) on the performance of P. pruinosus using several endpoints: survival, feeding parameters, locomotor activity and avoidance behaviour. Results showed that these stressors might indeed affect P. pruinosus at relevant environmental conditions, thus suggesting the relevance of their consideration in ecotoxicological assays. At next, a multiple biomarker approach was used to have a closer insight into the pathways of damage of UV radiation and a broad spectrum of processes showed to be involved (i.e. oxidative stress, neurotoxicity, energy). Furthermore, UV effects showed to vary with the environment medium and growth-stage. A similar biomarker approach was employed to assess the single and joint effects of the pesticides chlorpyrifos and mancozeb to P. pruinosus. Energy-related biomarkers showed to be the most differentiating parameters since age-classes seemed to respond differently to contamination stress and to have different metabolic costs associated. Finally, the influence of temperature and soil moisture on the toxicity of pesticide mixtures was evaluated using survival and feeding parameters as endpoints. Pesticide-induced mortality was found to be oppositely affected by temperature, either in single or mixture treatments. Whereas chlorpyrifos acute toxicity was raised under higher temperatures the toxicity of mancozeb was more prominent at lower temperatures. By the opposite, soil moisture showed no effects on the pesticide-induced mortality of isopods. Contrary to survival, both temperature and soil moisture showed to interact with pesticides to influence isopods’ feeding parameters. Nonetheless, was however the most common pattern. In brief, findings reported on this thesis demonstrated why the negligence of natural stressors, or multiple stressors in general, is not a good solution for risk assessment frameworks.

Dinâmica populacional de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) em bovinos mestiços mantidos em pastagens de Brachiaria decumbens no município de Formiga, Minas Gerais

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Cochinilla negra del olivo : control mediante insecticidas

El objetivo del presente trabajo fue comparar la eficiencia de 4 pesticidas: dimetoato, metidation, etion y clorpirifos, en el control de la cochinilla H [Saissetia oleae Bernard (Homoptera, Coccoidea, Lecaniidae)] también llamada cochinilla negra del olivo. Estos productos, conocidos en Mendoza (Argentina), se utilizan localmente. El ensayo se realizó en Vistalba (Luján de Cuyo). Para la evaluación se tuvo en cuenta el porcentaje de mortalidad. El análisis estadístico se efectuó transformando los datos según arcsen ( x / 1 0 0 ) .

Eficiencia de control de "orugas defoliadoras" en soja (Glycine max L.), con insecticidas neurotóxicos y reguladores del crecimiento de los insectos

Las "orugas defoliadoras" afectan la producción del cultivo de soja, sobre todo en años secos y con altas temperaturas que favorecen su desarrollo. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la eficiencia de control de insecticidas neurotóxicos e IGRs sobre "orugas defoliadoras" en soja. Se realizaron ensayos en lotes comerciales en tres localidades de la provincia de Córdoba en las campañas agrícolas 2008/09 y 2009/10, bajo un diseño de bloques al azar, con seis tratamientos y tres repeticiones. Los tratamientos fueron: T1: Clorpirifos (384 g p.a.ha-1), T2: Cipermetrina (37,5 g p.a.ha-1), T3: Lufenuron+Profenofos (15 + 150 g p.a.ha-1), T4: Metoxifenocide (28,8 g p.a.ha-1), T5: Novaluron (10 g p.a.ha-1) y T6: Testigo. El tamaño de las parcelas fue de 12 surcos de 10 m de largo distanciados a 0,52 m. La aplicación se realizó con una mochila provista de boquillas de cono hueco (40 gotas.cm-2), cuando la plaga alcanzó el umbral de daño económico. En cada parcela se tomaron cinco muestras a los 0, 2, 7 y 14 días después de la aplicación (DDA) utilizando el paño vertical, identificando y cuantificando las orugas vivas mayores a 1,5 cm. A los 14 DDA se extrajeron 30 folíolos por parcela (estrato medio y superior de la planta) y se determinó el porcentaje de defoliación utilizando el software WinFolia Reg. 2004. Se estimó el rendimiento sobre 5 muestras de 1 m2 en cada parcela y se realizó ANOVA y test de comparación de medias LSD de Fisher. El Clorpirifos mostró el mayor poder de volteo y el Metoxifenocide la mayor eficiencia a los 7 DDA. En general los IGRs mostraron mayor poder residual.

Bases moleculares de la resistencia a insecticidas en la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis Capitata (Wiedemann)

La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada una de las plagas clave para la fruticultura. El malatión es un insecticida organofosforado que fue empleado mayoritariamente en España para el control de C. capitata hasta 2009, año en el que dejó de utilizarse por no estar incluido en el anexo I de la Directiva Europea 91/414/ECC. El incremento del uso del malatión, debido a las graves pérdidas económicas causadas por C. capitata, provocó la aparición de poblaciones de campo resistentes. El estudio de una población resistente a malatión, recogida en Castelló en 2004, permitió la identificación de dos mecanismos de resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE) y un mecanismo de resistencia metabólica, probablemente mediado por carboxilesterasas. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos estudiar los mecanismos implicados en la resistencia a malatión en C. capitata. Además, durante el desarrollo de esta Tesis, el malatión fue sustituido por otros insecticidas como el espinosad y la lambda-cialotrina para el control de la plaga. En este nuevo contexto, es extremadamente importante analizar la susceptibilidad de poblaciones de campo frente a espinosad y estudiar la posible existencia de resistencia cruzada a estos insecticidas, así como sentar las bases para el estudio de futuros mecanismos de resistencia. En primer lugar, analizamos mediante bioensayos con dosis discriminante la susceptibilidad a malatión y espinosad en doce poblaciones de C. capitata de Andalucía, Aragón, Cataluña, Comunidad Valenciana e Islas Baleares; y nuestros resultados sugirieron la presencia de individuos resistentes a malatión en la mayoría de las poblaciones analizadas. En el caso del espinosad, observamos que la susceptibilidad a este insecticida de origen biológico fue elevada en la mayoría de las poblaciones, sin embargo, la población recogida en Xàbia (Alicante) mostró un nivel de susceptibilidad unas dos veces menor al resto de poblaciones. Mediante la selección en laboratorio, obtuvimos dos líneas resistentes a malatión, W-4Km y W-10Km, con unos niveles de resistencia con respeto a la línea susceptible C de 178 y 400 veces, respectivamente. Además, se seleccionó por primera vez en C. capitata una línea altamente resistente a espinosad (Xàbia-W-100s), que actualmente es unas 500 veces más resistente que la línea de laboratorio C. Con el objetivo de escoger la estrategia más adecuada para el manejo de la plaga, estudiamos la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en la línea resistente a malatión W- 4Km. En esta línea detectamos resistencia cruzada moderada a los organofosforados fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos (de 7 a 16 veces) y frente al carbamato carbaril, al piretroide lambda-cialotrina y al quimioesterilizante lufenurón (de 4 a 6 veces). Por otra parte, la resistencia cruzada frente a espinosad fue baja (1,5 veces). Es importante destacar que los niveles de resistencia estimados frente a todos los insecticidas fueron de uno o dos órdenes de magnitud inferiores al observado en la línea W-4Km frente a malatión (178 veces), hecho que podría deberse, al menos, a dos posibles hipótesis: que la mutación AChE G328A confiera mayor insensibilidad al malaoxón (forma activa del malatión) que a otros insecticidas que tienen como diana la AChE y/o, en segundo lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por carboxilesterasas hidrolice el malatión de manera más eficiente que los otros insecticidas analizados. En el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata, por un lado, analizamos la diversidad de enzimas citocromo P450, asociadas con resistencia metabólica en otras especies, y por otro lado, desarrollamos un sistema para la detección de nuevas mutaciones puntuales que pudiesen aparecer en los genes que codifican la AChE (Ccace2) y la aliesterasa (Ccae7). Mediante el empleo de cebadores degenerados obtuvimos 37 genes CYP, que codifican enzimas P450, pertenecientes a cinco familias. Posteriormente, en un estudio de inducción con fenobarbital, observamos que la expresión de cuatro de los seis genes analizados era susceptible de ser inducida. Por otro lado, se puso a punto un sistema que permite amplificar y secuenciar, a partir de DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en los que se han encontrado mutaciones relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies. Los resultados obtenidos facilitarán el estudio de nuevos mecanismos de resistencia mediados por estas enzimas en C. capitata. Se diseñó un método PCR-RFLP para identificar los individuos portadores de la mutación AChE G328A (alelo de resistencia Ccace2R) sin la necesidad de realizar bioensayos y que, además, permite detectar resistencia cuando ésta se encuentra a baja frecuencia. Según el análisis realizado, el alelo Ccace2R se observó en 25 de las 27 localidades españolas muestreadas en el territorio español, incluyendo las Islas Baleares y Canarias. Sin embargo, este alelo no se detectó en poblaciones procedentes de once países y de cinco continentes. El análisis de la presencia del alelo Ccace2R en las líneas resistentes a malatión durante el proceso de selección en el laboratorio mostró una rápida disminución de los homocigotos, tanto para el alelo susceptible como para el alelo de resistencia, en favor de los individuos heterocigotos. Así, después de 52 generaciones de selección, se observó que la totalidad de los individuos analizados de la línea W-10Km presentaban un genotipo heterocigoto para la mutación AChE G328A. Este desequilibrio contradice la segregación mendeliana esperada para un gen con dos alelos pero podría ser explicado por la existencia de una duplicación del gen Ccace2. La demostración de la presencia de esta duplicación se realizó mediante: i) el cruzamiento de individuos heterocigotos de la línea W-10Km con homocigotos susceptibles de la línea C, que dio lugar a una descendencia en la que el 100% de los individuos eran heterocigotos; ii) la evaluación del número de copias del gen Ccace2 por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que resultó dos veces mayor en individuos de la línea W-10Km en comparación con los de la línea C; iii) el análisis del nivel de expresión de Ccace2, que fue el doble en la línea W-10Km con respecto a la línea C, y iv) el estudio de la actividad AChE, que resultó mayor en los individuos de la línea W-10Km. Según los resultados obtenidos, una duplicación del gen Ccace2 provoca la coexistencia en un mismo cromosoma del alelo silvestre y del alelo mutado y, además, las dos copias del gen Ccace2, al estar ligadas, producen una heterocigosis permanente (Ccace2RS). De esta manera se explica que el hecho de que 100% de los individuos de la línea W-10Km mostrasen un perfil de restricción correspondiente a un individuo heterocigoto ya que, en realidad, eran homocigotos estructurales para la duplicación (genotipo CCace2RS/RS). Se ha detectado un coste biológico asociado a la duplicación que consiste en un incremento en la mortalidad acumulada de los adultos a partir del séptimo día después de la emergencia. La descripción de la duplicación Ccace2RS supone la identificación de un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata. Finalmente, mediante el diseño de un método de doble PCR-RFLP se determinó la presencia de la duplicación Ccace2RS en la mayoría de las poblaciones españolas. La proporción de individuos portadores de la duplicación osciló entre el 5% y el 35%, observándose los mayores valores de frecuencia en las poblaciones de C. capitata recogidas en la cuenca mediterránea. Podemos por lo tanto concluir que la resistencia a malatión asociada a la mutación AChE G328A y a la duplicación Ccace2RS está ampliamente establecida en las poblaciones españolas de C. capitata. Nuestros resultados desaconsejan la utilización del malatión (si fuera de nuevo autorizado) o de otros organofosforados para el control de esta plaga. Además, una de las líneas resistentes a malatión mostró resistencia cruzada frente a insecticidas con diferentes modos de acción y que se utilizan actualmente para el control de C. capitata, tales como lambda-cialotrina y lufenurón. La alta susceptibilidad a espinosad observada en las poblaciones españolas, así como la reducida resistencia cruzada estimada para este insecticida, sugieren que su utilización es adecuada para el control de la plaga. Sin embargo, la utilización de un sólo insecticida puede entrañar riesgos por favorecer la selección de resistencia, de hecho, mediante selección en laboratorio se obtuvo una población altamente resistente a espinosad. Por tanto, es recomendable implementar programas de control integrado y de manejo de la resistencia en C. capitata utilizando distintos sistemas de control e insecticidas con diferentes mecanismos de acción que permitan su sostenibilidad en el tiempo. Los sistemas de detección de alelos de resistencia desarrollados en este trabajo permitirán la detección precoz de resistencia en campo, facilitando la decisión sobre el sistema de control más adecuado. Además, los conocimientos generados podrán contribuir al desarrollo de nuevos sistemas de detección para otros mecanismos de resistencia. Abstract. The Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824), is considered one of the most harmful pests in fruit crops. Until 2009, when malathion use was banned due to its not inclusion in the Annex I of Directive 91/414/EEC, the application of this organophosphate (OP) insecticide in Spain increased gradually due to the large economic losses caused by C. capitata. The increase in the frequency of treatments resulted in the development of resistant field populations. The study of a malathion-resistant population, collected in 2004 in Castelló (Comunidad Valenciana), allowed the identification of two resistance mechanisms: a single point mutation (G328A) in the target acetylcholinesterase (AChE), as well as a metabolic resistance mechanism, most likely carboxylesterase-mediated. Taking all the preceding into account, we studied the malathion resistance mechanisms in C. capitata. During the development of this PhD Thesis malathion use was banned by the European Union, being replaced by other insecticides, such as spinosad and lambda-cyhalotrin. Within this new working frame, the need to analyse the possible existence of cross-resistance to these insecticides and the susceptibility to spinosad in field populations was raised. This would define the baseline for future studies on resistance mechanisms. Firstly, through discriminant dose bioassays, we analysed malathion and spinosad susceptibility in twelve C. capitata populations from Andalucia, Aragon, Cataluña, C. Valenciana and the Baleares Islands. Our results suggest the presence of malathion-resistant individuals in most of the populations analysed. Regarding spinosad, we noticed a high susceptibility to this biologically derived insecticide in most of the populations, but in the one collected in Xabia (Alicante), which had a susceptibility level two times lower than the rest of populations. Through laboratory selection, we obtained two malathion-resistant strains, W-4Km and W-10Km, with resistance levels 178- and 400-fold, respectively, compared to the control susceptible C strain. Besides, a strain highly-resistant to spinosad (Xabia-W-100s), 500-times more resistant than control C strain, was selected. In order to decide the most appropriate management strategy for the pest, we studied the susceptibility to different insecticides in the malathion-resistant W-4Km strain. We detected a moderated cross-resistance to the OPs fenthion, diazinon, phosmet, trichlorphon and methylchlorpyrifos (7- to 16-fold), and to the carbamate carbaryl, the pyretroid lambda-cyhalotrin and the chemosterilizer lufenuron (4- to 6-fold). On the other hand, cross-resistance to spinosad was low (1.5-fold). It is important to note that resistance levels to all insecticides were one or two orders of magnitude less than that observed against malathion in W-4Km strain (178-fold), a fact that might be due to, at least, two possible causes: mutation AChE G328A may provide a higher insensitivity to malaoxon (the active form of malathion) than to other insecticides having AChE as target, and/or, secondly, the carboxylesterase-mediated resistance mechanism hydrolyzes malathion more efficiently than all other analysed insecticides. To investigate new resistance mechanisms in C. capitata we analysed the diversity of the cytochrome P450 enzymes, which have been associated to metabolic resistance in insects, and we developed a new method to detect single point mutations in acetylcholinesterase (Ccace2) and aliesterase (Ccae7) genes that could appear. Using degenerate primers we obtained 37 CYP genes, coding P450 enzymes, included in five families. Afterwards, in a phenobarbital-induction study, we observed that the expression of 4 out of the 6 analysed genes could be induced. On the other hand, a system was set up to amplify and to sequence from genomic DNA the exons of genes Ccace2 and Ccae7 where mutations related to insecticide resistance have been found in other species. The results obtained could facilitate the study of new resistance mechanisms in C. capitata mediated by these enzymes. A PCR-RFLP method was designed to detect the presence of the mutation AChE G328A (resistance allele Ccace2R), with no need to perform bioassays and allowing detecting resistance at low frequency. According to the analysis, the resistance allele was found in 25 out of 27 sampled locations in Spain, including the Balearic and the Canary Islands. However, this allele was not detected in other populations collected in 11 countries from 5 continents. The follow-up of the presence of the allele Ccace2R in the malathion-resistant strains during the selection process in the laboratory showed a quick decrease in homozygous individuals, for both the susceptible and the resistant alleles, favouring heterozygous. Thus, after 52 generations of selection, all the individuals analysed from W-10Km strain showed a heterozygous genotype for mutation AChE G328A, contradicting mendelian segregation as expected for a gene with two alleles. Afterwards, we were able to demonstrate that this was caused by the presence of a duplication of the gene coding acetylcholinesterase by: i) crossing heterozygous individuals from W-10Km strain with susceptible homozygous from C strain, originating a F1 population in which 100% of individuals were heterozygous; ii) evaluating the number of copies of gen Ccace2 by quantitative PCR in real time (qPCR), that happened to be twice higher in individuals from W-10Km VII strain when compared with C strain; iii) analysing the level of expression of Ccace2, twice in W- 10Km strain when compared to C strain; iv) studying the acetylcholinesterase activity, that was higher in individuals from W-10Km strain. According to these results, duplication of gen Ccace2 originates the coexistence of the susceptible and the resistant allele in the same chromosome. The two linked copies of the gene Ccace2 provoke the existence of permanent heterozygosis (Ccace2RS). This explains why the 100% of individuals from W-10Km strain showed an heterozygous restriction pattern since, in fact, they were structural homozygotes for the duplication (genotype Ccace2RS/RS). A biological cost has been detected associated to this duplication, consisting in a rise in accumulated adult mortality from the seventh day after emergence. The Ccace2RS duplication described in this study represents a new resistance mechanism to malathion in C. capitata. Finally, by the design of a double PCR-RFLP method, the presence of Ccace2RS duplication was confirmed in most of the Spanish populations. We observed that the proportion of individuals carrying the duplication oscillated between 5 and 35%, the frequency being higher in those C. capitata populations collected in the area of the Mediterranean basin. Therefore, we can conclude that malathion resistance associated to mutation AChE G328A and to Ccace2RS duplication are widely distributed in Spanish populations of C. capitata. Our results advice against the use of malathion (if it came to be newly authorized for use) or other OPs for the control of this pest. Besides, one of the malathion-resistant strains showed cross-resistance against insecticides with diverse action modes that are currently used for pest control, such as lambdacyhalotrin and lufenuron. High susceptibility to spinosad in the Spanish populations, as well as the reduced cross-resistance estimated for this insecticide suggests its adequacy for Medfly control. However, the use of a single insecticide is a risky strategy since it favours the selection of resistance. In fact, a population highly resistant to spinosad was obtained through laboratory selection. Therefore, it is advisable to implement integrated pest management (IPM) and resistance management programs for C. capitata control. Using insecticides with different modes of action and diverse control systems would contribute to the sustainability of the pest control. The resistance allele detection systems developed through this work will allow the early detection of resistance in the field, making possible the selection of the most appropriate method for pest control. Besides, the generated knowledge may also contribute to the development of new detection systems for other resistance mechanisms.

Efectividad de los garrapaticidas (piretroides, amidinas, organofosforados) in vitro bajo las condiciones ambientales de la finca experimental "Las Mercedes", municipio de Managua durante junio – septiembre 2015

La presente investigación se realizó con la finalidad de constatar la efectividad de los ixodicidas pertenecientes a la familia de los organofosforados (Clorpirifos), Amidinas (Amitraz) y Piretroides (Cipermetrina) de uso en bovinos para controlar las infestaciones por garrapatas del género Boophilus spp , utilizando la dosis recomendada por el laboratorio productor, a través de la técnica conocida como Prueba de Inmersión de hembras adultas (PIA) , para la cual se tomaron muestras de garrapatas de la fi nca experimental de la Universidad Nacional Agraria ``Las Mercedes`` , ubicada en el municipio de Managua. Se muestrearon bovinos al azar, recolectando 50 garrapatas hembras repletas para cada ixodicida evaluado, pa ra un total de 150 garrapatas, las cuales se seleccionaron y pesaron en una balanza analítica (g) para ser sumergidas durante 1 minuto en los ixodicidas mencionados anteriormente. Quince días después se recolectaron los huevos de las garrapatas para su pesaje. Esta prueba fue realizada manera in vitro . Los datos se recolectaron en una base de datos, utilizando una hoja electrónica (Microsoft Excel), para luego realizar un análisis estadístico descriptivo. Se calculó el coeficiente de Correlación de Pearson para conocer los niveles de significancia de las variables peso hembra y peso de huevos , el cual manifestó que ninguno de estos datos son determinantes para comprobar la efectividad del ixodicida . Para evaluar el comportamiento de las medias por variable y su significancia se utilizó la prueba de rangos múltiples de Tukey , en donde El ixodicida con mayor significancia para este estudio fue el clorpirifos, con respecto a los otros dos ixodicidas (Cipermetrina y Amitraz) . Los resultados obtenidos a través de la prueba de inmersión de hembras adultas , demuestran que hay un mayor porcentaje en la inhibición de la ovoposición de las garrapatas tratadas con clorpirifos (57%), mientras que la Cipermetrina alcanzo el 16% y el Amitraz obtuvo 2% respectivamente. Sin embargo, ninguno de los tres ixodicidas ev aluados demostró una efectividad para inhibir la ovoposición del 80%, para poder decir que son realmente eficaces .