Detection of dsRNA from Cleistothecia and Conidia of the Grape Powdery Mildew Pathogen, Uncinula Necator

Double-stranded RNA species ranging in molecular weight from 0.95 to 6.3 × 106 were detected in grapevines in New York. We recently showed that two of the species (Mr = 5.3 and 4.4 × 106) are associated with rupestris stem pitting disease. In this report, we show that the other eight detectable dsRNA species are associated with the powdery mildew fungus, Uncinula necator. These dsRNAs associated with the powdery mildew fungus were previously detected in leaves and epidermal stem tissue of grapevines infected with powdery mildew. The same dsRNA species were also detected from extracts of isolated cleistothecia and conidia of U. necator devoid of plant tissue. Isometric and rigid rodlike particles were observed in single cleistothecia preparations when examined under transmission electron microscopy.

Potential misidentification of in situ archaeological tool-residues: starch and conidia

Microscopic identification of organic residues in situ on the surface of archaeological artefacts is an established procedure. Where soil components morphologically similar to use-residue types exist within the soil, however, there remains the possibility that these components may be misidentified as authentic residues. The present study investigates common soil components known as conidia, fungal spores which may be mistaken for starch grains. Conidia may exhibit the rotating extinction cross under cross-polarised light commonly diagnostic of starch, and may be morphologically indistinguishable from small starch grains, particularly at the limits of microscope resolution. Conidia were observed on stone and ceramic archaeological artefacts from Honduras, Palau and New Caledonia, as well as experimental artefacts from Papua New Guinea. The findings act as a caution that in situ analysis of residues, and especially of those less than 5 mu m in size, may be subject to misidentification. (c) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Saturated salt solutions for humidity control and the survival of dry powder and oil formulations of Beauveria bassiana conidia

Oil-based formulated conidia sprayed on steel plates and conidia powder (control) of Beauveria bassiana isolate IMI 386243 were stored at temperatures from 10 to 40 degrees C in desiccators over saturated salt solutions providing relative humidities from 32 to 88%, or in hermetic storage at 40 degrees C, and moisture contents in equilibrium with 33 or 77% relative humidity. The negative semi-logarithmic relation (P < 0.005) between conidia longevity (at 40 degrees C) and equilibrium relative humidity did not differ (P > 0.25) between formulated conidia and conidia powder. Despite this, certain saturated salts provided consistently greater longevity (NaCl) and others consistently shorter longevity (KCl) for formulated conidia compared to conidia powder. These results, analysis of previous data, and comparison with hermetic storage, indicate that storage of conidia over saturated salt solutions provides inconsistent responses to environment and so may be problematic for bio-pesticide research. In hermetic storage, oil formulation was not deleterious to longevity and in the more moist environment enhanced survival periods. (c) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Infection, colonisation and sporulation by Pseudocercospora macadamiae on macadamia fruit

The structures and manner with which Pseudocercospora macadamiae penetrates, colonises and proliferates from the pericarp of macadamia fruit was studied using scanning electron microscopy and fluorescence light microscopy. Germ tubes arising from conidia penetrated open stomata within 20 h of inoculation, without observation of specialised infection structures such as appressoria. Colonisation of the pericarp was intercellular, without observation of specialised intracellular infection structures such as haustoria, and was complete from the epidermis to the mesocarp. The fungus proliferated at the epidermis by the formation of conidiophores and conidia on substomatal and protuberant subepidermal stromata. These structures were not observed on the mesocarp surface. The onset of visual husk spot symptoms coincided with an increase in pathogen biomass on the pericarp surface. The progression of symptoms from tan-coloured spots to larger red-brown lesions coincided with the production of conidiophores from substomatal and protuberant subepidermal stromata. The darker the colour of the husk spot lesion, the more frequently protuberant subepidermal stromata were observed. These findings are discussed in the context of observation of other cercosporoid fungi.

Germination and mycelial growth of Bipolaris euphorbiae Muchovej & Carvalho as influenced by herbicides and surfactants

Bipolaris euphorbiae Muchovej & Carvalho é um forte candidato para o controle de Euphorbia heterophylla L. (amendoim bravo). Este fungo pode ser aplicado em combinação com herbicidas para controlar um maior espectro de espécies daninhas. Para tanto, experimentos laboratoriais foram realizados para verificar a possibilidade da utilização de mistura de tanque de esporos de B. euphorbiae e herbicidas ou surfatantes recomendados para a cultura da soja. Crescimento micelial e germinação de conídios foram avaliados em meio BDA acrescido dos herbicidas, nas concentrações recomendadas dos produtos comerciais, oxasulfuron (80 g/ha), glifosato (4 L/ha), bentazon (1.5 L/ha), fomesafen (1 L/ha), chlorimuron-ethyl (80 g/ha), lactofen (1 L/ha) e imazetaphyr (1 L/ha) e dos surfatantes Energic (2 ml/L), Aterbane (2,5 ml/L), Silwet L-77Ag (1 ml/L), Herbitensil (2 ml/L) e Natur L'óleo (10 ml/L). Diluições dos herbicidas de 50% e 25% foram avaliadas com um consumo de calda equivalente a 300 L/ha. Os surfatantes foram somente utilizados nas concentrações recomendadas. O crescimento micelial não foi afetado por bentazon e fomesafen e apenas levemente por oxasulfuron. Porém, glifosato, chlorimuron-ethyl, lactofen, Energic, Herbitensil, Silwet, e Aterbane o reduziram drasticamente. A redução observada com imazetaphyr foi intermediária e Natur L' óleo promoveu o crescimento micelial. Na presença dos surfatantes, observou-se que todos permitiram uma porcentagem de germinação equivalente àquela alcançada na presença de água. Energic e Herbitensil causaram um retardamento expressivo. Com Herbitensil, o processo germinativo iniciou somente aos 120 minutos. Com herbicidas, foi observado que somente na presença de glifosato e imazetaphyr a germinação dos conídios não seguiu a tendência observada com água, como ocorreu com os outros produtos testados.

First Description of a Cluster of Acute/Subacute Paracoccidioidomycosis Cases and Its Association with a Climatic Anomaly

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Study of thiabendazole resistance and volatile organic compounds production of Penicillium expansum strains

The years of excessive use of thiabendazole to control Penicillium expansum has induced the development of resistance. Sensitivity of fourty eight strains collected from orchards and packinghouses in Emilia Romagna to pure and commercial TBZ was determined in vitro on TBZ amended medium (400μg/mL). Out of 48 strains, 35 were thiabendazole-sensitive (S) and 13 were thiabendazole-resistant (R). Microtiter assay adapted to P. expansum, showed EC50 values ranging from 54 to 320 μg/mL for ten TBZ-resistant strains. At the highest dose (50 μg/mL), resistant strains growth was not inhibited and the reported MICs value were >1000 μg/mL. Therefore, preliminary screening combined with microtiter assay, can be a good strategy to test susceptibility to TBZ. Mutations in the β-tubulin gene were studied on amino acid sequences from residue 167 to residue 357 of 10 P. expansum strains. Mutation at codon 198 was associated with TBZ-resistance. However, its absence in 3 resistant strains can be explained by the involvement of other mechanisms. Moreover, a P. expansum strain LB8/99 showed good antifungal effect against some fungal pathogens through double petri dish assay. It inhibited both mycelium growth and conidia germination of B. cinerea, C. acutatum, and M. laxa, and reduced significantly by 53% and 18% respectively P. expansum. Three major VOCS: geosmin, phenethyl alcolhol (PEA) and an unknown substance were identified by GC-MS analysis. Consistent fumigation of fungal pathogens with PEA (1230 mg/mL), inhibited both conidia germination and mycelium growth of all pathogens, except conidia germination of P. expansum that was reduced by 90% with respect to control. While, the concentration of PEA produced naturally by LB8/99 was ineffective in controlling the pathogens and seemed to have a synergic or additive effect with the other VOCS. Investigations to study the biofumigant effect of LB8/99 on other commodities like seeds and seedlings are in progress.

DETECTION OF SPORES AND HYPHAE OF ARTWORKS’ BIODETERIOGENIC FILAMENTOUS FUNGI BY RNA-FISH

Filamentous fungi are a threat to the conservation of Cultural Heritage. Thus, detection and identification of viable filamentous fungi are crucial for applying adequate Safeguard measures. RNA-FISH protocols have been previously applied with this aim in Cultural Heritage samples. However, only hyphae detection was reported in the literature, even if spores and conidia are not only a potential risk to Cultural Heritage but can also be harmful for the health of visitors, curators and restorers. Thus, the aim of this work was to evaluate various permeabilizing strategies for their application in the detection of spores/conidia and hyphae of artworks’ biodeteriogenic filamentous fungi by RNA-FISH. Besides of this, the influence of cell aging on the success of the technique and on the development of fungal autofluorescence (that could hamper the RNA-FISH signal detection) were also investigated. Five common biodeteriogenic filamentous fungi species isolated from biodegradated artworks were used as biological model: Aspergillus niger, Cladosporium sp, Fusarium sp, Penicillium sp. and Exophialia sp. Fungal autofluorescence was only detected in cells harvested from Fusarium sp, and Exophialia sp. old cultures, being aging-dependent. However, it was weak enough to allow autofluorescence/RNA-FISH signals distinction. Thus, autofluorescence was not a limitation for the application of RNA-FISH for detection of the taxa investigated. All the permeabilization strategies tested allowed to detect fungal cells from young cultures by RNA-FISH. However, only the combination of paraformaldehyde with Triton X-100 allowed the detection of conidia/spores and hyphae of old filamentous fungi. All the permeabilization strategies failed in the Aspergillus niger conidia/spores staining, which are known to be particularly difficult to permeabilize. But, even in spite of this, the application of this permeabilization method increased the analytical potential of RNA FISH in Cultural Heritage biodeterioration. Whereas much work is required to validate this RNA-FISH approach for its application in real samples from Cultural Heritage it could represent an important advance for the detection, not only of hyphae but also of spores and conidia of various filamentous fungi taxa by RNA-FISH.

Perfil de secreção de citocinas e de ativação de células endoteliais após interação com cepas selvagens e mutantes de Aspergillus fumigatus

Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

Pressão de aplicação com pulverizador de barra e eficiência de bioinseticidas fúngicos comerciais

Bioinseticidas fúngicos são aplicados com pulverizadores convencionais e algumas características destes equipamentos podem não ser adequadas e afetar a eficiência dos bioinseticidas. O objetivo deste trabalho foi verificar se pressões usuais, em aplicações com o pulverizador de barra, podem afetar a ação inseticida de conídios de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae, componentes de produtos comerciais brasileiros. Para isso, suspensões aquosas de três bioinseticidas foram submetidas à passagem pelo equipamento em três pressões (20, 40 e 60 lbf pol-2) e avaliadas quanto ao rompimento, à viabilidade e à virulência dos conídios. Avaliou-se a viabilidade em lâminas de microscopia cobertas com meio de cultura, após incubação a 26±0,5ºC e fotoperíodo de 12 horas. A concentração foi determinada por meio de contagens em câmara de Neubauer e a virulência foi avaliada para lagartas de Diatraea saccharalis. Não foram encontradas, nos três produtos, influências significativas em nenhum dos parâmetros. Nas pressões avaliadas, a aplicação com o pulverizador de barra não reduz a viabilidade e nem a virulência dos conídios dos bioinseticidas testados, tampouco provoca destruição dos conídios.

Estudo in vitro da habilidade predatória de monacrosporium robustum sobre heterodera glycines

O fungo nematófago Monacrosporium robustum foi detectado, isolado e identificado pela primeira vez de solos do Brasil, em maio de 1999, no Laboratório de Nematologia do Departamento de Fitossanidade da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal, São Paulo, tendo sido o potencial como agente de biocontrole do nematóide de cisto da soja, Heterodera glycines raça 3 observado ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) (Maia & Santos, 1999). Na presente pesquisa, detalhes das estruturas de captura, tamanho, forma e septação dos conídios, bem como nematóides capturados pelo fungo foram documentados. Monacrosporium robustum produz micélio hialino, e as estruturas de captura são constituídas por ramificações adesivas, na forma de protuberâncias verticais que surgem das hifas, medindo, em média, 10 µm de comprimento e 5 µm de diâmetro. Uma substância gelatinosa desprende- se dessas estruturas, ao contato com o nematóide, aprisionando-o. Os conídios do fungo são hialinos, fusóides com dois ou quatro septos, às vezes, cinco. Conídios jovens são asseptados e piriformes. Sob condições de laboratório, esse fungo predou 100% dos ovos e dos juvenis de segundo estádio de H. glycines e formas ativas de Panagrellus sp., no período de 72 h da exposição desses nematóides ao fungo.

Controle de nematóides parasitos gastrintestinais por Arthrobotrys musiformis em ovinos naturalmente infestados mantidos em pastagens

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Biologia de Psyllobora confluens alimentada com o fungo Erysiphe cichoracearum

O objetivo deste trabalho foi avaliar os aspectos biológicos de Psyllobora confluens alimentada com o fungo Erysiphe cichoracearum em folhas de quiabeiro. Larvas recém-eclodidas de P. confluens foram individualizadas e alimentadas diariamente com hifas e conídios do fungo, em folhas de quiabeiro, a 23,6±3 e 27,4±2ºC e fotófase de 12 horas. A duração dos estágios imaturos, os aspectos reprodutivos e a longevidade de P. confluens foram avaliados. O período de desenvolvimento de larva a adulto foi 20,5 dias a 23,6ºC e 16,6 dias a 27,4ºC. em ambas as temperaturas, 80% das larvas de P. confluens atingiram a fase adulta. Fêmeas de P. confluens apresentaram período de oviposição de 32,7 dias, com capacidade diária e total de oviposição de 16,8 e 439,9 ovos, respectivamente. A longevidade das fêmeas foi de 46,1 dias e a dos machos 58,7 dias. P. confluens, ao se alimentar do fungo E. cichoracearum em folhas de quiabeiro, completa o ciclo de vida e apresenta elevados padrões de sobrevivência e reprodução.

Efeitos de produtos alternativos no controle de doenças na videira

Pós-graduação em Agronomia - FEIS

Virulência de micro-organismos à Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) e compatibilidade com inseticidas

Pós-graduação em Agronomia (Entomologia Agrícola) - FCAV