烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）两侧对称花的进化发育途径

被子植物菊亚纲原始类群的花为辐射对称花，伴随着适应性进化和传粉者的专性化，两侧对称花随之出现并快速进化和多样化。与花对称性相关的基因首先在模式植物金鱼草中被分离出来，它们包括TCP 基因家族的两个基因Cycloidea（CYC）和Dichotama（DICH），MYB 基因家族的两个基因Radialis（RAD）和Divaricata（DIV）。模式植物金鱼草的分子发育与遗传学研究初步揭示出在花对称性形成过程中相关调控基因的功能、表达模式及其相互作用机制。研究表明，金鱼草花中CYC 和DICH 基因只在背部表达，控制背部属性。DIV基因早期在所有部位表达，但只影响腹部属性。CYC 和DICH 通过激活与DIV具有颉抗作用的RAD 基因在背部的表达来抑制DIV 基因在背部的作用从而构建了金鱼草的两侧对称花。但是，被子植物繁杂多样的花对称性远非一种模式植物所能概括。此外，被子植物花对称性的演化也是一个悬而未决的问题。要全面了解被子植物花对称性的起源、多样化及其背后的决定机制，有必要进一步研究不同类群中花对称性相关基因的功能变化和进化式样。 苦苣苔科（Gesneriaceae）与金鱼草所属的车前科（Plantaginaceae）同属于菊亚纲的广义唇形目。研究表明广义唇形目的祖先已经具有了两侧对称花，苦苣苔科是广义唇形目的基部类群，具有与唇形目两侧对称花早期分化相关的各种两侧对称花类型。因此，在苦苣苔科选择两侧对称花代表类群开展花对称性的进化发育生物学研究十分有助于探讨苦苣苔科花对称性基因在两侧对称花类群的调控进化，从而揭示广义唇形目基部类群花对称性的进化发育模式。我们选择苦苣苔科两侧对称花类群烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）为主要研究材料。烟叶唇柱苣苔是苦苣苔科两侧对称性比较强烈的类群，主要体现在其只有腹部两枚雄蕊能育，背部和侧部雄蕊均败育，与金鱼草的近亲沙漠幽灵花（Mohaveae confertiflora）的形态类似。在沙漠幽灵花中CYC 类基因的表达从背部延伸到了侧部，但是在烟叶唇柱苣苔中是否遵循同一模式还是存在其他途径这是我们的主要研究目的。此外，我们发现在烟叶唇柱苣苔花序的顶花中偶尔会发生腹部化的辐射对称突变花。在金鱼草和柳穿鱼中，CYC 类基因的失活导致了辐射对称突变花的产生，而在豆科植物Cadia purpurea 中，CYC 类基因的活性从背部延伸到了侧部和腹部，导致了辐射对称花的形成。烟叶唇柱苣苔中的情形则值得我们关注。再者，革叶粗筒苣苔（Briggisia mihieri）是烟叶唇柱苣苔的近缘类群，但它具有四枚能育雄蕊（侧部和腹部各两枚）。苦苣苔科两能育雄蕊类群被认为起源于四能育雄蕊类群。我们在烟叶唇柱苣苔野生型两侧对称花和辐射对称突变花中开展花对称性基因的表达模式研究，结合在革叶粗筒苣苔中的研究，试图揭示烟叶唇柱苣苔两雄蕊类两侧对称花形成的分子机制和进化发育途径。 本研究从烟叶唇柱苣苔中分离到4 个CYC 类基因（ChCYC1C，ChCYC1D，ChCYC2A，ChCYC2B），2 个DIV 类基因（ChDIV1，ChDIV2）和2 个RAD 类基因（ChRAD1，ChRAD2）。从革叶粗筒苣苔中分离到4 个CYC 类基因（BmCYC1C，BmCYC1D，BmCYC2A，BmCYC2B），2 个DIV 类基因（BmDIV1，BmDIV2）和1 个RAD 类基因（BmRAD1）。序列和系统发育分析结果显示它们均为花对称性基因。进一步的表达分析显示结果表明：（1）不同拷贝CYC 类基因的表达存在着分化，与其氨基酸序列的分化一致；烟叶唇柱苣苔的CYC 类基因表达从背部延伸到了侧部而革叶粗筒苣苔的CYC 类基因仅在背部表达，与它们的形态分化密切相关。（2）DIV 类基因在种内两个拷贝以及种间的表达无明显的分化，在花的各个部位都有表达。（3）烟叶唇柱苣苔两个拷贝的RAD 类基因的表达存在分化；两个种的同类RAD 类基因的表达也存在分化。这些花对称性基因的表达模式分析揭示了它们在烟叶唇柱苣苔和革叶粗筒苣苔两侧对称花形态建成以及二者花形态的演化中具有重要作用。 同时，我们对烟叶唇柱苣苔的辐射对称突变花进行了自交和F1 代培育，但是F1 代没有出现稳定的辐射对称突变株。我们从辐射对称突变花中分离到的CYC 类、DIV 类和RAD 类基因的核苷酸序列与野生型的完全一致。说明突变体的产生与序列变异无关。RT-PCR 分析表明突变花中CYC 类基因全部失活，而DIV 类基因和在腹部表达的RAD 类基因的表达信号有所增强，这与其腹部化辐射对称的形态相一致。这进一步证实了花对称性基因在烟叶唇柱苣苔花形态建成中的作用。

唇柱苣苔属及其近缘类群（苦苣苔科）的系统发育研究

中国的苦苣苔科－长蒴苣苔族存在两个古老又难以界定的大属：唇柱苣苔属Chirita和长蒴苣苔属Didymocarpus。唇柱苣苔属至少有140种，其中75％以上的种分布在中国南部。尽管Wood和王文采（中国种）已经作出较为全面的修订，但唇柱苣苔属的界定以及属下再划分仍然存在争议。传统分类一直认为唇柱苣苔属非单系类群，尤其与长蒴苣苔属、小花苣苔属、文采苣苔属以及报春苣苔属等近缘属之间的关系难以确定，还需进一步研究。长蒴苣苔属已经被拆分为三个不同的属，其中的狭义长蒴苣苔在我国有20多种。针对以上问题，本文通过大量的标本研究、野外考察以及分子系统学研究，得出了一些初步的结果。 形态学 通过大量的标本观察及野外考察，发现唇柱苣苔属及其近缘类群营养性状变异非常复杂。然而，营养体变异受环境饰变大，不适合作为划分组和属等较高级分类单元的主要依据，是区分近缘种的主要分类依据。在生殖器官中，一些性状，如子房和蒴果形状和大小，在唇柱苣苔属和其近缘属中存在大量的过渡类型，不宜将单独或2－3个性状作为主要分类依据。同时笔者发现两个新种，即长萼唇柱苣苔（C. longicalyx J. M. Li & Y. Z. Wang）和匍匐唇柱苣苔（C. prostrata J. M. Li & Y. Z. Wang）。匍匐唇柱苣苔属于钩序唇柱苣苔组，系多年生植物，致使我们国家分布的钩序唇柱苣苔组扩大为两种。它的特殊习性以及极其有限的分布区表明，它是一个在不利的生境下偶尔幸存的残遗种。 2．分子系统学 首先通过对两个DNA片段ITS和trnL-F数据以及它们的联合数据进行最简约分析和贝叶斯分析，并结合形态特征演化来研究唇柱苣苔属唇柱苣苔组和小花苣苔属系统发育关系。结果表明，小花苣苔属和唇柱苣苔组（唇柱苣苔属）Chirita sect. Gibbosaccus构成一个单系群，强烈支持小花苣苔属归并到唇柱苣苔组（唇柱苣苔属）中，而且二者形态性状极其相似。上述事实说明唇柱苣苔组（唇柱苣苔属）和小花苣苔属具有很近的亲缘关系，而与麻叶唇柱苣苔组Chirita sect. Chirita关系较远。研究一些关键地区植物的物种形成，将提高对这些地区植物区系发生与发展的认识，喀斯特地区就是这样一个非常独特与关键的地区。特产于这种干湿交替、温度变化显著的特殊生境里的的类群，如唇柱苣苔组和小花苣苔属，存在着非常近的系统发育关系。最后笔者建议把小花苣苔属置于唇柱苣苔属唇柱苣苔组里，而不是将该属单立出来。 在上述研究基础上，本研究进一步选择唇柱苣苔属的其他近缘属，通过对两个DNA片段ITS和trnL-F数据以及联合数据进行最简约分析，旨在揭示在唇柱苣苔属内的系统发育及其和周边近缘属系统发育关系。该研究结果表明狭义长蒴苣苔属、朱红苣苔属、报春苣苔属、文采苣苔属以及小花苣苔属都置入唇柱苣苔属内。其中，报春苣苔属、文采苣苔属以及小花苣苔属和唇柱苣苔组具有相似的柱头，在系统树上，也构成一个单系分支。虽然许多学者认为柱头形状是很重要的分类性状，也是唯一用来界定唇柱苣苔属的，但是非常不可靠的，因而唇柱苣苔属至少分成两个属。 文采苣苔属和小花苣苔属无论从分子上还是从形态上都得不到证明是单系类群，应该归并到唇柱苣苔属中;而报春苣苔属很可能是最近从唇柱苣苔组里分化出来的类群。 东南长蒴苣苔和朱红苣苔属植物形态十分相似，除了营养体差别不大外，他们还具伸出花筒外的柱头和小而尖的花冠裂片等共同特征，分子树上也组成一个单系，为东南长蒴苣苔归并到朱红苣苔属提供了强有力的分子证据。 在狭义长蒴苣苔属Didymocarpus s. str.两个组中，Didymocarpus sect. Elati的一个种D. citrinus与长蒴苣苔组Didymocarpus sect. Didymocarpus构成姐妹群关系。二组植物构成一个单系分支又与圆唇苣苔属Gyrocheilos构成姐妹群关系。因此，虽然我们的数据支持圆唇苣苔属与长蒴苣苔属近缘，但是不支持圆唇苣苔属作为一个亚组放在长蒴苣苔里。

苦苣苔科比较胚胎学和花粉形态学研究及其系统学意义

本文对苦苣苔科的3族8属10种植物进行了比较胚胎学研究，得出该科植物的基本胚胎学特征是： 花药具4个小孢子囊，当花药达到成熟期时，每—侧的两个小孢子囊由于隔壁的消失而连通。药壁由1层表皮，1层药室内壁，12层中层和1层绒毡层组成。花药壁的发育属双子叶类型，表皮细胞宿存，药室内壁在小孢子母细胞分裂成四分体后即开始纤维状加厚，到花药发育至成熟时期，药室内壁径向延长并由内切向壁向外和向上发生带状的加厚，但在同侧的两个小孢子囊的连接处并不发生纤维状加厚，以利于花药的开裂。中层细胞在小孢子母细胞分裂前即受到挤压，到发育后期被挤扁，．在成熟花药壁上只残留—些痕迹。有些种类中层细胞不退化，与药室内壁一样纤维状加厚。绒毡层初时为单核，在小孢子母细胞终变期分裂成双核，而当单核小孢子形成后，绒毡层细胞的两核可融合成单核，随后便解体。绒毡层为分泌型，在四分体分离成小孢子以后向药室内分泌乌氏体。在小孢子母细胞分裂前，细胞周围有大量的胼胝质出现。胞质纷裂为同时型。具四面体型的四分体。散粉时花粉具二细胞。 胚珠倒生，单珠被，薄珠心，珠被内无维管组织。珠心表皮下的—层细胞发育成为孢原细胞并直接起大孢子母细胞的功能，其胞质分裂伴随着减数分裂形成—直列式四分体。四分体珠孔端三个大孢子受挤压退化，合点端的功能大孢子进—步发育，经三次分裂形成蓼型胚囊。成熟胚囊的珠孔端部分圆形，合点端细长，如容量瓶状。胚囊内具—个由两个助细胞和—个卵细胞组成的卵器、两个极核和三个反足细胞。助细胞在花粉管通过珠孔进入胚囊后退化。极核在受精前不久融合，反足细胞形成后不久便退化。珠孔端的珠心细胞在功能大孢子发育后被挤压退化，也有的种类突出珠孔形成珠心喙，而合点端部分珠被最内的—层细胞则进—步发育，细胞质变浓，核体积增大，围绕胚囊的合点端细长部形成珠被绒毡层，此结构由胚囊形成到种子成熟—直存在，其中有丰富的内含物。 珠孔受精。胚乳发育为细胞型，种子成熟时几乎完全被胚吸收。合点端发育出具2核单胞的侵入性吸器，直达表皮。珠孔端吸器具2细胞。两种吸器的形态因种属不同而有很大差异。胚胎发生属柳叶菜型。 比较和分析表明，苦苣苔科的胚胎学特征与玄参科（Scrophujariaccae)、列当科（Orobanchaceae）和爵床科(Acanthaceae)较为相似，反映出这几个科在系统关系上比较接近。苦苣苔科族级分类群之间的胚胎学特征有一定的差异，但族内各属种的胚胎学特征差异较小，发育类型尤其是早期的形成过程非常相似。本文研究涉及的分类群在花药壁层的结构、反足细胞退化和极核融合韵时期、胚形成与胚乳发育的相对时间、吸器的有无及其形态等方面有所不同。 本文同时对苦苣苔科3族23属72种花粉，其中包括长蒴苣苔族(Trib. Didymocarpeae)16属56种、芒毛苣苔族(Trib. Trichosporeae)4属12种及尖舌苣苔族( Trib. Klugieae)3属4种，进行了扫描电镜观察。对族下各属种的形态特征作了详细的描述，每种花粉从极面观、赤道面观及局部放大三个侧面照相记录。以族为基本类群,对其中的各属的花粉形态结合系统学特征进行了讨论。 由此研究得出苦苣苔科植物花粉的基本特征是：所有研究属种的花粉均具三拟孔沟，拟孔极不明显。形状为近扁球形、圆球形、近长球形和长球形，极面观圆形、近圆形、近三角形和三裂圆形，赤道面观为圆形、近圆形、椭圆形和长圆形，不同材料各有差异，但在属内水平上基本—致。各属植物在花粉沟的形态和表面纹饰上有一定的区别。 在长蒴苣苔族中，本文对雇柱苣苔属(Chirita Buch．-Ham．ex D．Don)花粉进行了着重研究。结果表明：唇柱苣苔属在组内各种的花粉形态具有明显的相似性，但在组之间则有较大的差异。对本族其它各属的研究结果则充分表明各属花粉的形态特征有明显差别，可以从花粉形状、大小、沟的构造、沟膜的特点及表面纹饰等方面加以区分 在芒毛苣苔族中，紫花苣苔(Loxostigma griffithii)花粉沟膜表面残留着网状的覆盖层( tectum)，这种覆盖层可能代表—种较原始的性状。．在芒毛苣苔属’( Aeschynanthu8)中，花冠的檐部通常呈现不明显二唇形的显苞芒毛苣苔组(Sect．Haplotrichum)和大花芒毛苣苔组(Sect. Diplotrichum)的花粉粒较小，而花冠的檐部明显二属形的黄杨叶芒毛苣苔组(Sect. hlicrotrichium)、小齿芒毛苣苔组(Sect. Xanthanthos)以及全尊芒毛苣苔组(Sect．Aeschynanthus)的花粉粒较大。因此，花冠檐部的结构与花粉粒的大小表现出—定的相关性．在尖舌苣苔族中，异叶苣苔属( Whytokia)和尖舌苣苔属(Rhynchoglossum)的花粉沟较短，后者和十字苣苔属( Stauranthera)的沟膜表面具有密集或稀疏的颗粒状突起。河口异叶苣苔( Whytokia hekouensis)花粉沟的分化不明显，其沟膜上残留着网状的覆盖层可能代表着—种较原始的性状。具聚伞花序的盾座苣苔属( Epithema)和圆果苣苔属( Gyrogyne)，其花粉沟界极区及其沟间区呈皱波状(apocolpia and mesocolpia rugulate)，代表另一种演化方向。根据本文研究结果，并参考国内外有关报道，分别提出了芒毛苣苔族和尖舌苣苔族的以花粉特征为依据的分属检索表。

牛耳草Bose hygrometrica 离体叶脱水-复水过程的光合作用及基因表达

本文以复苏植物牛耳草Boea hygrometrica成熟植株的离体叶片为试材，对比非复苏植物烟叶唇苣苔Chirita heterotricha, 以光合作用在脱水－复水过程中的变化为切入点，从生理水平上探讨其脱水保护位点：应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其脱水保护机制。 光合放氧速率、快速荧光诱导动力学、慢速荧光诱导动力学、荧光发射光谱、荧光激发谱的结果表明，相对于烟叶唇柱苣苔，脱水对牛耳草净光合速率、PS II和PS I光化学活性、电子传递、光合磷酸化及CO_2固定的影响有一个共同的特点，即脱水时迅速降低，复水后恢复能力强。通过非变性绿胶的研究牛耳草叶片类囊体膜叶绿素－蛋白复合体在脱水－复水过程中保持高度稳定。色素含量分析表明牛耳草的叶绿素含量在脱水－复水过程中也相对稳定。这些特征可能是牛耳草叶片光合作用脱水保护机制的一部分。 SDS－PAGE和IEF电泳结果表明，牛耳草脱水复苏过程中蛋白质表达有差异，或增或减，并分别发现了一条（SDS－PAGE）和两条（IEF）在脱水过程中特异出现的蛋白质。 本文以银染法代替放射自显影用于mRNA差异显示，不但简化了实验步骤，缩短了实验周期，而且在不降低灵敏度的前提下避免了放射性危害，降低了实验成本。本文证明了mRNA差异银染显示法用于复苏植物牛耳草脱水－复水过程中基因表达变化的研究是可行的。 mRNA差异银染显示法揭示牛耳草耐脱水复苏机制涉及到基因表达的调控。脱水－复水过程中差异表达的基因有6种，其中脱水特异诱导表达的13个cDNA所相应的基因、脱水上调节的15个cDNA所相应的基因可能参与牛耳草叶片脱水保护机制，复水特异诱导的8个cDNA的所相应基因可能参与牛耳草复水后的修复机制。2个脱水特异诱导表达的cDNA片段进行了克隆和测序。

苦苣苔科植物的组织培养和离体保存

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物种类繁多, 全世界约150属3700余种,我国有58属470余种，大部分具有极高的观赏价值，许多是传统的民间草药。虽然我国苦苣苔科植物资源丰富，然而很多种类分布区域狭窄，种群数量稀少，加之生境受到破坏，许多已经面临灭绝的危险。本研究拟通过组织培养、玻璃化超低温保存以及快速繁殖，达到保护和扩繁珍稀濒危苦苣苔科植物的目的。 以药用唇柱苣苔（Chirita medica D. Fang ex W. T. Wang）和粉绿异裂苣苔（Pseudochirita guangxiensis W.T.Wang var. glauca Y. G. Wei et Y. Liu）为材料，取幼嫩叶片为外植体，通过组织培养实验得到最佳诱导不定芽培养基：MS培养基附加30 g l-1蔗糖，7.5 g l-1琼脂，药用唇柱苣苔附加0.10 mg l-1 BA ，0.10 mg l-1 NAA，粉绿异裂苣苔附加0.05 mg l-1IAA，1.00 mg l-1BA。最高不定芽诱导率分别为：90.3%和85.0%。最佳生根培养基：1/2MS培养基附加30 g l-1蔗糖，5 g l-1活性炭，7 g l-1琼脂，生根率为100%，诱导产生6.11条根，根长为18.8mm（药用唇柱苣苔）；1/2MS培养基附加10-20g l-1蔗糖，1 g l-1活性炭，7 g l-1琼脂，诱导生成6.8-7.4条根，均长17.7-22.0mm（粉绿异裂苣苔）。 在组织培养的基础上进行了苦苣苔科植物的玻璃化超低温冷冻保存研究。以烟叶唇柱苣苔（C. heterotricha Merr.）和濒危植物药用唇柱苣苔叶片外植体为材料，经过自然干燥、装载液处理、玻璃化溶液处理、液氮冷冻保存，成功实现了玻璃化超低温冷冻保存，经过液氮冷冻保存后的材料可以继续分化、生长。适当时间的玻璃化试剂处理对于材料无致死作用，不经液氮冷冻，可以达到100%存活。-20 oC 、-40 oC、液氮保存后，存活率随温度下降而下降，表明冷冻致死的原因在于冰晶形成；提高冷冻后成活率的关键是控制干燥脱水，经过适当的自然干燥，材料存活率分别达到50.0%和27.8%。 以叶片为外植体材料，通过组织培养和快速繁殖可以大规模扩繁苦苣苔科植物。主要步骤为：外植体叶片消毒→不定芽诱导培养→生根诱导培养→继代保存或炼苗移栽，经过3-4个月时间可获得大量栽培植株。已成功保存并培养了40余种苦苣苔科植物，包括濒危苦苣苔及高观赏价值苦苣苔。

Thioureides of 2-(phenoxymethyl)benzoic acid 4-R substituted: a novel class of anti-parasitic compounds

Fifty members of a novel class of antimicrobial compounds, 2-(4-R-phenoxymethyl)benzoic acid thioureides, were synthesized and characterized with respect to their activities against three parasites of human relevance, namely the protozoa Giardia lamblia and Toxoplasma gondii, and the larval (metacestode) stage of the tapeworm Echinococcus multilocularis. To determine the selective toxicity of these compounds, the human colon cancer cell line Caco2 and primary cultures of human foreskin fibroblasts (HFF) were also investigated. The new thioureides were obtained in a three-step-reaction process and subsequently characterized by their physical constants (melting point, solubility). The chemical structures were elucidated by (1)H NMR, (13)C NMR, IR spectral methods and elemental analysis. The analyses confirmed the final and intermediate compound structures and the synthesis. The compounds were then tested on the parasites in vitro. All thioureides, except two compounds with a nitro group, were totally ineffective against Giardia lamblia. 23 compounds inhibited the proliferation of T. gondii, three of them with an IC(50) of approximately 1 microM. The structural integrity of E. multilocularis metacestodes was affected by 22 compounds. In contrast, HFF were not susceptible to any of these thioureides, while Caco2 cells were affected by 17 compounds, two of them inhibiting proliferation with an IC(50) in the micromolar range. Thioureides may thus present a promising class of anti-infective agents.